CN110915980B - 一种葵花盘肽粉、及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种葵花盘肽粉、及其制备方法和应用。该葵花盘肽粉的主要通过预处理、酶解处理、除杂、浓缩和后处理的步骤来得到最终产品。预处理过程中将葵花盘通过酒精和水分步溶剂处理，脱除葵花盘中的单宁、植酸等抗营养因子和胶质、糖类等干扰物质，得到适合于后续操作所需的葵花盘的初粕。酶解处理主要是通过中性蛋白酶和碱性蛋白酶对失活的蛋白进行降解，获得高F值低聚肽。对进入溶液中的高F值低聚肽进行收集、除菌、干燥和包装，并最终形成产品。本发明提取的葵花盘肽粉具备作为功能氨基酸饮料的前景，能够应用于食品领域。
Description
技术领域
本发明涉及活性多肽领域，尤其是一种葵花盘肽粉、及其制备方法和应用。
背景技术
葵花盘性平、味甘、归肝经，主要功能有清热平肝、止痛、止血，主治头痛头晕、高血压、关节炎等，其水煎液具有治疗肿瘤的作用，其提取物也有一定的降压作用。中国专利申请CN201510589245.7公开了一种葵花盘水解复合粉剂在制备预防、缓解或治疗与血尿酸水平升高相关疾病的食品、药物或食品及药物组合物中的应用，并指出葵花盘水解复合粉剂不仅具有潜在的预防动物体内血尿酸升高的作用，同时还具有降低血中已经形成高尿酸水平的潜在性作用。众所周知，形成痛风石的两个主要原因是尿酸高，以及肾脏代谢障碍。要想在治疗痛风上有所突破，需要解决三个难题：第一个是快速安全降尿酸；第二个是稳定尿酸溶解痛风石；第三就是不伤肝、不伤肾。想要满足这三点，葵花盘提取物中，小分子肽至关重要，且相关研究表明，葵花盘小分子肽不仅可以把体内嘌呤的比例降解到相对正常的范围，对尿酸的产生进行基因调节，还可以有效调节在尿酸排出过程中肾脏所需蛋白酶的活性，对于基因缺失的DNA进行有效修补。在生物技术领域中，小分子肽是目前发现的级别最小活性最强的肽，可以主动被吸收、快速地全面吸收。而我国是向日葵的种植大国，葵花盘的资源丰富，但人们往往在收获向日葵时只收集葵花籽，将葵花盘作为废弃物当燃料烧掉，亦或是作为牲畜饲料，并没有发挥出其更大的经济效益和医疗作用，造成资源浪费。
高F值低聚肽的特殊构成(高支低芳)具有特殊的生理功能。中的高F值是支链氨基酸与芳香族氨基酸含量的摩尔数比值，支链氨基酸(Branched chain amino acids，BCAA)犹如Leu、Ile、Val，是碳链中具有分支的氨基酸，主要在肌肉中代谢成为糖或者酮，Val是生糖氨基酸，Leu是生酮氨基酸，Ile是生糖兼生酮氨基酸。支链氨基酸通过生糖与生酮作用与三羧酸循环相互联系，实现机体内三大物质糖、脂肪、蛋白质的互相转化。芳香族氨基酸(Aromatic amino acids，AAA)如Phe、Tyr、Trp在肝脏代谢，当肝脏发生病变时，AAA的同化受阻，而BCAA的氧化加速，因此，肝脏病人必然产生BCAA缺乏和AAA过多症，造成高芳低支的病态血液模式。通过补充F值大于20的高F值低聚肽可有效缓解机体能量的缺失，补充三羧酸循环所需能量，缓解疲劳。现有技术中，未见有葵花盘的小分子肽中含有高F值低聚肽的报道，也没有发现其对改善机体能量损失，缓解疲劳的功效报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种葵花盘肽粉、及其制备方法和应用，通过该制备方法获得获得的葵花盘肽粉，具有抗疲劳功效。
本发明提供的技术方案如下：
一种葵花盘肽粉的制备方法，包括以下步骤：
(1)预处理：选择经筛选过的葵花盘，粉碎，过筛，得到的粉末按料液比1:6～1:10质量体积比加入至60％-75％酒精中，80-100℃浸泡15-30min，浸泡液固液分离后取沉淀；经60％-75％酒精浸泡处理后得到的沉淀以1:10～1:40的质量体积比加入至去离子水中，80-100℃浸泡1-1.5h，去水后得到初粕；
(2)酶解：将所述初粕按料液质量体积比1:6～1:10加入至去离子水中，调节pH至7-10，升温到45-70℃，添加第一酶至为葵花盘原料粉末重量的0.1％-5％，酶解时间为1-8h，酶解结束后灭酶处理，固液分离后得到第一灭酶液；
(3)浓缩：将所述第一灭酶液进行浓缩处理，浓缩到原体积的0.2-0.7倍，得到浓缩液；
(4)后处理：将所述浓缩液进行除菌、喷雾干燥和包装，得到最终葵花盘肽粉。
本发明还提供了一种葵花盘肽粉。
本发明还提供了一种葵花盘肽粉在生产功能性饮料中的应用。
本发明提供的技术方案至少包括以下有益效果：
1、本发明提供的产品中多肽含量为68.2-85.1％之间，显著高于对比例的45.6-52.0％；产品F值为68.5-75.2，亦显著高于对比例的15.3-25.0，说明通过本发明的提取方法能够获得高含量的葵花盘肽，并且具备高F值，深层次开发了葵花盘肽的多肽资源。
2、本发明提供的方法制备的葵花盘肽具有较好的稳定性，能完全溶解于水，经分子量检测，分子量主要分布在500D以下，归属于寡肽，在人体内可直接吸收。
3、本发明制备的葵花盘肽粉F值高，使得其支链氨基酸易被机体吸收，因而在维持机体氮平衡和三羧酸循环提供能量方面有特殊的意义，通过小鼠抗疲劳试验说明本发明提取的葵花盘肽粉具备作为功能氨基酸饮料的前景，能够应用于食品领域。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明保护的范围。
一、葵花盘肽粉的制备
为获得满足要求的葵花盘肽粉，将经筛选的葵花盘(无霉变腐败)经过预处理、酶解处理、除杂、浓缩和后处理的步骤来得到最终产品。
预处理过程为葵花盘的初步处理过程，将新鲜未腐败霉变的葵花盘经过粉碎成粉末，过筛，再于80-100℃通过酒精和水分步溶剂处理，脱除葵花盘中的单宁、植酸等抗营养因子和胶质、糖类等干扰物质，得到适合于后续操作所需的葵花盘的初粕。
酶解处理：主要是通过中性蛋白酶和碱性蛋白酶对初粕中的蛋白进行降解，获得高F值低聚肽。在酶解处理前，可进行初步酶解处理，进一步去除残留的胶质和糖类物质。灭酶处理后的固液分离处理，可以采取离心方式，主要为了去除无法酶解的固体杂质，而经过初步酶解和酶解二次酶解过程，能够最大程度提取和酶解葵花盘肽，经进入溶液中的高F值低聚肽进行收集、除菌、干燥和包装，并最终形成产品。
一种葵花盘肽粉的制备方法，具体通过以下步骤制备而成：
(1)预处理：选择经筛选过的葵花盘，粉碎，过筛，得到的粉末按料液比1:6～1:10质量体积比加入至60％-75％酒精中，80-100℃浸泡15-30min，浸泡液固液分离后取沉淀，沉淀再经60％-75％酒精浸泡，如此浸泡2-3次；经60％-75％酒精浸泡处理后得到的沉淀以1:10～1:40的质量体积比加入至去离子水中，80-100℃浸泡1-1.5h，经水浸泡1-2次后，去水后得到初粕；优选地，经60％-75％酒精浸泡处理3次，再经水浸泡处理1次；
(2)酶解：将所述初粕按料液比1:6～1:10加入至去离子水中，用氢氧化钠或氢氧化钙或氨水将变性溶液调节pH到7-10，升温到45-70℃，添加第一酶，添加比例为葵花盘原料粉末重量的0.1％-5％，酶解时间为1-8h，酶解结束后调节pH至5-7，然后升温到90-95℃灭酶15min以上，固液分离后得到第一灭酶液；
(3)浓缩：将第一灭酶液进行浓缩处理，浓缩到原体积的0.2-0.7倍，得到浓缩液；
(4)后处理：将浓缩液进行除菌、干燥和包装，得到最终成品，成品用PE袋+铝箔袋，密封遮光，贮存于干燥、阴凉、通风良好的地方。其中，除菌处理为，100℃处理30min，或105℃处理20min，或0.22μm滤芯除菌过滤。
在本发明提供的葵花盘肽粉的制备方法中，还包括于步骤(1)和步骤(2)之间的初步酶解处理。
具体的，初步酶解处理具体为：将初粕以料液质量体积比1:6～1:10加入至去离子水中，用食品级盐酸或磷酸调节pH到4-7，升温到45-60℃，添加第二酶，添加比例为葵花盘原料粉重量的0.1％-1％，酶解时间为1-8h，酶解结束后升温到90-95℃灭酶15min以上，固液分离得到第二灭酶液和精粕；精粕再作为原料进行步骤(2)的处理。
第一酶为中性蛋白酶M1和/或碱性蛋白酶M2。第一酶包括中性蛋白酶M1和碱性蛋白酶M2，且第一酶中的中性蛋白酶M1的含量为80％-91％。
中性蛋白酶M1，可以列举如解淀粉芽孢杆菌蛋白酶M10、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶M11、热解蛋白芽孢杆菌蛋白酶M12、蜡状芽孢杆菌蛋白酶M13、巨大芽孢杆菌蛋白酶M14、灰色链霉菌蛋白酶M15、米曲霉蛋白酶M16、铜绿色假单胞菌蛋白酶M17、溶组织梭状芽孢杆菌蛋白酶M18。
碱性蛋白酶M2，可以列举如糜碱性蛋白酶M20、枯草杆菌碱性蛋白酶M21、面包酵母碱性蛋白酶M22、灰色链霉菌碱性蛋白酶M23、直丝链霉菌蛋白酶24、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶M25。
第二酶M3为果胶酶M30、纤维素酶M31、半纤维素酶M32、木聚糖酶M33、α-淀粉酶M34、植酸酶M35、阿拉伯聚糖酶M36和β-葡聚糖酶M37中的一种或几种。
步骤(4)中的干燥处理方式优选为喷雾干燥，干燥进风温度150-220℃，出风温度75-100℃。向所述除菌后的待干燥液体中添加10％-100％质量比的麦芽糊精，作为稀释剂和保护剂。
通过上述步骤得到9个实施例1-9样品，其处理过程中的参数分别不同，实施例1-9和对比例1经过初步酶解和酶解步骤，对比例2和对比例3没有经过了初步酶解步骤。
采用高效液相色谱法测定产品中葵花盘肽的含量。
支链氨基酸在220nm处有特定吸收峰，用紫外分光光度计进行检测。芳香族氨基酸在280nm处有特定吸收峰，用紫外分光光度计进行检测。
采用高效液相色谱仪及氨基酸分析柱测定产品的氨基酸组成。离子交换柱：Sopium amino acid analysis,4.0×150mm；OPA柱后衍生，衍生剂0.4ml/min,荧光检测VARIAN 363，激发波长ex：338nm,发射波长ex：425nm；进样条件：标准样0.25μL,取水解液1mL稀释至10m L，进样10μL。柱条件：A相，0.2mol/L柠檬酸钠，pH3.0；B相，0.2mol/L硼酸钠，pH9.8。柱温60℃，时间32min,0-100％的B线性梯度。F值＝BCAA/AAA。
结果列于表1中。对比例1相对于实施例9，虽然其采用了初步酶解的步骤，但是其酶解步骤采用的是木瓜酶，使得其最终的产品肽含量和产品F值均不如实施例9。实施例1的产品肽含量和产品F值均为最大，分别为85.1％和75.2，均高于实施例9。本发明提供的产品中葵花盘多肽含量为68.2-85.1％之间，显著高于对比例的45.6-52.0％；最终葵花盘肽产品F值为68.5-75.2，亦显著高于对比例的15.3-25.0，说明通过本发明的提取方法能够获得高含量的葵花盘肽，并且具备高F值，深层次开发了葵花盘肽的多肽资源。
表1 葵花盘肽粉的制备
葵花盘肽粉的分子量测定：采用Aglient1100系列液相色谱仪测定产品的分子量分布。色谱柱：TSK G2000SWXL，流动相:乙腈:水:三氟乙酸＝20:80:0.1，流速：0.8ml/min，进样量：5μl，检测波长：220nm，样品浓度：1mg/ml。标准品：1.细胞色素C，分子量12384D；2.胰岛素，分子量5733D；3.杆菌肽，分子量1422D；4.甘氨酸–甘氨酸–酪氨酸–精氨酸，分子量为451.5D；5.四个氨基酸组成的四肽，分子量为450D。所用常溶剂乙腈为色谱纯，三氟乙酸为分析纯。
结果如表2所示。本发明方法下生产的葵花盘肽具有较好的稳定性，能完全溶解于水，经分子量检测，分子量主要分布在500D以下，归属于寡肽，在人体内可直接吸收。
表2 葵花盘肽粉的分子量分布
| 分子量范围D | 峰面积百分比(％，λ＝220nm) | 数均分子量D |
| ＞5000 | 0.87 | 9068 |
| ＞3000 | 0.79 | 3845 |
| 3000--2000 | 0.95 | 2435 |
| 2000--1000 | 2.79 | 1384 |
| 1000--500 | 5.21 | 691 |
| 500--180 | 16.01 | 300 |
| ＜180 | 73.38 | 58 |
二、葵花盘肽粉的抗疲劳性能
一)试验
分组：根据不同饮料进行试验，分为试验饮料组(Y1)，汽水饮料组(Y2)和纯水组(Y3)，其中，Y1组为分别将上述实施例1-9和对比例1-3的成品葵花盘肽粉取50mg溶于1L水中配制。
喂食：试验采用BALB/C近交小鼠，小鼠体质量15-18g，将上述Y1组中每一样品对应对应5只雄性、5只雌性小鼠；2只雄性、2只雌性小鼠喂食汽水饮料(Y2组)，2只雄性、2只雌性小鼠喂食纯净水(Y3组)；每只喂食1mL，30min后进行试验，以评价葵花盘肽粉的抗疲劳对小鼠的抗疲劳性能。
试验前处理：将全部各组小鼠间断性地暴露于模拟高温条件的30℃保温箱中处理40min，每日3次，供处理15d，进行高温适应处理。然后再分别进行各项试验。
高温适应前后各组小鼠体质量变化的测定：分别称量每只小鼠在高温适应前和高温适应前后的体质量，计算平均净增量和平均增量率。
高温适应后运动试验：采用游泳法进行试验，即将高温适应后的小鼠置于水温20±1℃的水池中，游泳40min。分别测定小鼠在运动前、运动后0min、运动15min后和运动后30min 4种状态下的血糖与血乳酸含量，以断尾法采血，用血糖检测仪测定血糖含量，用Barker和Summerson氏法测定血乳酸含量。
高温适应后耐疲劳试验：每只小鼠尾部负体质量4％的物体，置于20±1℃的水池中进行负重游泳，记录小鼠从放入水中开始游泳到下沉于水中20s内不再浮出水面的时间。
高温适应后小鼠耐缺氧性试验：取各组小鼠5只雄性和5只雌性小鼠，在容积为4000cm3的密闭容器中，记录小鼠的死亡时间。
二)结果
在高温环境下，小鼠饮用本发明提取的葵花盘肽粉配制的饮料15d后，平均净增量最大为5.79±0.43g/只，增量率为42.36％(表3)，显著高于对照饮料组Y2和Y3(P<0.01)，说明本发明提取的葵花盘钛饮料能及时补充高温环境下小鼠的营养需要，促进小鼠生长和体质的增强。
从耐疲劳性试验结果可见(表3)，试验组小鼠负质游泳后平均存活时间均显著高于对照组(P<0.01)，其中实施例1对应的Y1组平均存活时间为52.32±0.43min，试验组小鼠从试验饮料中获得营养，提升身体运动耐力，使得使疲劳现象推迟出现。
缺氧是-种劣性刺激，影响机体各种代谢，特别是机体氧化供能，从而导致机体心、脑等质量要器官供能不足而死亡。试验组小鼠在缺氧环境中的存活时间显著高于对照组小鼠(P<0.05)(表3)，其中实施例1对应的Y1组平均存活时间为52.32±0.43min，说明试验饮料提高了机体血氧的利用率，降低了耗氧量，改善了机体缺氧状态，从而使之在缺氧条件下的存活时间显著延长。
表3 BALB/C近交小鼠的高温适应抗疲劳性能
表4显示了小鼠运动前后血糖与血乳酸的变化情况。试验组Y1小鼠的血糖含量于运动前，运动后0min、15min和30min时均显著高于对照组Y2和Y3(P<0.05)(表4)，说明试验组小鼠机体糖原贮量高，并在运动过程中能够长时间维持较高的血糖水平，延缓了疲劳的发生。通过对3组小鼠的比较可看出，运动前三组的血乳酸水平无显著性差别(P>0.05)，运动后0min、15min和30min时，试验组小鼠的血乳酸含量均显著低于对照组(P<0.05)(表4)，说明在运动后试验组小鼠疲劳程度低，在疲劳恢复期血乳酸清除代谢快，有氧代谢能力强，能迅速消除疲劳。
表4 BALB/C近交小鼠运动抗疲劳性能
由于支链氨基酸是唯一能在骨胳肌氧化供能的氨基酸，其在肌肉中代谢成为糖或酮，为机体提供能量，并可可弥补应激时胰岛素拮抗所致的葡萄糖和脂肪利用受限；支链氨基酸还可抑制肌肉蛋白质的分解，使总蛋白的合成增加。在高温环境下，机体在尿液、汗液和粪便中的排氮量显著增加，使机体蛋白质和氮的损失加剧，而出现氮的负平衡。由上述小鼠试验亦可看出，试验饮料中的支链氨基酸易被机体吸收，因而在维持机体氮平衡方面有特殊的意义，说明本发明提取的葵花盘肽粉具备作为功能氨基酸饮料的前景，应用于食品领域。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种葵花盘肽粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 预处理：选择经筛选过的葵花盘，粉碎，过筛，得到的粉末按料液比1:6~1:10质量体积比加入至60%-75%酒精中，80-100℃浸泡15-30min，浸泡液固液分离后取沉淀；经60%-75%酒精浸泡处理后得到的沉淀以1:10~1:40的质量体积比加入至去离子水中，80-100℃浸泡1-1.5h，去水后得到初粕；
(2) 酶解：将所述初粕按料液质量体积比1:6~1:10加入至去离子水中，调节pH至7-10，升温到45-70℃，添加第一酶至为葵花盘原料粉末重量的0.1%-5%，酶解时间为1-8h，酶解结束后灭酶处理，固液分离后得到第一灭酶液；
(3) 浓缩：将所述第一灭酶液进行浓缩处理，浓缩到原体积的0.2-0.7倍，得到浓缩液；
(4) 后处理：将所述浓缩液进行除菌、喷雾干燥和包装，得到最终葵花盘肽粉；
还包括于所述步骤(1)和所述步骤(2)之间的初步酶解，所述初步酶解处理为：将所述初粕以料液质量体积比1:6~1:10加入至去离子水中，调节pH至4-7，升温到45-60℃，添加第二酶，添加比例为葵花盘原料粉重量的0.1%-1%，酶解时间为1-8h，酶解结束后灭酶处理，固液分离后得到第二灭酶液和精粕；所述精粕再作为原料进行步骤(2)的处理；
所述第一酶为中性蛋白酶和/或碱性蛋白酶；所述第二酶为果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、α-淀粉酶、植酸酶、阿拉伯聚糖酶和β-葡聚糖酶中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的葵花盘肽粉的制备方法，其特征在于，所述第一酶包括中性蛋白酶和碱性蛋白酶，且所述第一酶中的所述中性蛋白酶的含量为80%-91%。
3.根据权利要求1所述的葵花盘肽粉的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，葵花盘经粉碎过筛后的粉末，经60%-75%酒精浸泡处理2-3次后，再经水浸泡处理1-2次。
4.根据权利要求1所述的葵花盘肽粉的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的除菌处理为，100℃处理30min，或105℃处理20min，或0.22μm滤芯除菌过滤。
5.权利要求1-4任一项所述制备方法得到的葵花盘肽粉。
6.权利要求1-4任一项所述的葵花盘肽粉在生产功能性饮料中的应用。
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