CN103865972A - 一种双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法，通过利用中性蛋白酶和复合蛋白酶分步酶解热榨花生粕，并通过多项实验确定最佳酶解条件及所述中性蛋白酶和复合蛋白酶的加入量，提供了一种工艺简单、条件温和、制备时间短、制备成本低且短肽得率及水解度高的花生肽的制备方法，有效提高热榨花生粕的利用率。本发明中短肽得率和水解度均得到大幅度提高，短肽得率为85.20％，水解度达到40.55％，且所得花生肽的分子量集中分布于1000Da以下，分子量小于1000Da的花生肽占95.57％，使所得的花生肽极易被人体吸收利用，且具有较强的功能活性和更高的营养价值，本发明具有工艺简单、条件温和、短肽得率高、花生肽分子量小并适合大规模工业化生产的优点。
Description
技术领域
本发明涉及花生粕利用领域，尤其涉及一种双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法。
背景技术
花生是我国重要的油料作物，产量和出口量高居世界首位。花生蛋白含有人体必需的八种氨基酸，精氨酸含量高于其它坚果，生物学效价高于大豆。
花生粕是花生榨油过程中产生的副产物，年产量约达300万吨，根据提油工艺的不同，花生粕又分为热榨花生粕、溶剂浸提花生粕和冷榨花生粕。目前，我国花生榨油主要采用热榨的方式，热榨花生粕中花生蛋白含量为45％～55％，但是热榨花生粕中花生蛋白变性程度严重，影响其功能及生理活性，从中直接提取花生蛋白得率非常低，所以目前对热榨花生粕的利用受到了很大的限制，仅有不足1％用于食品工业，大多用作动物饲料，产品附加值低，资源浪费严重，进一步开发和利用这一巨大的潜在蛋白资源，生产高附加值产品成了当务之急。
多项研究表明，花生蛋白经蛋白酶水解制备成花生肽后具有多种生理活性，包括抗氧化作用、抗菌作用、降血压作用等。因此，研究热榨花生粕酶解工艺制备花生肽，可以开发和利用热榨花生粕这一巨大的潜在蛋白资源，生产高附加值蛋白产品。采用生物酶法在温和条件下对蛋白进行水解，生成的多肽具有很高营养价值。现代营养研究表明，分子量小于1000U的短肽极易被人体吸收利用，而且具有较强的功能活性，这就要求所选用的酶解工艺在保证短肽得率的前提下尽量提高蛋白的水解度。
目前，关于花生肽的提取方法中普遍使用了大量碱处理或者一些有害的化学溶剂，不可避免地存在威胁人体健康的隐患。现有的生物酶处理方法中，普遍采用碱性蛋白酶对花生蛋白进行酶解，然后经过脱盐等多个繁琐的步骤，制备花生肽，酶解时间一般较长，普遍为360～960min，短肽得率及水解度较低，短肽得率在60％～65％左右，水解度在12％～16％左右，因此，如何简化工艺并在短时间获得高水解度、高得率的花生肽成为生产工艺中需要解决的一大难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法，通过利用中性蛋白酶和由内切酶与外切酶组成的复合蛋白酶分步酶解热榨花生粕，并通过多项实验确定最佳酶解条件及所述中性蛋白酶和复合蛋白酶的加入量，提供了一种工艺简单、条件温和、制备时间短、制备成本低且短肽得率及水解度高的花生肽的制备方法，有效提高热榨花生粕的利用率。
本发明的技术方案为：
一种双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将热榨花生粕与蒸馏水混合，制备质量浓度为13～15％的热榨花生粕溶液，并测定所述热榨花生粕中花生蛋白的含量；
步骤二、调节并保持所述热榨花生粕溶液的温度为40～50℃，向所述热榨花生粕溶液中加入中性蛋白酶，进行酶解反应1.5～2.0h，得到第一酶解液，其中所述中性蛋白酶的加入量根据所述热榨花生粕溶液的质量浓度及所测定的热榨花生粕中花生蛋白的含量计算得到；
步骤三、向所述第一酶解液中加入复合蛋白酶，保持温度40～50℃，进行酶解反应2.0～3.0h，得到第二酶解液，其中所述复合蛋白酶的加入量根据所述热榨花生粕溶液的质量浓度及所测定的热榨花生粕中花生蛋白的含量计算得到；
步骤四、将所述第二酶解液中的所述中性蛋白酶和复合蛋白酶灭活，离心取上清液，得到花生肽溶液。
优选的是，所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法中，步骤二中所述中性蛋白酶的酶解反应时间为1.5h，温度为45℃。
优选的是，所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法中，步骤三中所述复合蛋白酶的酶解反应时间为2.5h，温度为45℃。
优选的是，所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法中，步骤二中所述中性蛋白酶的加入量为5200～6500U／g花生蛋白，步骤三中所述复合蛋白酶的加入量为249～499U／g花生蛋白。
优选的是，所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法中，步骤二中所述中性蛋白酶的加入量为5200U／g花生蛋白，步骤三中所述复合蛋白酶的加入量为374U／g花生蛋白。
优选的是，所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法中，所述热榨花生粕中花生蛋白的含量通过凯氏定氮法测定。
优选的是，所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法中，步骤一中所述热榨花生粕溶液的质量浓度为14％。
优选的是，所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法中，步骤四中通过将所述第二酶解液升温至90～95℃，并保持该温度10～20min进行所述中性蛋白酶和复合蛋白酶的灭活；所述离心的条件为4000～4500rpm离心20～30min。
优选的是，所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法中，步骤三中所述复合蛋白酶由内切酶和外切酶组成，步骤二中所述的中性蛋白酶由枯草芽孢杆菌经过发酵提取得到。
优选的是，所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法中，其特征在于，步骤四中所得到的花生肽溶液经过干燥，制备为固体花生肽。
本发明具有以下有益效果：本发明所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法中，通过利用中性蛋白酶和由内切酶与外切酶组成的复合蛋白酶分步酶解热榨花生粕，并通过多项实验确定最佳酶解条件及所述中性蛋白酶和复合蛋白酶的加入量，提供了一种工艺简单、条件温和、制备时间短、制备成本低且短肽得率及水解度高的花生肽的制备方法，有效提高热榨花生粕的利用率。
本发明所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法中，短肽得率达到85.20％，水解度达到40.55％，短肽得率和水解度均得到大幅度提高，且所得花生肽的分子量集中分布于1000Da以下，其中分子量小于1000Da的花生肽占95.57％，使所得的花生肽极易被人体吸收利用，而且具有较强的功能活性，具有更高的营养价值，并具有较强的ACE抑制活性，其IC50值为0.77mg／ml。
另外，酶解时间缩短为300min之内，且省略脱盐等繁琐的工艺步骤，生产工艺大幅度简化，本发明具有工艺简单、条件温和、短肽得率高、花生肽分子量小并适合大规模工业化生产的优点。
附图说明
图1为本发明所述双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法示意图；
图2为本发明中测得的中性蛋白酶加酶量与水解关系曲线图；
图3为本发明中测得的复配酶种类与水解关系曲线图；
图4为本发明中测得的复合蛋白酶加酶量与水解关系曲线图；
图5为本发明中测得的酶解温度与水解关系曲线图；
图6为本发明中测得的酶解时间与水解关系曲线图；
图7为本发明中测得的短肽分子量分布的GPC图谱。
具体实施方式
下面结合附图1-7对本发明做详细说明，以令本领域普通技术人员参阅本说明书后能够据以实施。
如图1所示，一种双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将热榨花生粕与蒸馏水混合，制备质量浓度为13～15％的热榨花生粕溶液，优选的浓度为14％。通过充分的搅拌，使热榨花生粕溶液充分混合均匀，以保证后续步骤中热榨花生粕与所用的蛋白酶充分接触，并调节所述热榨花生粕溶液的pH为6.5～7.0，有利于酶解反应的进行。本发明所采用的热榨花生粕中，花生蛋白含量为45～55％，脂肪含量不高于2％。通过凯氏定氮法测定所述热榨花生粕中花生蛋白的含量，根据所述热榨花生粕溶液的质量浓度及所测定的热榨花生粕中花生蛋白的含量，计算所述热榨花生粕溶液中花生蛋白的质量，以确定后续步骤中所加蛋白酶的量。
步骤二、调节并保持所述热榨花生粕溶液的温度为40～50℃，向所述热榨花生粕溶液中加入中性蛋白酶，进行酶解反应1.5～2.0h，得到第一酶解液，其中所述中性蛋白酶的加入量根据所述热榨花生粕溶液的质量浓度及所测定的热榨花生粕中花生蛋白的含量计算得到；所述酶解反应在恒温水浴振荡器中进行，一方面了有效保持酶解反应温度，另一方面通过振荡使作为酶解反应底物的花生蛋白与所述中性蛋白酶充分接触，有利于酶解反应的进行。
步骤三、向所述第一酶解液中加入复合蛋白酶，保持温度40～50℃，进行酶解反应2.0～3.0h，得到第二酶解液，其中所述复合蛋白酶的加入量根据所述热榨花生粕溶液的质量浓度及所测定的热榨花生粕中花生蛋白的含量计算得到；该酶解反应亦在恒温水浴振荡器中进行。
步骤四、将所述第二酶解液中的所述中性蛋白酶和复合蛋白酶灭活，离心取上清液，得到花生肽溶液。所用的灭活方法为将所述第二酶解液升温至90～95℃，并保持该温度10～20min。所述离心的条件为4000～4500rpm离心20～30min。
所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法中，步骤二中所述中性蛋白酶的最佳酶解反应时间为1.5h，温度为45℃。
所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法中，步骤三中所述复合蛋白酶的最佳酶解反应时间为2.5h，温度为45℃。
本发明对中性蛋白酶酶活定义为：酪蛋白花生蛋白在特定条件下经酶水解，每分钟产生1μg酪氨酸为一个活力单位，以U表示。
对复合蛋白酶酶活的定义为：酪蛋白花生蛋白在特定条件下经酶水解，每分钟产生1μg酪氨酸为一个活力单位，以U表示。
所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法中，步骤二中所述中性蛋白酶的加入量为5200～6500U／g花生蛋白，步骤三中所述复合蛋白酶的加入量为249～499U／g花生蛋白。
所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法中，步骤二中所述中性蛋白酶的最佳加入量为5200U／g花生蛋白，步骤三中所述复合蛋白酶的最佳加入量为374U／g花生蛋白。
所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法中，步骤三中所述复合蛋白酶由内切酶和外切酶组成，所述复合蛋白酶由米曲霉菌进行深层液体发酵产生，并经过浓缩提取精制复合而成，为水解蛋白质而研制的杆菌蛋白酶复合体；步骤二中所述的中性蛋白酶由枯草芽孢杆菌经过发酵提取得到。
所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法中，步骤四中所得到的花生肽溶液经过干燥，制备为固体花生肽，所采用的干燥方法可采用冷冻干燥或用喷雾干燥器进行喷雾干燥，所述喷雾干燥器的进口温度设置为130～150℃，出口温度为70℃。本发明中短肽得率达到85.20％，水解度达到40.55％，所得花生肽的分子量集中分布于1000Da以下，其中分子量小于1000Da的花生肽占95.57％。
下述实施例中所采用的中性蛋白酶购白北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：Z8030，酶活为6.00×104U／g；所采用的复合蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：C8800，酶活为1.20×105U／g；所采用的木瓜蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：G8430，酶活为5.00×105U／g；所采用的风味蛋白酶购白北京索莱宝科技有限公司，商品目录号：F8250，酶活为2.00×105U／g。
下述实施例中所采用的热榨花生粕，其蛋白含量为47％，脂肪含量为1％，ACE既血管紧张素转化酶抑制活性的IC50值为0.77mg／ml。
下述实施例中可溶性氮的测定：folin-酚法；
短肽得率测定：三氯乙酸可溶性氮法=N1／N0×100％；
式中，TCA-NSI-三氯乙酸可溶性氮得率，％；N1-在10％TCA中可溶性氮，mg；N0原料中总氮，mg。
水解度DH的测定：邻苯二甲醛法。
花生肽分子量分布的测定：采用高效液相色谱对酶解物的分子量分布进行分析，条件为：色谱柱：TSKgel2000SWXL300mm×7.8mm；流动相：45％乙睛+55％水+0.1％三氟乙酸；流速：0.5ml／min；温度：30℃；检测波长：220nm。
ACE抑制活性的测定：采用高效液相色谱对酶解物的ACE抑制活性进行分析，条件为：实验色谱柱SunfireTM-C18(250mm×4.6mm)，流动相乙腈-水-三氟乙酸，体积比50：50：0.05，检测波长228nm，流速0.4mL／min，柱温30℃，进样量20μL。
实施例1、考察不同蛋白酶复配对水解度及短肽得率的影响
第一步：取热榨花生粕，加入蒸馏水，使之溶解后，得到质量浓度14％的热榨花生粕溶液；此过程保证其与蛋白酶充分接触，有利于酶解的进行；
第二步：第一步完成后取出热榨花生粕溶液，升高温度到45℃后加入中性蛋白酶，所加中性蛋白酶的量为5200U／g花生蛋白，在45℃的恒温水浴振荡器中反应1.5h；
第三步：第二步反应结束后，加入复合蛋白酶，其加入量为374U／g花生蛋白，混合均匀，继续在45℃的恒温水浴振荡器中反应1.5h；
第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持10min，使中性蛋白酶和复合蛋白酶失活，4500rpm离心20min后，取上清液喷雾干燥得到固体花生肽。
第五步：采用高效液相色谱对第四步所得花生肽的分子量分布进行分析，测得的短肽分子量分布如图7所示，分子量小于1000Da占95.57％。
第六步：采用高效液相色谱对酶解物的ACE抑制活性进行分析，ACE抑制活性的IC50值为0.77mg／ml。
采用上述方法制备花生肽，水解度达到40.55％，短肽得率达到85.20％，分子量小于1000Da占95.57％，ACE抑制活性的IC50值为0.77mg／ml。
上述第二步中不同中性蛋白酶的用量所对应的水解度和短肽得率的结果，见图2。由图2中可以看出：酶用量在2600-3000U／g花生蛋白浓度范围内，酶解液的DH和TCA-NSI上升缓慢，当酶用量在3000～5200U／g花生蛋白浓度范围内时，酶解液的DH随酶用量的升高上升迅速，当酶用量达到5200U／g花生蛋白时，DH达到26.55±0.49％，之后上升均趋于平缓，所以选择中性蛋白酶加酶量为5200U／g花生蛋白。
将上述第三步中的复合蛋白酶分别替换成木瓜蛋白酶，其加入量为3000U／g花生蛋白；风味蛋白酶，其加入量为3000U／g花生蛋白，考察不同蛋白酶与中性蛋白酶复配，水解度和短肽得率，结果见图3。由图3中可以看出：在各种蛋白酶的推荐使用条件下，其中木瓜蛋白酶、风味蛋白酶的酶解条件为：温度50℃，加酶量3000U／g花生蛋白，酶解时间2.5h，复合蛋白酶与中性蛋白酶复配水解热榨花生粕的水解度和短肽得率显著高于其他两种蛋白酶，所以选择复合蛋白酶作为中性蛋白酶的复配酶。
实施例2、考察复合蛋白酶用量对水解度及短肽得率的影响
第一步：取热榨花生粕，加入蒸馏水，使之溶解后，得到质量浓度14％的热榨花生粕溶液；此过程保证其与蛋白酶充分接触，有利于酶解的进行；
第二步：第一步完成后取出热榨花生粕溶液，升高温度到45℃后加入中性蛋白酶，加入量为5200U／g花生蛋白，在45℃的恒温水浴振荡器中反应1.5h：
第三步：第二步反应结束后，加入不同量的复合蛋白酶，加入量为124～624U／g花生蛋白，混合均匀，继续在45℃的恒温水浴振荡器中反应2.5h；
第四步：第三步反应结束后取出，放入90℃恒温水浴中保持10min，使中性蛋白酶和复合蛋白酶失活，4500rpm离心20min后取上清液，经过喷雾干燥得到花生肽。
不同复合蛋白酶的用量所对应的水解度和短肽得率的结果，见图4。由图4中可以看出：水解度和短肽得率呈先上升后下降的趋势。随着所加复合蛋白酶量的增大，所述复合蛋白酶的水解作用加强，酶解反应后水解度和短肽得率上升，但当加酶量继续增加，酶的抑制作用导致水解度和短肽得率均不同程度下降。所以选择复合蛋白酶加酶量为249～499U／g花生蛋白，最优选374U／g花生蛋白。
实施例3、考察不同酶解温度对水解度及短肽得率的影响
第一步：取热榨花生粕，加入蒸馏水，使之溶解后，得到质量浓度14％的热榨花生粕溶液；此过程保证其与蛋白酶充分接触，有利于酶解反应的进行；
第二步：调节温度到中性蛋白酶适合温度45℃，加入中性蛋白酶，加入量为5200U／g花生蛋白，在45℃的恒温水浴振荡器中反应1.5h；
第三步：第二步反应结束后，加入复合蛋白酶，加入量为374U／g花生蛋白，混合均匀，继续在45℃的恒温水浴振荡器中反应2.5h；
第四步：第三步反应结束后，90℃恒温水浴中保持10min，使中性蛋白酶和复合蛋白酶失活，4500转离心20min后取上清液，喷雾干燥得到花生肽。
不同酶解温度所对应的水解度和短肽得率的结果，见图5。由图5可以看出：酶的作用效果受到温度影响较大。一般情况下，在酶的适用温度范围内，增加反应体系的温度，则酶解的速度加快，酶解产物增多。如图5所示，在35～45℃温度范围内，水解度和短肽得率随着温度升高而增加。45℃后水解度和短肽得率随着温度的升高逐渐降低。因此，选择40～50℃作为酶解温度，45℃作为酶解最佳温度。
实施例4、考察不同酶解时间对水解度及短肽得率的影响
第一步：取热榨花生粕，加入蒸馏水，使之溶解后，得到质量浓度14％的热榨花生粕溶液；此过程保证其与蛋白酶充分接触，有利于酶解的进行；
第二步：调节温度到中性蛋白酶适合温度45℃后加入中性蛋白酶，加入量为5200U／g花生蛋白，在45℃的恒温水浴振荡器中反应若干时间，所采用的时间分别为0.5h、1.0、1.5h、2.0h、2.5h；
第三步：第二步反应结束后，加入复合蛋白酶，加入量为374U／g花生蛋白，混合均匀，继续在45℃的恒温水浴振荡器中反应若干时间，反应时间分别为：3.5h、3.0h、2.5h、2.0h、1.5h；
第四步：第三步反应结束后，在90℃恒温水浴中保持10min，使中性蛋白酶和复合蛋白酶失活，4500转离心20min后取上清液，喷雾干燥得到花生肽。
不同酶解时间所对应的水解度和短肽得率的结果，见图6。由图6可以看出：当加酶量、花生蛋白浓度和酶解温度一定时，调整复合蛋白酶加入时间，酶解效果不同。由图6可知，水解度和短肽得率在中性蛋白酶反应1.5h后加入复合蛋白酶继续反应2.5h时达到最大，因此酶解最佳时间为中性蛋白酶反应1.5h后加入复合蛋白酶继续反应2.5h。
采用上述方法制备花生肽具有以下有益效果：制备方法简单，制备条件温和，制备时间短，花生肽制备成本低，花生肽得率高，纯度高，分子量集中分布于1000Da以下；水解度达到40.55％，短肽得率达到85.20％，分子量小于1000Da占95.57％，ACE抑制活性的IC50值为0.77mg／ml。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (10)
1.一种双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将热榨花生粕与蒸馏水混合，制备质量浓度为13～15％的热榨花生粕溶液，并测定所述热榨花生粕中花生蛋白的含量；
步骤二、调节并保持所述热榨花生粕溶液的温度为40～50℃，向所述热榨花生粕溶液中加入中性蛋白酶，进行酶解反应1.5～2.0h，得到第一酶解液，其中所述中性蛋白酶的加入量根据所述热榨花生粕溶液的质量浓度及所测定的热榨花生粕中花生蛋白的含量计算得到；
步骤三、向所述第一酶解液中加入复合蛋白酶，保持温度40～50℃，进行酶解反应2.0～3.0h，得到第二酶解液，其中所述复合蛋白酶的加入量根据所述热榨花生粕溶液的质量浓度及所测定的热榨花生粕中花生蛋白的含量计算得到；
步骤四、将所述第二酶解液中的所述中性蛋白酶和复合蛋白酶灭活，离心取上清液，得到花生肽溶液。
2.如权利要求1所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法，其特征在于，步骤二中所述中性蛋白酶的酶解反应时间为1.5h，温度为45℃。
3.如权利要求2所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法，其特征在于，步骤三中所述复合蛋白酶的酶解反应时间为2.5h，温度为45℃。
4.如权利要求3所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法，其特征在于，步骤二中所述中性蛋白酶的加入量为5200～6500U／g花生蛋白，步骤三中所述复合蛋白酶的加入量为249～499U／g花生蛋白。
5.如权利要求4所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法，其特征在于，步骤二中所述中性蛋白酶的加入量为5200U／g花生蛋白，步骤三中所述复合蛋白酶的加入量为374U／g花生蛋白。
6.如权利要求5所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法，其特征在于，所述热榨花生粕中花生蛋白的含量通过凯氏定氮法测定。
7.如权利要求1所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法，其特征在于，步骤一中所述热榨花生粕溶液的质量浓度为14％。
8.如权利要求1所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法，其特征在于，步骤四中通过将所述第二酶解液升温至90～95℃，并保持该温度10～20min进行所述中性蛋白酶和复合蛋白酶的灭活；所述离心的条件为4000～4500rpm离心20～30min。
9.如权利要求1所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法，其特征在于，步骤三中所述复合蛋白酶由内切酶和外切酶组成，步骤二中所述的中性蛋白酶由枯草芽孢杆菌经过发酵提取得到。
10.如权利要求6、7或8所述的双中性蛋白酶分步酶解热榨花生粕制备花生肽的方法，其特征在于，步骤四中所得到的花生肽溶液经过干燥，制备为固体花生肽。
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