CN107723329B - 一种免疫活性花生肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种免疫活性花生肽的制备方法，包括下述步骤：（1）以冷榨花生粕和热榨花生粕为原料，并对原料进行预处理；（2）将预处理后的原料进行半干法一次酶解，得到酶解液1；（3）将酶解液1进行微生物一次发酵；（4）将一次发酵后的原料平均分成三份，分别加入无花果蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶进行同步二次酶解，得到酶解液2；（5）向酶解液2中加入复合蛋白酶，进行三次酶解，酶解后灭酶，得到酶解液3；（6）将酶解液3进行微生物二次发酵；发酵液经超滤分离、脱色、浓缩与干燥，即得到高免疫活性花生肽。本发明能有效提高产品的免疫活性，有效去除黄曲霉毒素，具有较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及花生深加工技术领域，具体涉及一种免疫活性花生肽的制备方法。
背景技术
花生是中国重要的油料作物之一，产量居世界首位，年产量约1700万吨。在我国，有少量花生被直接食用，或被制作成花生酱、炒制花生果等花生休闲食品，有大约50％-60％的花生被采用冷榨或热榨等方式制取花生油，制油后产生大量的副产物花生粕。由于冷榨方式制取的花生油油香不足，且油提取率低，因此我国的花生粕多以热榨花生粕为主，而热榨工艺使得花生蛋白热变性严重，其营养价值与功能特性均受到不同程度的影响，目前热榨花生粕大都作为动物饲料处理，产品附加值低，资源浪费严重。
花生粕内富含蛋白质，含量约40-50％。花生蛋白中富含人体必须氨基酸，具有极高的营养价值。然而，花生蛋白的溶解性、起泡性、可吸收性较差，又具有一定的致敏性，很大程度限制了其在食品工业中的应用。将花生蛋白改性形成的小分子肽，具有良好的溶解性、起泡性、可吸收性，而且致敏性低，比蛋白质和氨基酸更易消化吸收，能增强肌肉和体能，能促进肌细胞复原，能帮助机体消除疲劳，快速恢复体力，可作为优质蛋白质原料，应用于食品、保健品及特殊医疗配方食品中，因此，研发具有高生理活性的花生肽意义重大。
制备花生肽的方法主要有三类：一是通过化学试剂改性花生蛋白制备；二是通过酶法水解花生蛋白制备；三是通过微生物发酵花生蛋白制备。由于通过化学试剂改性技术制备，环境污染严重，现已很少采用。微生物发酵及酶法水解花生蛋白制备花生肽，因其技术简单、安全、高效，目前被广泛采用。在微生物发酵及酶法水解工艺中，发酵菌种的选择、发酵条件的确定及酶种类、酶解条件的确定至关重要，这些将直接影响花生肽产品的氨基酸组成、风味及生物活性。已公开专利及文献中均采用单因素及正交实验、响应面分析法等确定酶解花生蛋白最佳酶种类及酶解条件，工作量大，重复实验多，程序复杂。发酵方法普遍采用固态发酵或液态发酵对花生粕进行发酵。另外，已公开专利及文献中制备花生肽采用的花生粕原料大都为冷榨花生粕，热榨花生粕利用较少，同步以冷榨、热榨花生粕为原料制备高免疫活性花生肽未见报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种免疫活性花生肽的制备方法。
本发明所提供的免疫活性花生肽的制备方法，包括下述步骤：
(1)以冷榨花生粕和热榨花生粕为原料，并对原料进行预处理；
(2)将预处理后的原料进行半干法一次酶解，得到酶解液1；
(3)将酶解液1进行微生物一次发酵，发酵温度为30-50℃，发酵时间为1-9天；
(4)将一次发酵后的原料平均分成三份，分别加入无花果蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶进行同步二次酶解，酶解时间为3-6h；同步二次酶解结束后离心，收集上清液，将三份酶解液的上清液混合，40-60℃继续酶解1-9h，酶解结束后灭酶，得到酶解液2；
(5)向酶解液2中加入复合蛋白酶，进行三次酶解，酶解后灭酶，得到酶解液3；
(6)将酶解液3进行微生物二次发酵，发酵温度为30-50℃，发酵时间为3-6天；发酵液经超滤分离、脱色、浓缩与干燥，即得到高免疫活性花生肽。
优选的，步骤(1)中，原料预处理的方法为：将冷榨花生粕和热榨花生粕晾晒、烘干后以等质量比混合，粉碎，过30-70目筛，然后以10-30cm厚度铺开，依次紫外辐照10-60min，脉冲强光辐照10-60s。
花生产后贮存、原料处理、精深加工等过程中，均可能被霉菌污染导致黄曲霉毒素超标。如果以被黄曲霉毒素污染的花生仁榨油，15-20％的黄曲霉毒素会留在油中，80-85％的黄曲霉毒素则留在了花生粕中。因此，以花生粕为原料制备花生肽时需要对原料进行预处理，以降解原料中的黄曲霉毒素。紫外线辐照可以满足灭菌消毒的要求，但辐照时间过长会造成原料产生腐败气味；微波辐照和高剂量的射线辐照会对原料的蛋白成分造成损失；因此采用单一的方法均难以达到毒素的脱除要求。本发明在原料的预处理过程中，为去除原料中可能存在的黄曲霉毒素，本发明采用阳光下晾晒、烘干、紫外-脉冲强光辐照相结合的方法，为避免对原料的品质产生影响，本发明还对紫外辐照和脉冲强光辐照的时间进行了优选，结果发现，紫外辐照10-60min，脉冲强光辐照10-60s能够有效的降解原料中的黄曲霉毒素，同时不会对原料的品质产生影响。低于这一辐照时间，则黄曲霉毒素的降解效果不理想；高于这一辐照时间，则原料会出现腐败气味，原料中的蛋白成分也会变性或失活。
优选的，步骤(2)中，半干法一次酶解的方法为：将预处理后的原料隔水蒸煮30-60min，降温至40-70℃后向原料中加入纤维素酶和高温淀粉酶，搅拌均匀，恒温3-12h后再次隔水蒸煮60-180min，冷却至35-50℃。
优选的，步骤(3)中，微生物一次发酵所采用的发酵微生物为：面包酵母、纳豆菌和枯草芽孢杆菌以等比例混匀；发酵微生物的加入量为1-10％(质量分数)。
优选的，步骤(3)中，发酵过程中每1-6h对原料搅拌一次；发酵结束后调温至100℃灭菌15-30min。
优选的，步骤(4)中，无花果蛋白酶的加入量为1-5％(质量分数)，在60-70℃，pH4-8的条件下进行酶解；碱性蛋白酶的加入量为1-5％(质量分数)，在40-60℃，pH7-9的条件下进行酶解；中性蛋白酶的加入量为1-5％(质量分数)，在40-60℃，pH5-8的条件下进行酶解。
优选的，步骤(5)中，所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶中的任意三种以等比例混合；所述复合蛋白酶的加入量为1-10％(质量分数)。
优选的，步骤(5)中，三次酶解的pH为5-8，温度为40-60℃，酶解时间为1-9h。
优选的，步骤(6)中，微生物二次发酵所采用的发酵微生物为枯草芽孢杆菌；枯草芽孢杆菌的加入量为1-10％(质量分数)。
优选的，上述制备方法中，采用微量热-酶解离偶联技术确定半干法一次酶解、二次酶解和三次酶解的最佳酶种类及最适酶解条件；具体的，利用微量热技术分别测出中性蛋白酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶等在不同温度(30-100℃)，不同pH(pH5.0-pH9.7)时酶解花生蛋白的热功率—时间曲线，解析曲线，定量获得各酶解反应的米凯利斯常数和最大反应速率，根据获得参数确定酶种类及酶解条件。
微量热技术可以实时获取酶促反应全过程的热量变化，准确定量确定最适酶解条件，灵敏度高，操作简单，无需多次重复。本发明首次将微量热技术用于确定花生蛋白最佳用酶及最适酶解条件，取得了非常好的效果。
上述方法制备的免疫活性花生肽也是本发明的保护范围。本发明制备的花生肽的分子量集中分布于1000Da以下，其中分子量小于1000Da占99.2％；短肽得率达90.12％，水解度达40.65％；并且具有高免疫活性，吞噬细胞吞噬率可达57.31％，IgG含量可达120.03mg/100ml，NK细胞活性可达26.58％。
基于本发明制备的花生肽的高免疫活性；以及分子量小，吸收率高；不含黄曲霉毒素，安全性高的特性，本发明进一步提供了上述花生肽在制备增强免疫力的功能性医用食品、药品或保健品中的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明以冷榨、热榨花生粕为原料制备高免疫活性花生肽，解决了热榨花生粕因花生蛋白容易发生变性，不易直接应用的难题。热榨花生粕采用本发明的方法进行处理后，酶解后产物营养组成及活性功能得到了很大改善，可以安全的应用于食品加工中；而且冷榨、热榨花生粕这两种原料营养组成及生理活性优势互补，实现了花生加工副产物资源的高效利用。
(2)本发明采用阳光下晾晒、烘干及紫外-脉冲强光辐照技术对原料进行预处理，可有效降解原料中的黄曲霉毒素。
(3)本发明采用微量热-酶解离偶联技术确定催化花生蛋白酶解的最佳酶种类及最适酶解条件，可定量获得试验结果，技术准确度高、操作简单，无需多次重复，节省人力物力。
(4)本发明采用半干法-微发酵偶联技术协助酶解，可协同降解原料中的黄曲霉毒素，可提高原料的酶解度，可有效脱除苦味，提高花生肽产物得率。
(5)本发明制备的高免疫活性花生肽分子量小，吸收率高，具有显著的免疫活性，不含黄曲霉毒素。吞噬细胞吞噬率可达57.31％，IgG含量可达120.03mg/100ml，NK细胞活性可达26.58％。
(6)本发明技术方案无污染，成本低，产品安全、无毒、无副作用，具有较高的推广价值，可产生较高经济价值和社会效益，其前景非常广阔。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本文中使用“质量分数”用于表示酶或发酵微生物的加入量；所述“质量分数”是指酶或发酵微生物的加入量占反应原料的质量比。
正如背景技术中所介绍的，目前对于热榨花生粕的利用率很低，存在严重的资源浪费；而且在微生物发酵及酶法水解制备花生肽时，对于酶种类、酶解条件的优化费时费力；发酵普遍采用固态发酵或液态发酵，降解黄曲霉毒素所需时间较长。基于此，本发明提出了一种新的高免疫活性花生肽的制备方法，同步以冷榨花生粕和热榨花生粕作为原料，采用微量热-酶解离偶联技术确定催化花生蛋白酶解的最佳酶种类及最适酶解条件，采用半干法-微生物发酵偶联技术协助酶解，制备得到了具有高免疫活性的花生肽。
在本发明的一个实施方案中，给出的高免疫活性花生肽的制备方法如下：
1.微量热-酶解离偶联技术确定制备花生肽最适酶解条件。
利用微量热技术分别测出中性蛋白酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、胃蛋白酶等在不同温度(30-100℃)，不同pH(pH5.0-pH9.7)时酶解花生蛋白的热功率—时间曲线，解析曲线，定量获得各酶解反应的米凯利斯常数和最大反应速率，据获得参数确定酶种类及酶解条件。
2.原料预处理
将冷榨花生粕、热榨花生粕阳光下晾晒、烘干后等质量比混合，入粉粹机粉碎，过30-70目筛子后，10-30厘米厚度铺开，依次紫外辐照10-60分钟，脉冲强光辐照10-60秒。
3.制备高免疫活性花生肽
a.半干法一次酶解
上述预处理后的原料100℃隔水蒸煮30-60分钟，降温至40-70℃后向原料中加入纤维素酶及高温淀粉酶等比例混匀(质量分数1-10％，即纤维素酶和高温淀粉酶的加入量占预处理后原料重量的1-10％)，搅拌均匀，恒温3-12小时后再次入蒸锅100℃隔水蒸煮60-180分钟，冷却至35-50℃。
b.微生物一次发酵
原料经半干法一次酶解后放入发酵罐内，加入面包酵母、纳豆菌、枯草芽孢杆菌等比例混匀(质量分数1-10％)，30-50℃恒温发酵1-9天，每1-6小时对原料搅拌一次。发酵结束后调温至100℃灭菌15-30分钟。
c.三种蛋白酶同步二次酶解
发酵罐内原料三等分后，分别入n1，n2，n3三个酶解罐内进行一次酶解。n1,n2,n3罐内料液比相同均为1：(10-25)，n1内加入无花果蛋白酶(质量分数1-5％，即无花果蛋白酶的加入量为酶解罐内原料重量的1-5％)混匀，pH值4-8，恒温60-70℃；n2内加入碱性蛋白酶(质量分数1-5％，即碱性蛋白酶的加入量为酶解罐内原料重量的1-5％)混匀，pH值7-9，恒温40-60℃；n3内加入中性蛋白酶(质量分数1-5％，即中性蛋白酶的加入量为酶解罐内原料重量的1-5％)混匀，pH值为5-8，恒温40-60℃；三罐同步酶解3-6小时，酶解结束后离心，收集三罐内上清液入酶解罐内混匀后恒温40-60℃继续酶解1-9小时，酶解结束100℃灭酶15-30分钟。
d.复合蛋白酶三次酶解
三种蛋白酶同步酶解所得溶液内加入质量分数比为(1-10)％的复合蛋白酶(复合蛋白酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶中的三种等比例混合)，罐内pH值为5-8，恒温40-60℃，进行复合蛋白酶三次酶解，酶解时间1-9小时，酶解结束后100℃灭酶15-30分钟。
e.微生物二次发酵
第三次酶解所得溶液灭酶后入发酵罐，进行二次发酵。溶液内加入枯草芽孢杆菌(质量分数1-10％)混匀，30-50℃恒温发酵3-6天，发酵结束后100℃灭菌15-30分钟。
f.二次发酵后溶液经超滤分离、脱色、浓缩与喷雾干燥获得所述高免疫活性花生肽。
本发明的花生肽制备方法中，各步骤相辅相成，缺一不可。其中，原料的预处理步骤与半干法酶解和微生物发酵偶联步骤协同作用，能够将原料中的黄曲霉毒素完全降解，制备的花生肽中不含黄曲霉毒素，保证了制备的花生肽的安全性；通过三次酶解结合两次微生物发酵过程，能够极大的改善花生粕原料中，特别是热榨花生粕原料中的营养组成及活性功能，使所得花生肽的分子量集中分布于1000Da以下，短肽得率和水解度得到大幅提高，更易被人体吸收利用。
另外，水解蛋白质的酶种类繁多，而且各种酶的水解能力差异很大，因此正确选择合适水解花生蛋白的酶类，是生产具有高免疫活性花生肽的关键。对于酶种类的选择及酶解条件的确定，传统方法多采用单因素及正交实验，以及响应面分析法等，工作量大、重复实验多，程序复杂。本发明首次利用微量热技术确定酶解花生蛋白的最佳用酶以及最适酶解条件，无需多次重复，大大简化了实验操作。
利用本发明优化后得到的酶解条件(包括酶的种类、用量、酶解温度、pH等)能够最大程度的提高原料的酶解度。在试验过程中发现，在本发明酶解条件的基础上进行调整，则原料的酶解度都会出现不同程度的下降。
花生蛋白在未水解前其疏水性基团都包含在分子内部，从而不会呈现出苦味。然而，花生蛋白经酶水解后其疏水性氨基酸残基暴露出来，得到的花生肽往往带有较明显的苦味。常用的脱苦方法，如疏水吸附、溶剂油提等会造成活性的大量损失；利用外切酶将位于肽链端基的疏水性氨基酸残基切除，虽然可有效减少花生肽的苦味，但成本较高。本发明通过两次微生物发酵协助酶解，有效脱除了制备的花生肽的苦味，无活性的损失，无需额外加入外切酶，降低了生产成本。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
其中，纤维素酶(宁夏夏盛实业集团有限公司)、高温淀粉酶(宁夏夏盛实业集团有限公司)；无花果蛋白酶(上海源叶生物科技有限公司)、碱性蛋白酶(丹麦诺维信公司)、中性蛋白酶(丹麦诺维信公司)、木瓜蛋白酶(上海源叶生物科技有限公司)、菠萝蛋白酶(南宁庞博生物工程有限公司)、胰蛋白酶(南宁庞博生物工程有限公司)、胃蛋白酶(南宁庞博生物工程有限公司)、风味蛋白酶(南宁庞博生物工程有限公司)，面包酵母(安琪酵母股份有限公司)、纳豆菌(中山市纳豆微生物制品有限公司)、枯草芽孢杆菌(江苏绿科生物技术有限公司)。
实施例1：高免疫活性花生肽的制备
1.微量热-酶解离偶联技术确定制备花生肽最适酶解条件。
2.原料预处理
冷榨花生粕、热榨花生粕阳光下晾晒、烘干后等质量比混合，入粉粹机粉碎，过60目筛子后10厘米厚度铺开，依次紫外照射30分钟，脉冲强光辐照三次，每次10秒。
3.制备高免疫活性花生肽
a.半干法一次酶解
上述原料100℃隔水蒸煮40分钟，降温至50℃后向原料中加入等比例混合的纤维素酶及高温淀粉酶(质量分数5％)，搅拌均匀，恒温7小时后再次入蒸锅100℃隔水蒸煮120分钟，蒸煮结束冷却至43℃。
b.微生物一次发酵
原料经半干法一次酶解后入发酵罐，而后加入面包酵母、纳豆菌、枯草芽孢杆菌等比例混匀(质量分数3％)，40℃恒温发酵3天，每3个小时对原料搅拌一次。发酵结束后调温至100℃灭菌15分钟。
c.三种蛋白酶同步二次酶解
发酵罐内原料三等分后，分别入n1,n2,n3三个酶解罐内进行同步酶解。n1,n2,n3罐内料液比相同均为1：15，n1内加入质量分数5％无花果蛋白酶混匀，pH值7，恒温60℃；n2内加入质量分数5％碱性蛋白酶混匀，pH值8.6，恒温55℃；n3内加入质量分数5％中性蛋白酶混匀，pH值为7，恒温50℃；三罐同步酶解3小时，酶解结束后离心，收集三罐内上清液入酶解罐内混匀后恒温60℃继续酶解3小时，酶解结束100℃灭酶15分钟。
d.复合蛋白酶三次酶解
二次酶解所得溶液内加入质量分数为3％的复合蛋白酶(复合蛋白酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶等比例混合)，罐内pH值为6，恒温45℃，进行第三次酶解，酶解时间3小时，酶解结束后100℃灭酶15分钟。
e.微生物二次发酵
第三次酶解所得溶液灭酶后入发酵罐，进行二次发酵。酶解溶液内加入枯草芽孢杆菌(质量分数5％)混匀，40℃恒温发酵3天，发酵结束后100℃灭菌15分钟。
f.二次发酵后溶液依次进行超滤分离、脱色、浓缩与喷雾干燥，获得所述高免疫活性花生肽。
对比例1：
1.原料预处理
冷榨花生粕、热榨花生粕阳光下晾晒、烘干后等质量比混合，入粉粹机粉碎，过60目筛。
2.制备花生肽
a.半干法一次酶解
上述原料100℃隔水蒸煮40分钟，降温至50℃后向原料中加入等比例混合的纤维素酶及高温淀粉酶(质量分数5％)，搅拌均匀，恒温7小时后再次入蒸锅100℃隔水蒸煮120分钟，蒸煮结束冷却至43℃。
b.微生物一次发酵
原料经半干法一次酶解后入发酵罐，而后加入面包酵母、纳豆菌、枯草芽孢杆菌等比例混匀(质量分数3％)，40℃恒温发酵3天，每3个小时对原料搅拌一次。发酵结束后调温至100℃灭菌15分钟。
c.二次酶解
发酵罐内原料加入质量分数为3％的复合蛋白酶(复合蛋白酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶等比例混合)，罐内pH值为6，恒温45℃，进行第三次酶解，酶解时间3小时，酶解结束后100℃灭酶15分钟。
d.微生物二次发酵
第二次酶解所得溶液灭酶后入发酵罐，进行二次发酵。酶解溶液内加入枯草芽孢杆菌(质量分数5％)混匀，40℃恒温发酵3天，发酵结束后100℃灭菌15分钟。
e.二次发酵后溶液依次进行超滤分离、脱色、浓缩与喷雾干燥，获得花生肽。
对比例2：
1.原料预处理
冷榨花生粕、热榨花生粕阳光下晾晒、烘干后等质量比混合，入粉粹机粉碎，过60目筛子后10厘米厚度铺开，依次紫外照射30分钟，脉冲强光辐照三次，每次10秒。
2.制备高免疫活性花生肽
a.一次酶解
将预处理后的原料在酶解罐内进行酶解，罐内的料液比为1:15，加入等比例混合的纤维素酶及高温淀粉酶(质量分数5％)，搅拌均匀，恒温7小时。
b.微生物一次发酵
原料经一次酶解后入发酵罐，而后加入面包酵母、纳豆菌、枯草芽孢杆菌等比例混匀(质量分数3％)，40℃恒温发酵3天，每3个小时对原料搅拌一次。发酵结束后调温至100℃灭菌15分钟。
c.复合蛋白酶二次酶解
二次酶解所得溶液内加入质量分数为3％的复合蛋白酶(复合蛋白酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶等比例混合)，罐内pH值为6，恒温45℃，进行第三次酶解，酶解时间3小时，酶解结束后100℃灭酶15分钟。
d.二次酶解后溶液依次进行超滤分离、脱色、浓缩与喷雾干燥，获得花生肽。
试验例1：花生肽理化指标测定
分别测定实施例1、对比例1和对比例2制备的花生肽的短肽得率(三氯乙酸可溶性氮法)、水解度(邻苯二甲醛法)和分子量分布(高效液相色谱法)，结果见表1。
表1：花生肽理化指标测定结果
| 组别 | 短肽得率 | 水解度 | 分子量小于1000Da占比 |
| 实施例1 | 90.12％ | 40.65％ | 99.2％ |
| 对比例1 | 81.35％ | 34.26％ | 82.3％ |
| 对比例2 | 75.64％ | 31.58％ | 78.5％ |
采用黄曲霉毒素B1ELISA检测试剂盒分别对实施例1、对比例1和对比例2制备的花生肽的黄曲霉毒素含量进行检测。结果为：实施例1制备的花生肽中未检出黄曲霉毒素B1；对比例1制备的花生肽中黄曲霉毒素B1的含量为11.3ppb；对比例2制备的花生肽中黄曲霉毒素B1的含量为5.4ppb。
采用7人感官评价小组分别对实施例1、对比例1和对比例2制备的花生肽的苦味进行评定。结果为：实施例1制备的花生肽无苦味；对比例1和对比例2制备的花生肽均存在一定的苦味。
试验例2：花生肽免疫活性试验
将实验动物小鼠预饲3d后，按体重随机分组，将小鼠分成对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。
对照组一定剂量的生理盐水；
低剂量组给予实施例1制备的花生肽，给予量为100mg/(kg.d)；
中剂量组给予实施例1制备的花生肽，给予量为200mg/(kg.d)；
高剂量组给予实施例1制备的花生肽，给予量为300mg/(kg.d)；
分别考察花生肽对小鼠免疫器官重量、IgG含量、脾细胞NK活性以及巨噬细胞吞噬功能的影响，结果分别见表2-表5。
表2高免疫活性花生肽对小鼠免疫器官重量指数的影响(
注:*表示p<0.05,**表示p<0.01,与对照组比较
表3高免疫活性花生肽对正常小鼠IgG含量的影响
表4高免疫活性花生肽对正常小鼠脾细胞NK活性的影响
表5高免疫活性花生肽对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响
由表2-5可以看出，本发明制备的花生肽具有高免疫活性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种免疫活性花生肽的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
（1）以冷榨花生粕和热榨花生粕为原料，并对原料进行预处理；
（2）将预处理后的原料进行半干法一次酶解，得到酶解液1；
（3）将酶解液1进行微生物一次发酵，发酵温度为30-50℃，发酵时间为1-9天；
（4）将一次发酵后的原料平均分成三份，分别加入无花果蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶进行同步二次酶解，酶解时间为3-6h；同步二次酶解结束后离心，将三份酶解液的上清液混合，40-60℃继续酶解1-9h，酶解结束后灭酶，得到酶解液2；
（5）向酶解液2中加入复合蛋白酶，进行三次酶解，酶解后灭酶，得到酶解液3；
（6）将酶解液3进行微生物二次发酵，发酵温度为30-50℃，发酵时间为3-6天；发酵液经超滤分离、脱色、浓缩与干燥，即得到高免疫活性花生肽；
步骤（1）中，原料预处理的方法为：将冷榨花生粕和热榨花生粕晾晒、烘干后以等质量比混合，粉碎，过30-70目筛，然后以10-30cm厚度铺开，依次紫外辐照10-60min，脉冲强光辐照10-60s；
步骤（2）中，半干法一次酶解的方法为：将预处理后的原料隔水蒸煮30-60min，降温至40-70℃后向原料中加入纤维素酶和高温淀粉酶，搅拌均匀，恒温3-12h后再次隔水蒸煮60-180min，冷却至35-50℃；
步骤（3）中，微生物一次发酵所采用的发酵微生物为：以等比例混匀的面包酵母、纳豆菌和枯草芽孢杆菌；发酵微生物加入的质量分数为1-10%；
步骤（4）中，无花果蛋白酶的加入质量分数为1-5%，在60-70℃，pH4-8的条件下进行酶解；碱性蛋白酶加入的质量分数为1-5%，在40-60℃，pH7-9的条件下进行酶解；中性蛋白酶加入的质量分数为1-5%，在40-60℃，pH5-8的条件下进行酶解；
步骤（5）中，所述复合蛋白酶为木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶等比例混合；所述复合蛋白酶的加入质量分数为1-10%；
步骤（5）中，三次酶解的pH为5-8，温度为40-60℃，酶解时间为1-9h；
步骤（6）中，微生物二次发酵所采用的发酵微生物为枯草芽孢杆菌；枯草芽孢杆菌加入的质量分数为1-10%。
2.权利要求1所述的方法制备得到的花生肽。
3.权利要求2所述的花生肽在制备增强免疫力的药品或保健品中的应用。
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