CN110922465B - 一种制备酪蛋白钙肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物活性肽技术领域，特别涉及一种制备酪蛋白钙肽的方法，该方法将均质处理和复合酶A、复合酶B、复合酶C相结合，采用三步酶解法制备得到CCP，CCP得率的计算结果表明，采用本发明方法制备得到的CCP，得率为常规方法的两倍多；CCP的理化性质测定结果表明，与常规方法相比，采用本发明方法制备得到的CCP，N/P摩尔比更小，纯度更高，乳糖含量大幅度降低；苦味值的测定结果表明，与常规方法相比，采用本发明方法制备得到的CCP脱苦效果明显，口感好。可见，本发明不仅提高了酪蛋白钙肽的得率，而且所制备得到的酪蛋白钙肽N/P摩尔比低，味苦小，不容易变黏，质量得到了大大的改善。

Description

一种制备酪蛋白钙肽的方法
技术领域
本发明涉及生物活性肽技术领域，特别涉及一种制备酪蛋白钙肽的方法。
背景技术
我国是钙摄入量严重缺乏的国家之一，寻找有效的补钙途径已成为当前重大的攻关领域。传统钙剂如葡萄糖酸钙、乳酸钙等，服用时需加维生素D，且钙吸收率不高，补钙效果欠佳。为了满足机体对钙的需要，除了食用富含钙的食物外，提高钙的吸收率是最有效的补钙措施。
来自牛乳酪蛋白的酪蛋白钙肽(Casein Calcium Pep-tide.CCP)是含有磷酸丝氨酸残基生物活性多肽，其中含有酪蛋白磷酸钙约占12.5％。CCP具有促进钙、铁等矿物质吸收的效果。 CCP和富含钙、铁等矿物质的食品配合使用，有助于矿物质的吸收。因此在保健食品、功能性食品和医药方面等将发挥着重要的作用。
CCP与酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphopeptides，CPP)一样，皆为含磷酸丝氨酸残基的多肽，与CPP相比，CCP在增加钙、铁等离子吸收方面与优质的CPP相当，但由于CCP分子量非常小，相比CPP就更易在水中溶解，且CCP在热稳定性方面性质明显要好于CPP， CCP的肽链相比短很多，也有利其氨基酸的吸收，因而更具有开发潜力。
由于CCP和CPP皆为含磷酸丝氨酸残基的多肽，而食品中CPP的研究相对CCP相对成熟，因此严格的CCP定性或定量的测定可参考测定。与CPP类似，CCP的生物活性由其分子中的氨基酸组成与排序或磷酸根的分布所决定，N/P摩尔比可反映CCP的纯度和磷酸根密度，随氮磷摩尔比降低，CCP阻止磷酸钙沉淀形成的最低有效浓度下降。也就是说CCP的 N/P越小，则CCP制品的纯度越高或磷酸基密度越大，即CCP制品中相对分子质量较小部分占的比例较大，结合钙的能力也较强。
但是目前生产CCP的方法由于特异性较差，分离得到的CCP质量较差，如纯度低，N/P 摩尔比较大，味苦、异味重，长时间存放容易变黏、稳定性差等。由于CCP纯度低，N/P摩尔比较大，会影响其在体内或体外阻止磷酸钙沉淀的效果；CCP长时间存放容易变黏会影响其保质期；CCP味苦、异味重会影响其口感效果。因此，有必要对CCP的制备方法进行探究，以提高其制备质量，改善其使用效果。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种制备酪蛋白钙肽的方法，不仅提高了酪蛋白钙肽的得率，而且所制备得到的酪蛋白钙肽N/P摩尔比低，味苦小，不容易变黏，质量得到了大大的改善。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种制备酪蛋白钙肽的方法，包括以下步骤：
S1、往乳源酪蛋白(如牛乳酪蛋白、羊乳酪蛋白等)中添加水，搅拌混合成乳源酪蛋白浆液，控制水的添加量使乳源酪蛋白的底物浓度为10％～20％；
S2、采用高压均质机等设备对步骤S1中的乳源酪蛋白浆液均质处理1～2h；
S3、往步骤S2的乳源酪蛋白浆液中添加复合酶A，搅拌混匀，所述复合酶A由碱性蛋白酶和胰蛋白酶组成，所述复合酶A的添加量为乳源酪蛋白的1％～3％，调节pH为7.5～8.5，置于45～55℃下反应1～2h，反应后进行灭酶处理；
S4、采用高压均质机等设备对步骤S1中的乳源酪蛋白浆液均质处理15～30min；
S5、往步骤S4中添加复合酶B，搅拌混匀，所述复合酶B由中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶组成，所述复合酶B的添加量为乳源酪蛋白的0.4％～1％，调节pH为6.8～7.2，置于45～55℃下反应20～60min，反应后进行灭酶处理；
S6、采用高压均质机等设备对步骤S1中的乳源酪蛋白浆液均质处理10～15min；
S7、往步骤S6中添加复合酶C，搅拌混匀，所述复合酶C由复合风味蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、乳糖酶、氨肽酶和羧肽酶组成，所述复合酶C的添加量为乳源酪蛋白的0.2％～0.8％，调节pH为6.0～7.0，置于45～55℃下反应20～40min，反应后进行灭酶处理；
S8、将步骤S7中经酶解后得到的酶解液冷却至室温，将其pH调节至5-7，用超滤膜处理后，收集滤液；
S9、对滤液进行浓缩、干燥处理(如冷冻干燥、喷雾干燥等)，收集沉淀物，沉淀物经粉粹处理后制得粉末状的酪蛋白钙肽。
优选的，步骤S1中所述的底物浓度为13％～17％。
优选的，步骤S2中所述的均质处理的条件为：80～90℃、10～30MPa均质处理1～2h；步骤S4中所述的均质处理的条件为：50～60℃、8～12MPa均质处理15～30min；步骤S6中所述的均质处理的条件为：50～60℃、8～12MPa均质处理10～15min。
优选的，所述复合酶A由碱性蛋白酶和胰蛋白酶按1.5～2：1的重量比复配而成。
优选的，所述复合酶B由中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶按2：1.5：1：1的重量比复配而成。
优选的，所述复合酶C由复合风味蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、乳糖酶、氨肽酶和羧肽酶按2：1.5：1.2：1：1的重量比复配而成。
优选的，步骤S3、S5、S7中所述的灭酶处理为80～100℃下灭活15-30min。
优选的，所述超滤膜为聚砜超滤膜，所述超滤膜的膜分子量孔径为1000～10000道尔顿，所述超滤膜的进膜工作压力为0.30～0.50MPa，出膜工作压力为0.08～0.20MPa；所述超滤膜的工作温度为30℃～40℃。
优选的，步骤S9中所述的粉粹处理为70～90目筛粉粹处理。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
CCP的质量受多种因素的影响，如酶的种类、酶浓度、底物浓度、酶解条件等。酶解效果不佳，特异性不强，不仅会导致CCP的得率降低，而且会影响其纯度。CCP纯度低，N/P 摩尔比较大，其在体内或体外阻止磷酸钙沉淀的作用就较小，使用效果较差；CCP中的乳糖成分含量较高，会由于乳糖的吸水性而导致其长时间存放容易变黏，影响保质期；CCP酶解液中含有较多的疏水性氨基酸(即苦味肽)会导致CCP味苦、异味重，影响其口感。因此，选用合适的制备方法对CCP的质量至关重要。
为此，本发明提出一种制备酪蛋白钙肽的方法，该方法将均质处理和复合酶A、复合酶 B、复合酶C相结合，采用三步酶解法制备得到高质量的CCP，同时也提高了CCP的得率。CCP得率的计算结果表明，采用本发明方法制备得到的CCP，得率为常规方法的两倍多；同时，本发明的复合酶A、复合酶B和复合酶C采用三步酶解法比一步酶解法和两步酶解法效果更佳，CCP的得率更高，并且每一步酶解前先进行均质化处理，也可以在一定程度上提高CCP的得率。CCP的理化性质测定结果表明，与常规方法相比，采用本发明方法制备得到的CCP，N/P摩尔比更小，纯度更高，同时，本发明的复合酶A、复合酶B和复合酶C采用三步酶解法比一步酶解法和两步酶解法效果更佳，N/P摩尔比更低；并且每一步酶解前先进行均质化处理，并结合本发明的酶解方法，可以有效降低CCP的N/P摩尔比。CCP的理化性质测定结果还表明，与常规方法相比，采用本发明方法制备得到的CCP，乳糖含量大幅度降低，同时，每一步酶解前先进行均质化处理，并结合本发明的酶解方法，可以更有效的降低乳糖含量，但在本发明的复合酶A、复合酶B、复合酶C，以及均质化处理的基础上，采用三步酶解法、一步酶解法和两步酶解法对乳糖含量的影响不大，均能使其含量得到有效的降低。苦味值的测定结果表明，与常规方法相比，采用本发明方法制备得到的CCP脱苦效果明显，只有非常轻微的苦味，口感好；同时，本发明的复合酶A、复合酶B和复合酶C采用三步酶解法比一步酶解法和两步酶解法脱苦效果更佳。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明实施例和对比例中的牛乳酪蛋白为自制得到，制备牛乳酪蛋白的牛乳为购买自广州风行牛奶有限公司的灭菌牛乳，具体制备方法如下：
取100mL乳品在4℃条件下以4000r/min的转速离心30min，脱脂，弃上层脂肪，取下层蛋白溶液，调等电点至pH4.6，以4000r/min的转速离心10min，沉淀酪蛋白，之后分别用蒸馏水、冷丙酮各清洗3次，每次在4℃条件下以4000r/min的转速离心10min，弃上层溶液，得酪蛋白沉淀.放于自然条件下干燥后，保存于－20℃冰箱中备用。
实施例1
实施例1提供一种制备酪蛋白钙肽的方法，包括以下步骤：
S1、取10g牛乳酪蛋白，往其中添加水，搅拌混合成牛乳酪蛋白浆液，控制水的添加量使牛乳酪蛋白的底物浓度为15％；
S2、将步骤S1中的牛乳酪蛋白浆液转移到高压均质机中，85℃、20MPa均质处理1.5h；
S3、往步骤S2的牛乳酪蛋白浆液中添加复合酶A，搅拌混匀，所述复合酶A由碱性蛋白酶和胰蛋白酶按1.8：1的重量比复配而成，所述复合酶A的添加量为牛乳酪蛋白的2％，调节pH为8.0，置于50℃下反应1.5h，反应后置于90℃下灭活23min；
S4、将步骤S3经酶解后得到的酶解液转移到高压均质机中，55℃、10MPa均质处理23min；
S5、往步骤S4中添加复合酶B，搅拌混匀，所述复合酶B由中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶按2：1.5：1：1的重量比复配而成，所述复合酶B的添加量为牛乳酪蛋白的0.7％，调节pH为7.0，置于50℃下反应40min，反应后置于90℃下灭活23min；
S6、将步骤S5经酶解后得到的酶解液转移到高压均质机中，55℃、10MPa均质处理12.5min；
S7、往步骤S6中添加复合酶C，搅拌混匀，所述复合酶C由复合风味蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、乳糖酶、氨肽酶和羧肽酶按2：1.5：1.2：1：1的重量比复配而成，所述复合酶C 的添加量为牛乳酪蛋白的0.5％，调节pH为6.5，置于50℃下反应30min，反应后置于90℃下灭活23min；
S8、将步骤S7中经酶解后得到的酶解液冷却至室温，将其pH调节至6，用超滤膜处理后，收集滤液，所述超滤膜为聚砜超滤膜，所述超滤膜的膜分子量孔径为5000道尔顿，所述超滤膜的进膜工作压力为0.40MPa，出膜工作压力为0.13MPa；所述超滤膜的工作温度为35℃；
S9、对滤液进行浓缩、冷冻干燥或者喷雾干燥处理，收集沉淀物，沉淀物经80目筛粉粹处理后制得1.51g粉末状的酪蛋白钙肽。
实施例2
实施例2提供一种制备酪蛋白钙肽的方法，包括以下步骤：
S1、取10g牛乳酪蛋白，往其中添加水，搅拌混合成牛乳酪蛋白浆液，控制水的添加量使牛乳酪蛋白的底物浓度为10％；
S2、将步骤S1中的牛乳酪蛋白浆液转移到高压均质机中，80℃、10MPa均质处理1h；
S3、往步骤S2的牛乳酪蛋白浆液中添加复合酶A，搅拌混匀，所述复合酶A由碱性蛋白酶和胰蛋白酶按1.8：1的重量比复配而成，所述复合酶A的添加量为牛乳酪蛋白的1％，调节pH为7.5，置于45℃下反应2h，反应后置于80℃下灭活30min；
S4、将步骤S3经酶解后得到的酶解液转移到高压均质机中，50℃、12MPa均质处理30min；
S5、往步骤S4中添加复合酶B，搅拌混匀，所述复合酶B由中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶按2：1.5：1：1的重量比复配而成，所述复合酶B的添加量为牛乳酪蛋白的0.4％，调节pH为6.8，置于45℃下反应60min，反应后置于80℃下灭活30min；
S6、将步骤S5经酶解后得到的酶解液转移到高压均质机中，50℃、12MPa均质处理15min；
S7、往步骤S6中添加复合酶C，搅拌混匀，所述复合酶C由复合风味蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、乳糖酶、氨肽酶和羧肽酶按2：1.5：1.2：1：1的重量比复配而成，所述复合酶C 的添加量为牛乳酪蛋白的0.2％，调节pH为6.0，置于45℃下反应40min，反应后置于80℃下灭活30min；
S8、将步骤S7中经酶解后得到的酶解液冷却至室温，将其pH调节至5，用超滤膜处理后，收集滤液，所述超滤膜为聚砜超滤膜，所述超滤膜的膜分子量孔径为1000道尔顿，所述超滤膜的进膜工作压力为0.30MPa，出膜工作压力为0.08MPa；所述超滤膜的工作温度为30℃；
S9、对滤液进行浓缩、冷冻干燥或者喷雾干燥处理，收集沉淀物，沉淀物经70目筛粉粹处理后制得1.45g粉末状的酪蛋白钙肽。
实施例3
实施例3提供一种制备酪蛋白钙肽的方法，包括以下步骤：
S1、取10g牛乳酪蛋白，往其中添加水，搅拌混合成牛乳酪蛋白浆液，控制水的添加量使牛乳酪蛋白的底物浓度为20％；
S2、将步骤S1中的牛乳酪蛋白浆液转移到高压均质机中，90℃、30MPa均质处理2h；
S3、往步骤S2的牛乳酪蛋白浆液中添加复合酶A，搅拌混匀，所述复合酶A由碱性蛋白酶和胰蛋白酶按1.8：1的重量比复配而成，所述复合酶A的添加量为牛乳酪蛋白的3％，调节pH为8.5，置于55℃下反应1h，反应后置于100℃下灭活15min；
S4、将步骤S3经酶解后得到的酶解液转移到高压均质机中，60℃、8MPa均质处理15min；
S5、往步骤S4中添加复合酶B，搅拌混匀，所述复合酶B由中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶按2：1.5：1：1的重量比复配而成，所述复合酶B的添加量为牛乳酪蛋白的1％，调节pH为7.2，置于55℃下反应20min，反应后置于100℃下灭活15min；
S6、将步骤S5经酶解后得到的酶解液转移到高压均质机中，50℃、8MPa均质处理10min；
S7、往步骤S6中添加复合酶C，搅拌混匀，所述复合酶C由复合风味蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、乳糖酶、氨肽酶和羧肽酶按2：1.5：1.2：1：1的重量比复配而成，所述复合酶C 的添加量为牛乳酪蛋白的0.8％，调节pH为7.0，置于55℃下反应20min，反应后置于100℃下灭活15min；
S8、将步骤S7中经酶解后得到的酶解液冷却至室温，将其pH调节至7，用超滤膜处理后，收集滤液，所述超滤膜为聚砜超滤膜，所述超滤膜的膜分子量孔径为10000道尔顿，所述超滤膜的进膜工作压力为0.50MPa，出膜工作压力为0.20MPa；所述超滤膜的工作温度为40℃；
S9、对滤液进行浓缩、冷冻干燥或者喷雾干燥处理，收集沉淀物，沉淀物经90目筛粉粹处理后制得1.41g粉末状的酪蛋白钙肽。
对比例1
实施例1提供一种制备酪蛋白钙肽的方法，包括以下步骤：
S1、取10g牛乳酪蛋白，往其中添加水，搅拌混合成牛乳酪蛋白浆液，控制水的添加量使牛乳酪蛋白的底物浓度为15％；
S2、往步骤S1的牛乳酪蛋白浆液中添加复合酶A，搅拌混匀，所述复合酶A由碱性蛋白酶和胰蛋白酶按1.8：1的重量比复配而成，所述复合酶A的添加量为牛乳酪蛋白的2％，调节pH为8.0，置于50℃下反应1.5h，反应后置于90℃下灭活23min；
S3、往步骤S2中添加复合酶B，搅拌混匀，所述复合酶B由中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶按2：1.5：1：1的重量比复配而成，所述复合酶B的添加量为牛乳酪蛋白的0.7％，调节pH为7.0，置于50℃下反应40min，反应后置于90℃下灭活23min；
S4、往步骤S3中添加复合酶C，搅拌混匀，所述复合酶C由复合风味蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、乳糖酶、氨肽酶和羧肽酶按2：1.5：1.2：1：1的重量比复配而成，所述复合酶C 的添加量为牛乳酪蛋白的0.5％，调节pH为6.5，置于50℃下反应30min，反应后置于90℃下灭活23min；
S5、将步骤S4中经酶解后得到的酶解液冷却至室温，将其pH调节至6，用超滤膜处理后，收集滤液，所述超滤膜为聚砜超滤膜，所述超滤膜的膜分子量孔径为5000道尔顿，所述超滤膜的进膜工作压力为0.40MPa，出膜工作压力为0.13MPa；所述超滤膜的工作温度为35℃；
S6、对滤液进行浓缩、冷冻干燥或者喷雾干燥处理，收集沉淀物，沉淀物经80目筛粉粹处理后制得1.29g粉末状的酪蛋白钙肽。
对比例1与实施例1相比，缺乏均质处理步骤。
对比例2
对比例2提供一种制备酪蛋白钙肽的方法，包括以下步骤：
S1、取10g牛乳酪蛋白，往其中添加水，搅拌混合成牛乳酪蛋白浆液，控制水的添加量使牛乳酪蛋白的底物浓度为15％；
S2、将步骤S1中的牛乳酪蛋白浆液转移到高压均质机中，85℃、20MPa均质处理1.5h；
S3、往步骤S2的牛乳酪蛋白浆液中添加复合酶A，复合酶B和复合酶C，搅拌混匀，所述复合酶A由碱性蛋白酶和胰蛋白酶按1.8：1的重量比复配而成，所述复合酶B由中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶按2：1.5：1：1的重量比复配而成，所述复合酶C由复合风味蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、乳糖酶、氨肽酶和羧肽酶按2：1.5：1.2：1：1 的重量比复配而成，所述复合酶A的添加量为牛乳酪蛋白的2％，所述复合酶B的添加量为牛乳酪蛋白的0.7％，所述复合酶C的添加量为牛乳酪蛋白的0.5％，调节pH为8.0，置于50℃下反应1.5h，反应后置于90℃下灭活23min；
S4、将步骤S3中经酶解后得到的酶解液冷却至室温，将其pH调节至6，用超滤膜处理后，收集滤液，所述超滤膜为聚砜超滤膜，所述超滤膜的膜分子量孔径为5000道尔顿，所述超滤膜的进膜工作压力为0.40MPa，出膜工作压力为0.13MPa；所述超滤膜的工作温度为35℃；
S5、对滤液进行浓缩、冷冻干燥或者喷雾干燥处理，收集沉淀物，沉淀物经80目筛粉粹处理后制得0.88g粉末状的酪蛋白钙肽。
对比例2与实施例1相比，采用的是一步酶解法，即将复合酶A，复合酶B和复合酶C同时添加到牛乳酪蛋白浆液中，并按实施例1的步骤S1、S2、S3、S8、S9进行一步酶解反应，反应条件相同。
对比例3
对比例3提供一种制备酪蛋白钙肽的方法，包括以下步骤：
S1、取10g牛乳酪蛋白，往其中添加水，搅拌混合成牛乳酪蛋白浆液，控制水的添加量使牛乳酪蛋白的底物浓度为15％；
S2、将步骤S1中的牛乳酪蛋白浆液转移到高压均质机中，85℃、20MPa均质处理1.5h；
S3、往步骤S2的牛乳酪蛋白浆液中添加复合酶A和复合酶B，搅拌混匀，所述复合酶A 由碱性蛋白酶和胰蛋白酶按1.8：1的重量比复配而成，所述复合酶B由中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶按2：1.5：1：1的重量比复配而成，所述复合酶A的添加量为牛乳酪蛋白的2％，所述复合酶B的添加量为牛乳酪蛋白的0.7％，调节pH为8.0，置于50℃下反应1.5h，反应后置于90℃下灭活23min；
S4、将步骤S3经酶解后得到的酶解液转移到高压均质机中，55℃、10MPa均质处理12.5min；
S5、往步骤S4中添加复合酶C，搅拌混匀，所述复合酶C由复合风味蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、乳糖酶、氨肽酶和羧肽酶按2：1.5：1.2：1：1的重量比复配而成，所述复合酶C 的添加量为牛乳酪蛋白的0.5％，调节pH为6.5，置于50℃下反应30min，反应后置于90℃下灭活23min；
S6、将步骤S4中经酶解后得到的酶解液冷却至室温，将其pH调节至6，用超滤膜处理后，收集滤液，所述超滤膜为聚砜超滤膜，所述超滤膜的膜分子量孔径为5000道尔顿，所述超滤膜的进膜工作压力为0.40MPa，出膜工作压力为0.13MPa；所述超滤膜的工作温度为35℃；
S7、对滤液进行浓缩、冷冻干燥或者喷雾干燥处理，收集沉淀物，沉淀物经80目筛粉粹处理后制得1.09g粉末状的酪蛋白钙肽。
对比例3与实施例1相比，采用的是两步酶解法，即将复合酶A和复合酶B同时添加到牛乳酪蛋白浆液中，并按实施例1的步骤S1、S2、S3、S6、S7、S8、S9进行两步酶解反应，其余步骤相同，反应条件相同。
对比例4
对比例4提供一种制备酪蛋白钙肽的方法，包括以下步骤：
S1、取10g牛乳酪蛋白，往其中添加水，搅拌混合成牛乳酪蛋白浆液，控制水的添加量使牛乳酪蛋白的底物浓度为15％；
S2、将步骤S1中的牛乳酪蛋白浆液转移到高压均质机中，85℃、20MPa均质处理1.5h；
S3、往步骤S2的牛乳酪蛋白浆液中添加复合酶A，搅拌混匀，所述复合酶A由碱性蛋白酶和胰蛋白酶按1.8：1的重量比复配而成，所述复合酶A的添加量为牛乳酪蛋白的2％，调节pH为8.0，置于50℃下反应1.5h，反应后置于90℃下灭活23min；
S4、将步骤S3经酶解后得到的酶解液转移到高压均质机中，55℃、10MPa均质处理23min；
S5、往步骤S4中添加复合酶B和复合酶C，搅拌混匀，所述复合酶B由中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶按2：1.5：1：1的重量比复配而成，所述复合酶C 由复合风味蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、乳糖酶、氨肽酶和羧肽酶按2：1.5：1.2：1：1的重量比复配而成，所述复合酶B的添加量为牛乳酪蛋白的0.7％，所述复合酶C的添加量为牛乳酪蛋白的0.5％，调节pH为7.0，置于50℃下反应40min，反应后置于90℃下灭活23min；
S6、将步骤S5中经酶解后得到的酶解液冷却至室温，将其pH调节至6，用超滤膜处理后，收集滤液，所述超滤膜为聚砜超滤膜，所述超滤膜的膜分子量孔径为5000道尔顿，所述超滤膜的进膜工作压力为0.40MPa，出膜工作压力为0.13MPa；所述超滤膜的工作温度为35℃；
S7、对滤液进行浓缩、冷冻干燥或者喷雾干燥处理，收集沉淀物，沉淀物经80目筛粉粹处理后制得1.12g粉末状的酪蛋白钙肽。
对比例4与实施例1相比，采用的是两步酶解法，即将复合酶B和复合酶C同时添加到牛乳酪蛋白浆液中，并按实施例1的步骤S1、S2、S3、S4、S5、S8、S9的条件进行两步酶解反应，反应条件相同。
对比例5
对比例5为现有技术中酪蛋白钙肽的常规制备方法，包括以下步骤：
(1)将10g牛乳酪蛋白原料用水溶解，溶解后底物浓度为12％；
(2)利用胰蛋白酶进行酶解，胰蛋白酶的加入量为干酪素原料重量的0.8％，反应温度为40℃，反应时间3h，pH为8；
(3)酶解后在90℃下灭活20min；
(4)取出，冷却至室温，调节pH＝4.6，析出未酶解的牛乳酪蛋白，4000r/min离心10min，得澄清溶液，冷冻干燥后得到0.76g酪蛋白多肽酶解物。
实验例1：酪蛋白钙肽(CCP)得率的计算以及理化性质的测定：
以实施例1-3和对比例1-5中制备得到的CCP为测试对象，计算它们的CCP得率，并测定理化性质，CCP的得率和理化性质的测定结果如表1所示。其中，CCP得率的计算方法，以及各理化性质的测定方法如下：
(1)CCP得率＝CCP的质量(g)/制备CCP加入酪蛋白的质量(g)×100％；
(2)氮(N)含量测定：氮含量的测定参考GB/T5009-2003食品中蛋白质的测定方法执行的；
(3)磷(P)含量测定：磷含量的测定参考钼蓝比色法进行测定；
(4)N/P摩尔比的计算：N/p(摩尔比)＝N量含/P含量×31/14；
(5)乳糖含量(以还原糖计)测定：乳糖含量按GB/T 5009.7—2008《食品中还原糖的测定》测定；
通过表1可以看出，实施例1-3的CCP得率分别为15.1％、14.5％和14.1％，对比例1-5 的CCP得率分别为12.9％、8.8％、10.9％、11.2％和7.6％。通过实施例1-3的CCP得率和对比例5的CCP得率可以看出，采用本发明方法制备得到的CCP，得率为常规方法的两倍多，可见，采用本发明方法酶解乳源酪蛋白可以显著提高CCP的得率。通过实施例1-3的CCP 得率和对比例1的CCP得率可以看出，每一步酶解前先对乳源酪蛋白浆液进行均质化处理，并结合本发明的酶解方法可以在一定程度上提高CCP的得率。通过实施例1-3的CCP得率和对比例2-4的CCP得率可以看出，本发明的复合酶A、复合酶B和复合酶C采用三步酶解法比一步酶解法和两步酶解法效果更佳，CCP的得率更高。
同时，通过表1可以看出，实施例1-3的N/P摩尔比分别为6.23、6.50和6.55，对比例1-5的N/P摩尔比分别为13.45、10.21、9.11、9.33和17.26。通过实施例1-3的N/P摩尔比和对比例5的N/P摩尔比可以看出，与常规方法相比，采用本发明方法制备得到的CCP，N/P 摩尔比更小，说明采用本发明方法制备得到的CCP，磷酸基的密度越大，纯度也越高，持钙能力也越强。通过实施例1-3的N/P摩尔比和对比例2-4的N/P摩尔比可以看出，本发明的复合酶A、复合酶B和复合酶C采用三步酶解法比一步酶解法和两步酶解法效果更佳，N/P 摩尔比更低；通过实施例1-3的N/P摩尔比和对比例1的N/P摩尔比可以看出，每一步酶解前先对乳源酪蛋白浆液进行均质化处理，并结合本发明的酶解方法，可以有效降低CCP的 N/P摩尔比。
此外，通过表1可以看出，实施例1-3的乳糖含量分别为0.25、0.27和0.31，对比例1-5 的乳糖含量分别为1.11、0.47、0.41、0.45和4.7。通过实施例1-3的乳糖含量和对比例5的乳糖含量可以看出，采用本发明方法制备得到的CCP，乳糖含量得到了有效的降低，可以避免CCP长期存放吸水变黏；通过实施例1-3的乳糖含量和对比例1的乳糖含量可以看出，每一步酶解前先对乳源酪蛋白浆液进行均质化处理，并结合本发明的酶解方法可以更有效的降低乳糖含量；通过实施例1-3的乳糖含量和对比例2-4的乳糖含量可以看出，在本发明的复合酶A、复合酶B、复合酶C，以及均质化处理的基础上，采用三步酶解法、一步酶解法和两步酶解法对乳糖含量的影响不大，均能使其含量得到有效的降低。
表1实施例1-3和对比例1-5的CCP得率和理化性质
组别 CCP得率(％) 氮含量(％) 磷含量(％) N/P摩尔比 乳糖含量(％)
实施例1 15.1 3.57％ 1.27％ 6.23 0.25
实施例2 14.5 3.67％ 1.25％ 6.50 0.27
实施例3 14.1 3.64％ 1.23％ 6.55 0.31
对比例1 12.9 7.35％ 1.21％ 13.45 1.11
对比例2 8.8 4.75％ 1.03％ 10.21 0.47
对比例3 10.9 4.73％ 1.15％ 9.11 0.41
对比例4 11.2 4.68％ 1.11％ 9.33 0.45
对比例5 7.6 7.48％ 0.96％ 17.26 4.7
实验例2：苦味值的测定：
以实施例1-3和对比例1-5中制备得到的酶解液(即过滤处理后、浓缩干燥处理前的酶解液)为测试样品，以不同浓度硫酸奎宁溶液的苦味值为标准，选择9名经过培训和感官能力测试的人员组成感官评定小组，评定员用蒸留水漱口后，取酶解液2.0mL左右置于口中， 5～10s后吐出。然后根据表2的评分基准进行苦味值评分，得出的平均值表示各组酪蛋白钙肽的苦味程度(表3)。
从表2的测定结果可以看出，实施例1-3和对比例1-4中的酶解液的苦味值为1.23-2.25，表现为非常轻微的苦味，而对比例5中的酶解液的苦味值为4.11，表现为强苦味。可见，与对比例5中的常规制备方法相比，采用实施例1-3和对比例1-4中的方法制备得到的酪蛋白钙肽酶解液脱苦效果明显，尤其是实施例1-3中的制备方法，脱苦效果更佳，表明采用本发明方法制备得到的酪蛋白钙肽苦味得到很大程度的清除，口感更好，而且，本发明的复合酶 A、复合酶B和复合酶C采用三步酶解法比一步酶解法和两步酶解法的脱苦效果更好。
表2苦味值的评价标准
Figure RE-GDA0002358449670000121
表3实施例1-3和对比例1-5的苦味值的评价结果
组别 苦味值
实施例1 1.23
实施例2 1.37
实施例3 1.35
对比例1 1.53
对比例2 2.25
对比例3 2.13
对比例4 2.17
对比例5 4.11
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种制备酪蛋白钙肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、往乳源酪蛋白中添加水，搅拌混合成乳源酪蛋白浆液，控制水的添加量使乳源酪蛋白底物的浓度为10%～20%；
S2、将步骤S1中的乳源酪蛋白浆液均质处理1～2 h；
S3、往步骤S2的乳源酪蛋白浆液中添加复合酶A，搅拌混匀，所述复合酶A由碱性蛋白酶和胰蛋白酶按1.5～2：1的重量比复配而成，所述复合酶A的添加量为乳源酪蛋白的1%～3%，调节pH为7.5～8.5，置于45～55℃下反应1～2 h，反应后进行灭酶处理；
S4、将步骤S3经酶解后得到的酶解液均质处理15～30 min；
S5、往步骤S4中添加复合酶B，搅拌混匀，所述复合酶B由中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶按2：1.5：1：1的重量比复配而成，所述复合酶B的添加量为乳源酪蛋白的0.4%～1%，调节pH为6.8～7.2，置于45～55℃下反应20～60 min，反应后进行灭酶处理；
S6、将步骤S5经酶解后得到的酶解液均质处理10～15 min；
S7、往步骤S6中添加复合酶C，搅拌混匀，所述复合酶C由复合风味蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、乳糖酶、氨肽酶和羧肽酶按2：1.5：1.2：1：1的重量比复配而成，所述复合酶C的添加量为乳源酪蛋白的0.2%～0.8%，调节pH为6.0～7.0，置于45～55℃下反应20～40 min，反应后进行灭酶处理；
S8、将步骤S7中经酶解后得到的酶解液冷却至室温，将其pH调节至5-7，用超滤膜处理后，收集滤液；
S9、对滤液进行浓缩、干燥处理，收集沉淀物，沉淀物经粉粹处理后制得粉末状的酪蛋白钙肽。
2.根据权利要求1所述的一种制备酪蛋白钙肽的方法，其特征在于，步骤S1中所述的底物浓度为13%～17%。
3.根据权利要求1所述的一种制备酪蛋白钙肽的方法，其特征在于，步骤S2中所述的均质处理的条件为：80～90 ℃、10～30 MPa均质处理1～2 h；步骤S4中所述的均质处理的条件为：50～60 ℃、8～12 MPa均质处理15～30 min；步骤S6中所述的均质处理的条件为：50～60 ℃、8～12 MPa均质处理10～15 min。
4.根据权利要求1所述的一种制备酪蛋白钙肽的方法，其特征在于，步骤S3、S5、S7中所述的灭酶处理为80～100℃下灭活15-30 min。
5.根据权利要求1所述的一种制备酪蛋白钙肽的方法，其特征在于，所述超滤膜为聚砜超滤膜，所述超滤膜的膜分子量孔径为1000~10000道尔顿，所述超滤膜的进膜工作压力为0.30～0.50 MPa，出膜工作压力为0.08～0.20 MPa；所述超滤膜的工作温度为30℃～40℃。
6.根据权利要求1所述的一种制备酪蛋白钙肽的方法，其特征在于，步骤S9中所述的粉粹处理为70～90目筛粉粹处理。
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