CN103114119A - 利用蛋白酶水解鸡蛋清蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品加工领域，涉及利用蛋白酶水解鸡蛋清蛋白的方法。该方法是首先将新鲜鸡蛋洗净，然后分离出蛋清，蛋清与灭菌蒸馏水按照体积比1:3混合后在95℃加热变性20分钟，得酶水解用的原料；然后以该原料作为底物进行蛋白酶水解。本发明以蛋白残留率和水解度为指标，对温度、时间、pH、酶用量和蛋清浓度参数进行优化，确定最佳的水解工艺，克服酸水解的缺点，有利于食品安全。

Description

利用蛋白酶水解鸡蛋清蛋白的方法

技术领域

本发明属于食品加工领域，涉及利用蛋白酶水解鸡蛋清蛋白的方法。

背景技术

蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，按水解多肽方式可将蛋白酶分成内肽酶和外肽酶两大类。内肽酶从蛋白质分子内部将肽键切断，外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶，后者为羧基肽酶。按其活性中心和最适pH值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶等。按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。工业生产上应用的蛋白酶，主要是内肽酶。

蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。蛋白酶对所作用的底物有专一性，一种蛋白酶只水解蛋白质中特定肽键，如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。工业上蛋白酶制剂生产以利用枯草杆菌、栖土曲霉等发酵制取为主。

蛋白酶具有特异性，由于不同蛋白酶的酶解位点不同，同样的蛋白质在不同的水解酶作用下可产生不同的肽片段，虽能根据原料蛋白的组成和酶的专一性作为参考，但仍存在较大的盲目性。许多生物活性肽用胃肠道蛋白酶水解，常用的胃蛋白酶和胰蛋白酶，如血管紧张素转换酶抑制活性肽、钙结合磷酸肽，常用胰蛋白酶来制取。目前商业用酶以微生物酶为主，包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶及复合酶等。植物蛋白酶及少量动物蛋白酶也有应用。针对不同的底物，选择蛋白酶应考虑到的因素：1、避免水解过程中产生苦味肽；2、能有效的降低游离氨基酸数量；3、水解反应结束后蛋白酶易于变性失活；4、蛋白酶安全性与经济性。

鸡蛋蛋白主要在鸡蛋清中，蛋清中除水分外，主要成分是蛋白质，含有人体所必需的多种氨基酸，包括赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苏氨酸等，氨基酸配比均衡性好，是机体利用率最高的一种蛋白质，鸡蛋蛋白一般被认为是全价蛋白质，常用作评价其它食物蛋白营养价值的参比蛋白。

我国禽蛋资源丰富，但深加工蛋品仅限于松花蛋、卤蛋等再制蛋的加工，以及利用蛋清的起泡性质将其作为食品添加剂，国外发达国家对蛋品的研究较为深入，已提取多种有效成分应用于食品、医药、美容、保健品等行业，我国在这方面的研究较少，处于刚起步阶段。蛋清蛋白本身的某些性质，如不耐热及易凝固，限制了其在食品加工中的应用范围。鸡蛋清蛋白质作为一种全价蛋白，其序列中以非活性状态存在具有生物活性的肽段，采用适当的水解方法将这些生物活性肽释放出来并发挥生理调节作用，同时改善蛋清蛋白质的功能性质，拓宽其应用范围，也是生产蛋白饮料的一种加工手段。

蛋白质水解一般分为酸法水解和酶法水解。酸法水解虽水解迅速彻底，但会产生腐黑质，而且如色氨酸、丝氨酸等氨基酸被破坏。酶对蛋白质的水解是一种不完全、不彻底的水解反应，其水解产物主要是肽而不是氨基酸，水解过程中不产生消旋作用，氨基酸未被破坏，与基因工程、化学合成等方法相比，酶法水解安全性极高、反应条件温和、易于控制水解度，而且水解产物除氨基酸外，还含有大量生物活性肽，国内外已有利用蛋清蛋白肽液生产功能性饮料。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用蛋白酶水解鸡蛋清制备蛋清蛋白水解物的方法。

本发明的技术方案是：首先获取鸡蛋清并加热变性，然后调节pH，加入复合蛋白酶（Protamex）、中性蛋白酶（Neutrase）、碱性蛋白酶（Alcalase）和风味蛋白酶（Flavourzyme）4种酶（酶来自诺维信公司）中的一种，调节变性蛋清浓度、水解温度、反应时间、pH及酶用量，反应结束后使酶失去活性，制得鸡蛋清的蛋白水解液。

所述的利用蛋白酶水解鸡蛋清蛋白的方法，具体是：先将新鲜鸡蛋洗净，然后分离出蛋清，蛋清与灭菌蒸馏水按照体积比1:3混合后在95℃加热变性20分钟，得酶水解用的原料；然后以该原料作为底物进行单一蛋白酶水解；蛋白酶水解时间为6小时。

其中所述蛋白酶是复合蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶或风味蛋白酶；其中，

复合蛋白酶水解条件为：温度55℃、pH7.0、酶量为7%、蛋清浓度为1:5，复合蛋白酶6h酶解物的蛋白残留率为6.82%，水解度达7.40%；

中性蛋白酶水解条件为温度55℃、pH6.0、酶量为5%、蛋清浓度为1:5，中性蛋白酶6h酶解物的蛋白残留率为24.28%，水解度达3.71%；

碱性蛋白酶水解条件为温度55℃、pH7.5、酶量为6%、蛋清浓度为1:3或1:4，碱性蛋白酶6h酶解物的水解度可达18.73%，

风味蛋白酶水解条件为温度55℃、pH6.5、酶量为6%、蛋清浓度为1:5，风味蛋白酶6h酶解物的蛋白残留率为27.68%，水解度达38.75%。

本发明的优点体现在：本发明以蛋白残留率和水解度为指标，对温度、时间、pH、酶用量和蛋清浓度参数进行优化，确定最佳的水解工艺，克服酸水解的缺点，有利于食品安全。

具体实施方式

获得酶水解用的底物原料

将新鲜鸡蛋洗净，然后分离蛋清蛋黄，获得蛋清，蛋清与灭菌蒸馏水按照体积比1:3混合，95℃加热变性20分钟，得酶水解用的蛋清原料，用于下述的实施例。

实施例1：以此蛋清原料为酶水解底物，加入复合蛋白酶（Protamex）水解，获得鸡蛋清的蛋白水解液。

调节蛋清浓度为1:5（蛋清体积：蒸馏水体积），用HCl调节到pH7.0，水浴预热到55℃，加入酶7%（占稀释后蛋清重量的比，下同），于恒温水浴振荡器(120r/min)中进行酶解反应，酶解反应期间用pH计监测蛋清液的pH，并通过滴加NaOH溶液来调节pH，使pH保持在7.0，反应6小时后，收集蛋清蛋白水解液，置沸水浴中灭活酶20min，使酶解反应终止。

凯氏定氮法测水解物总含氮量，甲醛滴定法测定水解物游离氨基酸含量。

蛋白残留率测定：3000转离心5分钟，获得沉淀物，并测定其含氮量。

在本水解条件下，获得的蛋清蛋白水解液水解率为7.40%，蛋白质残留率为6.82%。

筛选数据如下：

以水解度和蛋白质残留率为考察指标，对水解温度、pH、Protamex酶用量和蛋清浓度四个因素进行正交设计，以确定Protamex酶水解鸡蛋清的最佳水解工艺参数。因素水平表如表1所示。

表1Protamex酶解鸡蛋清L₉(3⁴)正交试验因素水平表

以水解度为考察指标，正交结果如表2所示，由极差分析可知，影响Protamex酶水解鸡蛋清的主次因素依次为：pH>蛋清浓度>酶用量>温度。Protamex酶水解鸡蛋清的最优组合为A₂B₃C₂D₃，即温度60℃、pH7.0、酶量为7%、蛋清浓度为1:5。

表2Protamex酶解鸡蛋清蛋白正交试验L₉(3⁴)与结果分析水解度(%)

以蛋白残留率为考察指标，正交结果如表3所示，由极差分析可知，影响主次因素依次为：温度>酶用量>pH>蛋清浓度。Protamex酶水解鸡蛋清的最优组合为A₁B₃C₃D₂(D₃)，即温度55℃、pH7.0、酶量为8%、蛋清浓度为1:4或1:5。

表3Protamex酶解鸡蛋清蛋白正交试验L₉(3⁴)与结果分析蛋白残留率(%)

综合考虑蛋白残留率和水解度两个考察指标，尽可能降低蛋白残留率即提高底物蛋清蛋白的利用率的同时，尽量提高水解度，确定Protamex酶水解鸡蛋清的最佳水解工艺参数为：温度55℃、pH7.0、酶量为7%、蛋清浓度为1:5。在此条件下，Protamex鸡蛋清6h酶解物的蛋白残留率为6.82%，水解度达7.40%。

实例2：以此蛋清原料为酶水解底物，加入中性蛋白酶（Neutrase）水解，获得鸡蛋清的蛋白水解液。

调节蛋清浓度为1:5（蛋清体积：蒸馏水体，下同），用HCl调节到pH6.0，水浴预热到55℃，加入酶5%（占稀释后蛋清重量的比，），于恒温水浴振荡器(120r/min)中进行酶解反应，酶解反应期间用pH计监测蛋清液的pH，并通过滴加NaOH溶液来调节pH，使pH保持在6.0，反应6小时后，收集蛋清蛋白水解液，置沸水浴中灭活酶20min，使酶解反应终止。

凯氏定氮法测水解物总含氮量，甲醛滴定法测定水解物游离氨基酸含量。

蛋白残留率测定：3000转离心5分钟，获得沉淀物，并测定其含氮量。

在本水解条件下，获得的蛋清蛋白水解液水解率为3.71%，蛋白质残留率为24.28%。

筛选数据如下：

以水解度和蛋白质残留率为考察指标，对水解温度、pH、Neutrase酶用量和蛋清浓度四个因素进行正交设计，以确定Neutrase酶水解鸡蛋清的最佳水解工艺参数。因素水平表如表4所示。

表4Neutrase酶解鸡蛋清蛋白L₉(3⁴)正交试验因素水平表

以水解度为考察指标，正交结果如表5所示，由极差分析可知，影响Neutrase酶水解鸡蛋清的主次因素依次为：蛋清浓度>酶用量>pH>温度。Neutrase酶水解鸡蛋清的最优组合为A₃B₁C₃D₃，即温度55℃、pH6.0、酶量为5%、蛋清浓度为1:5。

表5Neutrase酶解鸡蛋清蛋白正交试验L₉(3⁴)与结果分析水解度（%）

以蛋白残留率为考察指标，正交结果如表6所示，由极差分析可知，影响Neutrase酶水解鸡蛋清的主次因素依次为：pH>酶用量>蛋清浓度>温度。Neutrase酶水解鸡蛋清的最优组合为A₁B₁C₃D₃，即温度45℃、pH6.0、酶量为5%、蛋清浓度为1:5。

表6Neutrase酶解鸡蛋清蛋白正交试验L₉(3⁴)与结果分析蛋白残留率（%）

综合蛋白残留率和水解度两个考察指标，尽可能降低蛋白残留率即提高底物蛋清蛋白的利用率的同时，尽量提高水解度，确定Neutrase酶水解鸡蛋清的最佳水解工艺参数为：温度55℃、pH6.0、酶量为5%、蛋清浓度为1:5。在此条件下，Neutrase酶水解鸡蛋清的蛋白残留率为24.28%，水解度达3.71%。

实例3：以此蛋清原料为酶水解底物，加入碱性蛋白酶（Alcalase）水解，获得鸡蛋清的蛋白水解液。

调节蛋清浓度为1:3或1:4（蛋清体积：蒸馏水体，下同），用NaOH调节到pH7.5，水浴预热到55℃，加入酶6%（占稀释后蛋清重量的比，），于恒温水浴振荡器(120r/min)中进行酶解反应，酶解反应期间用pH计监测蛋清液的pH，并通过滴加NaOH溶液来调节pH，使pH保持在7.5，反应6小时后，收集蛋清蛋白水解液，置沸水浴中灭活酶20min，使酶解反应终止。

凯氏定氮法测水解物总含氮量，甲醛滴定法测定水解物游离氨基酸含量。

蛋白残留率测定：3000转离心5分钟，获得沉淀物，并测定其含氮量。

在本水解条件下，获得的蛋清蛋白水解液水解率为18.73%，蛋白质残留率为0。

筛选数据如下：

以水解度和蛋白质残留率为考察指标，对水解温度、pH、Alcalase酶用量和蛋清浓度四个因素进行正交设计，以确定Alcalase酶水解鸡蛋清的最佳水解工艺参数。因素水平表如表7所示。

表7Alcalase酶解鸡蛋清L₉(3⁴)正交试验因素水平表

以水解度为考察指标，正交结果如表8所示，由极差分析可知，影响Alcalase酶水解鸡蛋清的主次因素依次为：温度>pH>酶用量>蛋清浓度。Alcalase酶水解鸡蛋清的最优组合为A₂B₁C₃D₁(D₂)，即温度55℃、pH7.5、酶量为6%、蛋清浓度为1:3或1:4，在此条件下Alcalase酶水解鸡蛋清的水解度可达18.73%。

表8Alcalase酶解鸡蛋清蛋白正交试验L₉(3⁴)与结果分析水解度（%）

实例4：以此蛋清原料为酶水解底物，加入风味蛋白酶（Flavourzyme）水解，获得鸡蛋清的蛋白水解液。

调节蛋清浓度为1:5（蛋清体积：蒸馏水体），用NaOH或HC调节到pH6.5，水浴预热到55℃，加入酶6%（占稀释后蛋清重量的比），于恒温水浴振荡器(120r/min)中进行酶解反应，酶解反应期间用pH计监测蛋清液的pH，并通过滴加NaOH溶液来调节pH，使pH保持在6.5，反应6小时后，收集蛋清蛋白水解液，置沸水浴中灭活酶20min，使酶解反应终止。

凯氏定氮法测水解物总含氮量，甲醛滴定法测定水解物游离氨基酸含量。

蛋白残留率测定：3000转离心5分钟，获得沉淀物，并测定其含氮量。

在本水解条件下，获得的蛋清蛋白水解液水解率为38.75%，蛋白质残留率为27.68%。

筛选数据如下：

以水解度和蛋白质残留率为考察指标，对水解温度、pH、Flavourzyme酶用量和蛋清浓度四个因素进行正交设计，以确定Flavourzyme酶水解鸡蛋清的最佳水解工艺参数。因素水平表如表9所示。

表9Flavourzyme酶解鸡蛋清L₉(3⁴)正交试验因素水平表

以水解度为考察指标，正交结果如表10所示，由极差分析可知，影响Flavourzyme酶水解鸡蛋清的主次因素依次为：蛋清浓度>酶用量>pH>温度。Flavourzyme酶水解鸡蛋清的最优组合为A₂B₁（B₂）C₃D₁（D₃），即温度55℃、pH6.0或6.5、酶量为6%、蛋清浓度为1:3或1:5。

表10Flavourzyme酶解鸡蛋清蛋白正交试验L₉(3⁴)结果分析水解度（%）

以蛋白残留率为考察指标，正交结果如表11所示，由极差分析可知，影响Flavourzyme酶水解鸡蛋清的主次因素依次为：温度>pH>酶用量>蛋清浓度。Flavourzyme酶水解鸡蛋清的最优组合为A₁B₁C₃D₃，即温度50℃、pH6.0、酶量为6%、蛋清浓度为1:5。

表11Flavourzyme酶解鸡蛋清蛋白正交试验L₉(3⁴)结果分析蛋白残留率（%）

综合蛋白残留率和水解度两个考察指标，尽可能降低蛋白残留率即提高底物蛋清蛋白的利用率的同时，尽量提高水解度，确定Flavourzyme酶水解鸡蛋清的最佳水解工艺参数为：温度55℃、pH6.5、酶量为6%、蛋清浓度为1:5。在此条件下，Flavourzyme酶水解鸡蛋清的蛋白残留率为27.68%，水解度达38.75%。

Claims (2)

1. 一种利用蛋白酶水解鸡蛋清蛋白的方法，首先将新鲜鸡蛋洗净，然后分离出蛋清，蛋清与灭菌蒸馏水按照体积比1:3混合后在95℃加热变性20分钟，得酶水解用的原料；然后以该原料作为底物进行蛋白酶水解；蛋白酶水解时间为6小时。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述蛋白酶是复合蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶或风味蛋白酶；其中，

复合蛋白酶水解条件为：温度55℃、pH7.0、酶量为7%、蛋清浓度为1:5，复合蛋白酶6h酶解物的蛋白残留率为6.82%，水解度达7.40%；

中性蛋白酶水解条件为温度55℃、pH6.0、酶量为5%、蛋清浓度为1:5，中性蛋白酶6 h酶解物的蛋白残留率为24.28%，水解度达3.71%；

碱性蛋白酶水解条件为温度55℃、pH7.5、酶量为6%、蛋清浓度为1:3或1:4，碱性蛋白酶6h酶解物的水解度可达18.73%，

风味蛋白酶水解条件为温度55℃、pH6.5、酶量为6%、蛋清浓度为1:5，风味蛋白酶6h酶解物的蛋白残留率为27.68%，水解度达38.75%。