CN109439717B - 一种小分子黄精多肽的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种小分子黄精多肽的提取方法，包括以下步骤：步骤一、将黄精切片，加入纯化水，搅拌均匀，煎煮，得煎煮混合物；步骤二、将所述煎煮混合物降温至55‑58℃，加入纤维素酶、淀粉酶和糖化酶，搅拌酶解，得第一酶解液；步骤三、将所述第一酶解液离心，分离，得脱糖黄精片，向所述脱糖黄精片中加入纯化水，升温至50‑55℃，加入外切米曲霉中性蛋白酶、生姜蛋白酶和猕猴桃蛋白酶，搅拌酶解，得第二酶解液；步骤四、将所述第二酶解液加热升温进行酶灭活，分离纯化，得小分子黄精肽。本发明采用复合酶两次酶解的方法，并结合离心技术、纳滤技术，使得制备的黄精肽产品的纯度高，肽分子量为180‑500道尔顿的肽含量可达到99％以上。

Description

一种小分子黄精多肽的提取方法

技术领域

本发明涉及生物肽分离技术领域，尤其涉及一种小分子黄精多肽的提取方法。

背景技术

黄精，又名：鸡头黄精、黄鸡菜、笔管菜、爪子参、老虎姜、鸡爪参，为黄精属植物，黄精中含有蛋白质、皂苷、烟酸、糖类、醌类、氨基酸及微量元素等多种成分，主要用于阴虚肺燥，干咳少痰，肺肾阴虚的唠嗽久咳，脾胃虚弱，肾虚精亏等。现在市场上大部分黄精是煮半熟后直接晒干，虽然这样容易保存，不会折耗太多分量，但黄精中的大分子蛋白质无法被人体有效吸收利用，造成了资源的浪费。

小分子肽是多肽的一种分类，分子量段一般在1000道尔顿以下，也称作小肽、低聚肽或小分子活性肽，一般由2-6个氨基酸组成，相比于分子量较大的蛋白，其具有不需要消化、直接吸收，吸收时不需要消耗人体能量、不会增加人体胃肠功能负担的优点，此外其还具有载体的功能，能将人体内的其它营养载在其本体上，输送到人体的细胞、组织内，因此，受到了越来越多的关注。但是，目前对于黄精中小分子肽提取的研究尚少，现有的小分子多肽的提取工艺还存在蛋白提取效率较低，提取的小分子肽中杂质含量较多以及产品分子量分布广的缺陷，而且不同物质中含有的蛋白质的种类并不相同，不同物质小分子肽的提取工艺之间可借鉴的意义不大，将现有小分子肽提取工艺应用于黄精中小分子肽的提取中，不能取得很好的提取效果。因此，研究一种蛋白提取效率高、小分子肽含量高的黄精肽的提取工艺，以便于研究黄精肽的生物功能，对实现黄精中多肽的综合开发具有十分重要的意义。

发明内容

针对现有小分子黄精多肽提取工艺中蛋白提取效率低以及提取的小分子多肽含量较低以及产品分子量分布广的问题，本发明提供一种小分子黄精多肽的提取方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：

一种小分子黄精多肽的提取方法，包括以下步骤：

步骤一、将黄精切片，加入纯化水，搅拌均匀，煎煮，得煎煮混合物；

步骤二、将所述煎煮混合物降温至55-58℃，加入纤维素酶、淀粉酶和糖化酶，搅拌酶解，得第一酶解液；

步骤三、将所述第一酶解液离心，分离，得脱糖黄精片，向所述脱糖黄精片中加入纯化水，升温至50-55℃，加入外切米曲霉中性蛋白酶、生姜蛋白酶和猕猴桃蛋白酶，搅拌酶解，得第二酶解液；

步骤四、将所述第二酶解液加热升温进行酶灭活，分离纯化，得小分子黄精肽。

相对于现有技术，本发明提供的小分子黄精多肽的提取方法，首先利用纤维素酶、淀粉酶和糖化酶对黄精进行酶解，有效瓦解细胞壁，促使细胞内蛋白的溶出，还可将黄精中的纤维素类、淀粉类和糖类物质酶解为可溶性的物质，通过简单的离心分离即可达到与原料中蛋白质分离的目的，三种非蛋白酶联用可提高酶解速率，降低蛋白酶的用量，提高蛋白质的提取纯度；然后加入外切米曲霉中性蛋白酶、生姜蛋白酶和猕猴桃蛋白酶的复合酶进行第二次酶解，三种酶协同作用，可实现对黄精蛋白质、长链多肽不同位点、广谱性的酶切，得到分子量分布较为集中的小分子量的黄精肽，提高小分子黄精肽的提取率。本发明提取方法可操作性强，小分子黄精肽的提取率(小分子黄精肽占黄精中总蛋白质的含量)可达到92％以上，相对分子质量在1000以下的小分子肽在提取的多肽中占比达到91％以上，分子量在500-180的小分子肽在提取的多肽中占比可达到60％以上，小分子肽含量高，易消化吸收，显著提高了黄精蛋白的利用率。

优选的，步骤一中，所述纯化水的加入量为黄精重量的7-8倍。

优选的，步骤一中，所述煎煮的温度为90-95℃，煎煮时间为1-2h。

优选的煎煮步骤，有助于瓦解细胞壁，促使细胞内蛋白的溶出，有利于后续加入的纤维素酶、淀粉酶和糖化酶进一步瓦解细胞壁，酶解淀粉和糖类物质，缩短黄精蛋白提取和多肽制备的时间。

优选的，步骤二中，所述纤维素酶的加入量为原料重量的0.1-0.3％，所述淀粉酶的加入量为原料重量的1-1.5％，所述糖化酶的加入量为原料重量的0.5-0.8％。

优选的纤维素酶、淀粉酶和糖化酶的加入量，可使细胞壁充分瓦解，使黄精中的淀粉类物质和多糖类物质充分酶解为可溶性物质，从而达到与黄精中蛋白质分离的目的，同时三种酶合用还能缩短酶解时间，提高酶解效率。

优选的，步骤二中，搅拌酶解的时间为2-3h。

优选的，步骤三中，纯化水的加入量为原料重量的3-4倍。

优选的，步骤三中，所述外切米曲霉中性蛋白酶的加入量为原料重量的0.5-0.8％，所述生姜蛋白酶的加入量为原料重量的0.1-0.3％，所述猕猴桃蛋白酶的加入量为原料重量的1-1.5％。

外切米曲霉中性蛋白酶、生姜蛋白酶和猕猴桃蛋白酶三种酶联用，可对黄精蛋白质、长链多肽的不同位点进行切割，获得小分子量的短肽，而且三种蛋白酶协同作用，还可将黄精蛋白进行更彻底的剪切，提高提取多肽中小分子肽的含量。同时，外切米曲霉中性蛋白酶还能将苦味肽上的疏水氨基酸切除，脱除苦味，使制备的小分子黄精肽产品的口感更好。

优选的三种蛋白酶的加入量，既保证高效酶解，还能避免蛋白酶的浪费。

优选的，步骤三中，搅拌酶解的时间为3-4h。

优选的，步骤二中的搅拌速度和步骤三中的搅拌速度均为60-70r/min。

优选的搅拌速度可以蛋白酶充分与黄精片接触，提高酶解速率，缩短酶解时间。

可选的，步骤四中，将所述酶解液加热升温至90-95℃，保温10-15分钟进行酶灭活。

优选的，步骤三中，采用卧螺离心机进行离心，转速为3500-4000r/min。

优选的，步骤四中，采用三相离心机进行分离纯化，转速为15000-20000r/min。

卧螺离心机适合粘稠液体的过滤，比板框过滤机效率更高，通过卧螺离心机初步过滤除去不溶物，然后通过三相离心机除去酶解液中的油脂和其它悬浮物，可以提高过滤效率，提高酶解液中小分子黄精肽的纯度。

优选的转速可以使酶解液的不溶物、油脂和其它悬浮物与小分子多肽更好地分离，缩短离心时间。

优选的，步骤三之后还包括步骤四：将所述小分子黄精肽经截留分子量为180-500道尔顿的纳滤膜纳滤，得纳滤液，将所述纳滤液浓缩，干燥，得小分子黄精多肽成品。

可选的，所述干燥方式为喷雾干燥。

将分离以后得到的酶解液进一步经截留分子量为180-500道尔顿的纳滤膜纳滤，可以除去酶解液中掺杂的单个氨基酸、盐类物质和少量活性较低的大分子蛋白和多肽，进一步提高小分子黄精多肽产品的纯度，获得分子量分布范围集中的小分子黄精肽，使肽分子量为180-500道尔顿的肽含量达到99％以上，同时避免盐类物质造成小分子黄精肽口感较差的问题出现，还能更好使滤液浓缩，节省后续工序浓缩时间，降低能耗。

本发明还提供了一种小分子黄精肽，由上述的小分子黄精肽的提取方法制得。

本发明酶解黄精蛋白采用复合酶两次酶解的方法，首先采用非蛋白复合酶去除杂质，然后利用蛋白复合酶进行第二次酶解，并结合离心技术、纳滤技术，使产品99％以上为二肽到五肽的小分子肽，无单个氨基酸和盐分，无五肽以上分子量多肽；制备的小分子黄精多肽产品能完全溶于水，口感好，无异味，无苦味，可广泛应用于食品、保健品、药品等领域，能更方便的添加在食品、固体饮料、液态饮品、保健品和药品中，使人体更好的吸收。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种小分子黄精多肽的提取方法：

步骤一、选取干黄精1000g，通过切片机切片，加入7000ml纯化水搅拌均匀，在90℃条件下，煎煮3h，得煎煮混合物；

步骤二、将所述煎煮混合物降温至55℃，加入1g纤维素酶、10g的淀粉酶和5g糖化酶，以60r/min的速度搅拌酶解2.0h，得第一酶解液；

步骤三、将所述第一酶解液用卧螺离心机离心脱糖，卧螺离心机的转速为3700r/min，向脱糖后的黄精片中加入3000ml纯化水，升温至50℃，加入5g的外切米曲霉中性蛋白酶、10g猕猴桃蛋白酶和1g生姜蛋白酶，搅拌酶解3.0h，得第二酶解液；

步骤四、将所述第二酶解液升温至90℃，灭酶15分钟；将灭酶后的第二酶解液用三相离心机离心纯化，三相离心机的转速为15000r/min，得离心液；

步骤五、将所述离心液经经纳滤膜为0.2纳米的纳滤机过滤，留取未透过部分，然后用纳滤膜为0.5纳米的纳滤机再次过滤，留取透过液；将所述透过液用双效浓缩器进一步浓缩；将得到的浓缩液喷雾干燥后，得到小分子黄精多肽产品。

本实施例小分子黄精多肽的提取率可达到94.02％，产品中相对分子质量为180-500道尔顿的小分子肽含量为99.3％。

实施例2

一种小分子黄精多肽的提取方法：

步骤一、选取干黄精10Kg，通过切片机切片，加入75L纯化水搅拌均匀，在92℃条件下，煎煮2.5h，得煎煮混合物；

步骤二、将所述煎煮混合物降温至57℃，加入20g纤维素酶、120g的淀粉酶和70g糖化酶，以65r/min的速度搅拌酶解2.5h，得第一酶解液；

步骤三、将所述第一酶解液用卧螺离心机离心脱糖，卧螺离心机的转速为4000r/min，向脱糖后的黄精片中加入35L纯化水，升温至52℃，加入70g的外切米曲霉中性蛋白酶、120g猕猴桃蛋白酶和20g生姜蛋白酶，搅拌酶解3.5h，得第二酶解液；

步骤四、将所述第二酶解液升温至92℃，灭酶12分钟；将灭酶后的第二酶解液用三相离心机离心纯化，三相离心机的转速为18000r/min，得离心液；

步骤五、将所述离心液经经纳滤膜为0.2纳米的纳滤机过滤，留取未透过部分，然后用纳滤膜为0.5纳米的纳滤机再次过滤，留取透过液；将所述透过液用双效浓缩器进一步浓缩；将得到的浓缩液喷雾干燥后，得到小分子黄精多肽产品。

本实施例小分子黄精多肽的提取率可达到93.99％，产品中相对分子质量为180-500道尔顿的小分子肽含量为99.2％。

实施例3

一种小分子黄精多肽的提取方法：

步骤一、选取干黄精100Kg，通过切片机切片，加入800L纯化水搅拌均匀，在95℃条件下，煎煮2h，得煎煮混合物；

步骤二、将所述煎煮混合物降温至58℃，加入300g纤维素酶、1.5Kg的淀粉酶和800g糖化酶，以60r/min的速度搅拌酶解3.0h，得第一酶解液；

步骤三、将所述第一酶解液用卧螺离心机离心脱糖，卧螺离心机的转速为3500r/min，向脱糖后的黄精片中加入400L纯化水，升温至55℃，加入800g的外切米曲霉中性蛋白酶、1.5Kg猕猴桃蛋白酶和300g生姜蛋白酶，搅拌酶解4.0h，得第二酶解液；

步骤四、将所述第二酶解液升温至95℃，灭酶10分钟；将灭酶后的第二酶解液用三相离心机离心纯化，三相离心机的转速为20000r/min，得离心液；

步骤四、将所述离心液经经纳滤膜为0.2纳米的纳滤机过滤，留取未透过部分，然后用纳滤膜为0.5纳米的纳滤机再次过滤，留取透过液；将所述透过液用双效浓缩器进一步浓缩；将得到的浓缩液喷雾干燥后，得到小分子黄精多肽产品。

本实施例小分子黄精多肽的提取率可达到92.16％，产品中相对分子质量为180-500道尔顿的小分子肽的含量为99.1％。

实施例4

一种小分子黄精多肽的提取方法：

步骤一、选取干黄精100Kg，通过切片机切片，加入800L纯化水搅拌均匀，在95℃条件下，煎煮2h，得煎煮混合物；

步骤二、将所述煎煮混合物降温至58℃，加入300g纤维素酶、1.5Kg的淀粉酶和800g糖化酶，以60r/min的速度搅拌酶解3.0h，得第一酶解液；

步骤三、将所述第一酶解液用卧螺离心机离心脱糖，卧螺离心机的转速为3500r/min，向脱糖后的黄精片中加入400L纯化水，升温至55℃，加入800g的外切米曲霉中性蛋白酶、1.5Kg猕猴桃蛋白酶和300g生姜蛋白酶，搅拌酶解4.0h，得第二酶解液；

步骤四、将所述第二酶解液升温至95℃，灭酶10分钟；将灭酶后的第二酶解液用三相离心机离心纯化，三相离心机的转速为20000r/min，得离心液；将所述离心液用双效浓缩器进一步浓缩，浓缩液喷雾干燥后，得到小分子黄精多肽产品。

本实施例小分子黄精多肽的提取率可达到92.02％，相对分子质量为180-500道尔顿的小分子肽在提取的多肽中的占比为62.6％，产品中肽含量为87.5％。

对比例1

本对比例提供一种小分子黄精多肽的提取方法，提取方法与实施例4相同，不同的是步骤二为：将所述第一酶解液用卧螺离心机离心脱糖，卧螺离心机的转速为3500r/min，向脱糖后的黄精片中加入400L纯化水，升温至55℃，加入800g的外切米曲霉中性蛋白酶、1.5Kg菠萝蛋白酶和300g生姜蛋白酶，搅拌酶解4.0h。

本对比例中小分子黄精多肽的提取率为81.54％，相对分子质量为180-500道尔顿的小分子肽在提取的多肽中的占比为38.7％，产品中肽含量为79.4％。

对比例2

本对比例提供一种小分子黄精多肽的提取方法，提取方法与实施例4相同，不同的是步骤二为：将所述第一酶解液用卧螺离心机离心脱糖，卧螺离心机的转速为3500r/min，向脱糖后的黄精片中加入400L纯化水，升温至55℃，加入800g的外切米曲霉中性蛋白酶、1.5Kg猕猴桃蛋白酶和300g风味蛋白酶，搅拌酶解4.0h。

本对比例中小分子黄精多肽的提取率为78.87％，相对分子质量为180-500道尔顿的小分子肽在提取的多肽中的占比为36.5％，产品中肽含量为82.5％。

综上所述，本发明纤维素酶、淀粉酶和糖化酶对黄精进行酶解，然后采用外切米曲霉中性蛋白酶、生姜蛋白酶和猕猴桃蛋白酶对黄精蛋白进行靶向酶解，并结合离心技术、纳滤技术，使得制备的黄精肽产品的纯度高，肽分子量为180-500道尔顿的肽含量可达到99％以上，且生产周期短，生产成本低，制备过程不产生任何有毒有害物质，制备的黄精多肽产品能完全溶于水，口感好，无异味，无苦味，可广泛应用于食品、保健品、药品等领域，具有广阔的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种小分子黄精多肽的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、将黄精切片，加入纯化水，搅拌均匀，煎煮，得煎煮混合物；

步骤二、将所述煎煮混合物降温至55-58℃，加入纤维素酶、淀粉酶和糖化酶，搅拌酶解，得第一酶解液；

步骤三、将所述第一酶解液离心，分离，得脱糖黄精片，向所述脱糖黄精片中加入纯化水，升温至50-55℃，加入外切米曲霉中性蛋白酶、生姜蛋白酶和猕猴桃蛋白酶，搅拌酶解3-4h，得第二酶解液；其中，所述外切米曲霉中性蛋白酶的加入量为原料重量的0.5-0.8%，所述生姜蛋白酶的加入量为原料重量的0.1-0.3%，所述猕猴桃蛋白酶的加入量为原料重量的1-1.5%；

步骤四、将所述第二酶解液加热升温进行酶灭活，分离纯化，得小分子黄精多肽。

2.如权利要求1所述的小分子黄精多肽的提取方法，其特征在于，步骤一中，所述纯化水的加入量为原料重量的7-8倍；和/或

所述煎煮的温度为90-95℃，煎煮时间为2-3h。

3.如权利要求1所述的小分子黄精多肽的提取方法，其特征在于，步骤二中，所述纤维素酶的加入量为原料重量的0.1-0.3%，所述淀粉酶的加入量为原料重量的1-1.5%，所述糖化酶的加入量为原料重量的0.5-0.8%；和/或

步骤二中搅拌酶解的时间为2-3h。

4.如权利要求1所述的小分子黄精多肽的提取方法，其特征在于，步骤三中，纯化水的加入量为原料重量的3-4倍。

5.如权利要求1所述的小分子黄精多肽的提取方法，其特征在于，步骤四中，将所述酶解液加热升温至90-95℃，保温10-15分钟进行酶灭活。

6.如权利要求1所述的小分子黄精多肽的提取方法，其特征在于，步骤三中，采用卧螺离心机进行离心，转速为3500-4000r/min；和/或

步骤四中，采用三相离心机进行分离纯化，转速为15000-20000r/min。

7.如权利要求1所述的小分子黄精多肽的提取方法，其特征在于，步骤四之后还包括步骤五：将所述小分子黄精多肽经截留分子量为180-500道尔顿的纳滤膜纳滤，得纳滤液，将所述纳滤液浓缩，干燥，得小分子黄精多肽成品。

8.一种小分子黄精多肽，其特征在于，所述小分子黄精多肽由权利要求1-7任一项所述的小分子黄精多肽的提取方法制得。