CN105385732B - 一种双酶复合酶解制备谷朊粉短肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双酶复合酶解制备谷朊粉短肽的方法。该方法包括：将谷朊粉溶液水浴处理，加入复合蛋白酶酶解，加入中性蛋白酶酶解，使酶失活，离心取上清液。本发明方法具有谷朊粉短肽得率高，分子量集中分布于1000Da以下，且具有制备成本低，制备时间相对较短，制备方法简单、制备条件温和等优点。

Description

一种双酶复合酶解制备谷朊粉短肽的方法

技术领域

本发明涉及一种活性肽的制备方法，尤其涉及一种双酶复合酶解高效制备谷朊粉短肽的方法。

背景技术

随着经济发展和健康意识的提高，在保证高产量的同时，小麦品质越来越受到关注。小麦品质主要包括营养品质和加工品质，他们与小麦中的蛋白质各组分含量、比例密切相关。据统计，全世界蛋白质总消耗中63％直接来源于禾谷类食物。谷朊粉又名活性面筋，是小麦淀粉加工的副产物。谷朊粉中蛋白质含量在80％以上，其氨基酸组成较齐全，是营养丰富、物美价廉的植物蛋白；我国谷朊粉年产量高达10万吨，但由于目前国内对其开发与利用仍处于低级阶段，因此有必要对其开发利用进行更深入的研究。

多项研究表明，采用生物酶法在温和条件下对蛋白进行水解，生成的多肽具有很高营养价值。谷朊粉经蛋白酶水解制备成谷朊粉短肽后具有多种生理活性，包括抗氧化作用、抗菌作用、降血压作用等。因此，研究谷朊粉酶解工艺制备谷朊粉短肽，可以开发和利用谷朊粉这一巨大的潜在蛋白资源，生产高附加值蛋白产品。现代营养研究表明，分子量小于1000Da的短肽极易被人体吸收利用，而且具有较强的功能活性，这就要求所选用的酶解工艺在保证短肽得率的前提下尽量提高蛋白的水解度。

目前，蛋白水解制备谷朊粉短肽的工艺中，酶解时间一般在360-960min，短肽得率在60％左右，体系水解度在21％左右，且多存在脱盐等繁琐步骤。因此如何简化工艺并在短时间获得高水解度高得率的谷朊粉短肽成为生产工艺中需要解决的一大难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种双酶复合酶解高效制备谷朊粉短肽的方法，该方法简单、条件温和、制备时间短、谷朊粉短肽制备成本低，谷朊粉短肽得率高。

本发明双酶复合酶解高效制备谷朊粉短肽的方法，包括以下步骤：

1)将谷朊粉用水溶解，制得谷朊粉溶液；将所述谷朊粉溶液置于80-85℃水浴中保持10-15min；

2)将步骤1)水浴处理后的谷朊粉溶液取出，待温度降至复合蛋白酶(Protamex)酶解适合的温度后加入复合蛋白酶进行酶解，得到酶解液I；

3)向所述酶解液I中加入中性蛋白酶(Neutrase)，继续进行酶解，得到酶解II；

4)使所述酶解液II中的复合蛋白酶和中性蛋白酶失活，离心取上清液，即得含谷朊粉短肽的溶液。

上述双酶复合酶解高效制备谷朊粉短肽的方法，其中，

步骤1)所述谷朊粉的蛋白质含量不低于70％，脂肪含量不高于1％；

所述谷朊粉溶液中谷朊粉的质量浓度为4％-14％，优选质量浓度为10％-12％。

水浴处理可使谷朊粉蛋白变性，高度压缩、紧密的结构松散开，暴露出分子内部的酶作用位点，以利于蛋白酶的结合。

步骤2)所述复合蛋白酶的加入量为216-1100U/g，优选为468-864×U/g蛋白，进一步优选为648U/g蛋白；所述酶解的条件为酶解温度：30-55℃，优选35-50℃，更优选45-50℃；酶解时间：30-180min，优选60-150min，进一步优选90-120min。所述酶解在恒温水浴振荡器中进行。

步骤3)中所述中性蛋白酶的加入量为2600-6500U/g蛋白，

优选为3900-5200U/g蛋白，进一步优选为5200U/g蛋白；所述酶解的条件为酶解温度：30-55℃，优选35-50℃，更优选45-50℃；酶解时间：30-150min，优选60-150min，进一步优选90-150min，最佳120min。所述酶解在恒温水浴振荡器中进行。

步骤4)中可按照下述方法使所述复合蛋白酶和中性蛋白酶灭活：将酶解液II升温至90-95℃，保持10-20min。

步骤4)中所述离心的条件为：转速4000-4500rpm，时间20-30min。

上述方法还包括对步骤4)得到的谷朊粉短肽溶液进行干燥的步骤。优选所述干燥可采用喷雾干燥。

如无特殊指明，本发明所述复合蛋白酶是指由枯草芽抱杆菌经发酵产生的，例如经液体深层发酵，浓缩提取精制而制得；是为水解蛋白质而研制的杆菌蛋白酶复合体，由内切酶和外切酶复合而成。所述复合蛋白酶可按先有技术方法制备，也可外购商品化产品，例如购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：C8800，酶活为1.20×10⁵U/g。

如无特殊指明，本发明所述中性蛋白酶是由枯草芽抱杆菌经发酵产生的，例如经液体深层发酵，浓缩提取精制而制得；属于单一酶类，无特异性酶切位点。所述中性蛋白酶可按先有技术方法制备，也可外购商品化产品，例如购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：Z8030，酶活为3.75×10⁴U/g。

本发明对复合蛋白酶酶活的定义为：酪蛋白底物在特定条件下经酶水解，每分钟产生lμg酪氨酸为一个活力单位，以U表示。

本发明对中性蛋白酶酶活定义为：酪蛋白底物在特定条件下经酶水解，每分钟产生lμg酪氨酸为一个活力单位，以U表示。

本发明还包括按上述方法制备的谷朊粉短肽；所述谷朊粉短肽中分子量小于1000Da的含量为86％-100％。该谷朊粉短肽具有多种生理活性，包括抗氧化作用、抗菌作用、降血压作用等。

本发明提供了一种方法简单、条件温和、制备时间短、谷朊粉短肽制备成本低，谷朊粉短肽得率高的谷朊粉短肽的制备方法。所得谷朊粉短肽的分子量集中分布于1000Da以下；最终DH(指水解度)可高达24.14％，TCA-NSI(指三氯乙酸氮溶指数)可高达68.75％，其中分子量小于1000Da可高达100％。

附图说明

图1、图2分别为实验例1不同酶复配测得的TCA-NSI图和DH图。

图3为实验例2不同底物浓度测得的TCA-NSI和DH曲线图。

图4为实验例3不同复合蛋白酶加酶量测得的TCA-NSI和DH曲线图。

图5为实验例4不同中性蛋白酶加酶量测得的TCA-NSI和DH曲线图。

图6为实验例5不同酶解温度测得的TCA-NSI和DH曲线图。

图7、图8分别为实验例6、实验例7复合蛋白酶、中性蛋白酶不同酶解时间测得的TCA-NSI和DH曲线图。

图9为实施例1测得的短肽分子量分布的HPLC图谱。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所采用的中性蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：Z8030，酶活为3.75×10⁴U/g；所采用的复合蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：C8800，酶活为1.20×10⁵U/g；所采用的木瓜蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：68430，酶活为5.00×10⁵U/g；所采用的风味蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：F8250，酶活为2.00×10⁴U/g，所采用的碱性蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：B8360，酶活为2.00×10⁵U/g。

下述实施例中所采用的谷朊粉，其蛋白含量为70％，脂肪含量为1％。

下述实施例中可溶性氮的测定：Folin-酚法；

短肽得率测定采用三氯乙酸可溶性氮法，短肽得率＝N₁/N₀×100％；

式中，短肽得率(即TCA-NSI，三氯乙酸可溶性氮得率)，％；三氯乙酸氮溶指数N₁指在10％TCA中可溶性氮，mg；N₀指原料中总氮，mg。

水解度(DH)的测定：邻苯二甲醛(OPA)法。

谷朊粉短肽分子量分布的测定：采用高效液相色谱(HPLC)对酶解物的分子量分布进行分析，条件为：色谱柱：TSKge12000SWXL300mm×7.8mm；流动相：45％乙腈+55％水+0.1％三氟乙酸；流速：0.5ml/min；温度：30℃；检测波长：220nm。

实施例1

双酶复合酶解高效制备谷朊粉短肽的方法，包括以下步骤：

第一步：取谷朊粉，加入蒸馏水，使之溶解后，得到质量浓度12％的谷朊粉溶液；将该谷朊粉溶液加入80℃恒温水浴中保持10min，使谷朊粉高度压缩、紧密的结构松散开，暴露出分子内部的酶作用位点，以利于蛋白酶的结合；

第二步：第一步水浴处理完成后取出谷朊粉溶液，恢复温度到复合蛋白酶适合温度(50℃)后加入复合蛋白酶(加入量648U/g蛋白)，在50℃的恒温水浴振荡器中反应120min；

第三步：第二步反应结束后，加入中性蛋白酶(加入量5200U/g蛋白)混合均匀，继续在50℃的恒温水浴振荡器中反应120min；

第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min后喷雾干燥得到谷朊粉短肽。

采用高效液相色谱(HPLC)对第四步所得谷朊粉短肽的分子量分布进行分析，测得的短肽分子量分布如图9所示(横坐标Minutes表示保留时间，纵坐标AU表示吸光度)，分子量小于1000Da占100％。

采用上述方法制备谷朊粉短肽，最终DH(指水解度)达到24.14％，TCA-NSI(指三氯乙酸氮溶指数)达到68.75％(以蛋白含量计)，分子量小于1000Da占100％。

实施例2

双酶复合酶解高效制备谷朊粉短肽的方法，与实施例1的区别仅在于：第二步中复合蛋白酶用量为468U/g蛋白；酶解温度为45℃。

采用上述方法制备谷朊粉短肽，最终DH达到18.23％，TCA-NSI达到58.46％(以蛋白含量计)，分子量小于1000Da占86％。

实施例3

双酶复合酶解高效制备谷朊粉短肽的方法，与实施例1的区别仅在于：第三步中中性蛋白酶用量为4800U/g蛋白；酶解温度为50℃。

采用上述方法制备谷朊粉短肽，最终DH达到19.47％，TCA-NSI达到62.39％(以蛋白含量计)，分子量小于1000Da占92.1％。

实验例1考察不同蛋白酶复配对TCA-NSI和DH的影响；

将实施例1方法中第二步、第三步中的复合蛋白酶、中性蛋白酶分别替换成木瓜蛋白酶(加入量3000U/g蛋白)、风味蛋白酶(加入量3000U/g蛋白)等，考察不同蛋白酶复配，水解谷朊粉的TCA-NSI和DH。

具体实验方案为：分别对复合蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶在其推荐最适条件下进行单一酶解探究、同时由于碱性蛋白酶酶解后需脱盐处理，工业生产复杂，则考察除其之外的其他四种酶两两复合酶解的最佳酶制剂组合以及最适加酶顺序。

结果见图1、图2。由图1、图2中可以看出：在各种蛋白酶的推荐使用条件下(木瓜蛋白酶、风味蛋白酶的酶解条件为：温度50℃，加酶量3000U/g蛋白，酶解时间120min)，复合蛋白酶与中性蛋白酶复配(即实施例1)水解谷朊粉的TCA-NSI和DH显著高于其他蛋白酶，所以选择中性蛋白酶作为复合蛋白酶的复配酶。

图1、图2中：Alcal…代表碱性蛋白酶；Neut…或N代表中性蛋白酶；FM代表风味蛋白酶；Prot…或Pr代表复合蛋白酶；Papain或Pa代表木瓜蛋白酶

实验例2考察不同底物浓度对TCA-NSI和DH的影响

第一步：取谷朊粉，加入蒸馏水，使之溶解后，得到底物质量浓度(4％、6％、8％、10％、12％、14％)的谷朊粉溶液；将其加入80℃恒温水浴中保持l0min，使谷朊粉高度压缩、紧密的结构松散开，暴露出分子内部的酶作用位点，以利于蛋白酶的结合；

第二步：第一步水浴处理完成后取出谷朊粉溶液，恢复温度到复合蛋白酶适合温度(50℃)后加入复合蛋白酶(648U/g蛋白)，在50℃的恒温水浴振荡器中反应90min；

第三步：第二步反应结束后，加入中性蛋白酶(加入量5200U/g蛋白)混合均匀，继续在50℃的恒温水浴振荡器中反应120min；

第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min后喷雾干燥得到谷朊粉短肽。

不同底物浓度所对应的谷朊粉的TCA-NSI和DH的结果，见图3。由图3可以看出：随着底物浓度的增加TCA-NSI和DH含量在不断增加且在4％-14％范围内随之增加而增加；在12％-14％内虽然增加但是增加幅度较小基本趋于平缓；这是由于随着底物质量浓度的增加，蒸馏水量的增加会降低底物浓度，增大谷朊粉与溶剂接触面的浓度差，使得反应速度加快，从而TCA-NSI上升、DH增大。所以选择最佳底物浓度为12％。

实验例3考察复合蛋白酶用量对TCA-NSI和DH的影响

第一步：取谷朊粉，加入蒸馏水，使之溶解后，得到质量浓度12％的谷朊粉溶液；将其加入80℃恒温水浴中保持10min，使谷朊粉高度压缩、紧密的结构松散开，暴露出分子内部的酶作用位点，以利于蛋白酶的结合；

第二步：第一步水浴处理完成后取出谷朊粉溶液，恢复温度到复合蛋白酶适合温度(50℃)后加入复合蛋白酶(加入量216-1100U/g蛋白)，在50℃的恒温水浴振荡器中反应120min；

第三步：第二步反应结束后，加入中性蛋白酶(加入量5200U/g蛋白)混合均匀，继续在50℃的恒温水浴振荡器中反应120min；

第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min后喷雾干燥得到谷朊粉短肽。

上述第二步中不同复合蛋白酶的用量所对应的谷朊粉的TCA-NSI和DH的结果，见图4(图4示出复合蛋白酶加入量216U/g蛋白、468U/g蛋白、648U/g蛋白、864U/g蛋白、1100U/g蛋白，Protamex表示复合蛋白酶)。由图4中可以看出：酶用量在216-468U/g蛋白浓度范围内，酶解液的DH和TCA-NSI上升缓慢，当酶用量在468-648U/g蛋白浓度范围内时，酶解液的DH和TCA-NSI随酶用量的升高上升迅速，当酶用量达到648U/g时，TCA-NSI达到59.64％，之后上升均趋于平缓，所以选择复合蛋白酶加酶量为648U/g蛋白。

实验例4考察中性蛋白酶用量对TCA-NSI和DH的影响

第一步：取谷朊粉，加入蒸馏水，使之溶解后，得到质量浓度12％的谷朊粉溶液；将其加入80℃恒温水浴中保持l0min，使谷朊粉高度压缩、紧密的结构松散开，暴露出分子内部的酶作用位点，以利于蛋白酶的结合；

第二步：第一步水浴处理完成后取出谷朊粉溶液，恢复温度到复合蛋白酶适合温度(50℃)后加入复合蛋白酶(加入量648U/g蛋白)，在50℃的恒温水浴振荡器中反应90min；

第三步：第二步反应结束后，加入不同量的中性蛋白酶(加入量2600-6500U/g蛋白)混合均匀，继续在50℃的恒温水浴振荡器中反应120min；

第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min后喷雾干燥得到谷朊粉短肽。

不同中性蛋白酶的用量所对应的谷朊粉的TCA-NSI和DH的结果，见图5(图5示出中性蛋白酶加入量2600U/g蛋白、3900U/g蛋白、5200U/g蛋白、6500U/g蛋白，Neutrase表示中性蛋白酶)。由图5中可以看出：水解液中TCA-NSI和DH呈先上升后下降的趋势。随着加酶量增大，酶的水解作用加强，反应后TCA-NSI和DH上升，但当加酶量继续增加，酶的抑制作用导致TCA-NSI和DH均不同程度下降。所以优选中性蛋白酶加酶量为3900-5200U/g蛋白，最优选5200U/g蛋白。

实验例5考察不同酶解温度对TCA-NSI和DH的影响

第一步：取谷朊粉，加入蒸馏水，使之溶解后，得到质量浓度12％的谷朊粉溶液；将其加入80℃恒温水浴中保持l0min，使谷朊粉高度压缩、紧密的结构松散开，暴露出分子内部的酶作用位点，以利于蛋白酶的结合；

第二步：第一步水浴处理完成后取出谷朊粉溶液，恢复温度到复合蛋白酶酶解温度(30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃)后加入复合蛋白酶(加入量648U/g蛋白)，在恒温水浴振荡器(30、35、40、45、50、55℃)中反应90min；

第三步：第二步反应结束后，加入中性蛋白酶(5200U/g蛋白)混合均匀，继续在恒温水浴振荡器中(30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃)反应120min；

第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min离心20min后喷雾干燥得到谷朊粉短肽。

不同酶解温度所对应的谷朊粉的TCA-NSI和DH的结果，见图6。由图6可以看出：酶的作用效果受到温度影响较大。一般情况下，在酶的适用温度范围内，增加反应体系的温度，则酶解的速度加快，酶解产物增多。如图6所示，在35-50℃温度范围内，TCA-NSI和DH随着温度升高而增加。50℃后TCA-NSI和DH随着温度的升高逐渐降低。因此，选择45-50℃作为酶解温度，50℃为最佳酶解温度。

实验例6考察复合蛋白酶不同酶解时间对TCA-NSI和DH的影响

第一步：取谷朊粉，加入蒸馏水，使之溶解后，得到质量浓度12％的谷朊粉溶液；将其加入80℃恒温水浴中保持l0min，使谷朊粉高度压缩、紧密的结构松散开，暴露出分子内部的酶作用位点，以利于蛋白酶的结合；

第二步：第一步水浴处理完成后取出谷朊粉溶液，恢复温度到复合蛋白酶适合温度后加入复合蛋白酶(加入量648U/g蛋白)，在50℃的恒温水浴振荡器中反应若干时间(30min\60min\90min\120min\150min\180min)；

第三步：第二步反应结束后，加入中性蛋白酶(加入量5200U/g蛋白)混合均匀，继续在50℃的恒温水浴振荡器中反应若干时间120min；

第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持l0min，使中性蛋白酶失活，4200r/min离心20min后喷雾干燥得到谷朊粉短肽。

不同酶解时间所对应的谷朊粉的TCA-NSI和DH的结果，见图7(横坐标表示复合蛋白酶酶解时间，分钟)。由图7可以看出：当加酶量、底物浓度和酶解温度一定时，调整复合蛋白酶加入时间，酶解效果不同。由图7可知，30-60min时，TCA-NS和DH呈明显上升趋势。60-180min酶解过程中，TCA-NSI和DH缓慢上升，考虑经济效益，单酶酶解时间不宜过长。因此Protamex的最佳酶解时间为90min。

实验例7考察中性蛋白酶不同酶解时间对TCA-NSI和DH的影响

第一步：取谷朊粉，加入蒸馏水，使之溶解后，得到质量浓度12％的谷朊粉溶液；将其加入80℃恒温水浴中保持l0min，使谷朊粉高度压缩、紧密的结构松散开，暴露出分子内部的酶作用位点，以利于蛋白酶的结合；

第二步：第一步水浴处理完成后取出谷朊粉溶液，恢复温度到复合蛋白酶适合温度后加入复合蛋白酶(加入量648U/g蛋白)，在50℃的恒温水浴振荡器中反应90min；

第三步：第二步反应结束后，加入中性蛋白酶(加入量5200U/g蛋白)混合均匀，继续在50℃的恒温水浴振荡器中反应若干时间(30min\60min\90min\120min\150min)；

第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持l0min，使中性蛋白酶失活，4200r/min离心20min后喷雾干燥得到谷朊粉短肽。

不同酶解时间所对应的谷朊粉的TCA-NSI和DH的结果，见图8(横坐标表示中性蛋白酶酶解时间，分钟)。由图8可以看出：当加酶量、底物浓度和酶解温度一定时，调整中性蛋白酶加入时间，酶解效果不同。由图8可知，30-120min内TCA-NSI和DH随时间的延长不断升高，且在120min后趋于稳定。在酶解120min时，TCA-NSI和DH分别达到65.94％和18.86％。则Neutrase的最佳酶解时间为120min。因此酶解最佳时间为复合蛋白酶反应90min后加入中性蛋白酶继续反应120min。

采用本发明方法制备谷朊粉短肽具有以下有益效果：制备方法简单，制备条件温和，制备时间短，谷朊粉短肽制备成本低，谷朊粉的TCA-NSI高，分子量集中分布于1000Da以下；最终DH可高达24.14％，TCA-NSI可高达68.75％，分子量小于1000Da可高达100％(86％-100％)。

本文具体说明了本发明示例性实施实例和目前的优选实施方式，应当理解，本发明的构思可以按其他种种形式实施运用，它们同样落在本发明的保护范围内。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.一种双酶复合酶解制备谷朊粉短肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将谷朊粉用水溶解，制得谷朊粉溶液；将所述谷朊粉溶液置于80-85℃水浴中保持10-15min；

所述谷朊粉的蛋白质含量不低于70％，脂肪含量不高于1％；

所述谷朊粉溶液中谷朊粉的质量浓度为4％-14％；

2)将步骤1)水浴处理后的谷朊粉溶液取出，待温度降至复合蛋白酶酶解适合的温度后加入复合蛋白酶进行酶解，得到酶解液I；

所述复合蛋白酶是指由枯草芽抱杆菌经发酵产生的；

所述复合蛋白酶的加入量为216-1100U/g蛋白，所述酶解的条件为酶解温度：30-55℃，酶解时间：30-180min；

3)向所述酶解液I中加入中性蛋白酶，继续进行酶解，得到酶解液II；所述中性蛋白酶是由枯草芽抱杆菌经发酵产生的；

所述中性蛋白酶的加入量为2600-6500U/g蛋白，所述酶解的条件为酶解温度：30-55℃，酶解时间：30-150min；

4)使所述酶解液II中的复合蛋白酶和中性蛋白酶失活，离心取上清液，即得含谷朊粉短肽的溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述谷朊粉溶液中谷朊粉的质量浓度为10％-12％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述复合蛋白酶的加入量为468-864U/g蛋白；所述酶解的条件为酶解温度：35-50℃；酶解时间：60-150min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)所述复合蛋白酶的加入量为648U/g蛋白；所述酶解的条件为酶解温度：45-50℃；酶解时间：90-120min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述中性蛋白酶的加入量为3900-5200U/g蛋白；所述酶解的条件为酶解温度35-50℃；酶解时间：60-150min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述中性蛋白酶的酶解的条件为酶解温度45-50℃；酶解时间90-150min。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤3)中所述中性蛋白酶的酶解的条件为酶解时间120min。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于：步骤4)中使所述中性蛋白酶和复合蛋白酶灭活的方法如下：将所述酶解液II升温至90-95℃，保持10-20min；步骤4)中所述离心的条件为：转速4000-4500rpm，时间20-30min。

9.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对步骤4)得到的谷朊粉短肽的溶液进行干燥的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述干燥的方式为喷雾干燥。

11.权利要求1-10任一所述方法制备得到的谷朊粉短肽。