CN108034682A - 黄精实体小分子肽的提取工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了黄精实体小分子肽的提取工艺,包括：脱脂、初次酶解、二次酶解、纯化，将黄精实体粉碎后以超临界CO2萃取脱脂，将脱脂粉先后经复合碱性蛋白酶、胃蛋白酶酶解，最后经超滤后得黄精实体小分子肽。有益效果为：双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解不仅可以为酶解体系提供能量，而且有助于打散团聚的分子团，同时为酶与蛋白提供更多的碰撞几率，提高酶解效率，降低酶解时间，节约时间成本；在酶解反应中程添加的（S）‑1‑氨基‑2‑羟甲基二氢吲哚的聚合产物可以与胃蛋白酶产生亲电作用，防止胃蛋白酶蛋白质结构发生变化，从而防止其活性的减低。

Description

黄精实体小分子肽的提取工艺
技术领域
本发明涉及小肽提取领域，尤其是涉及黄精实体小分子肽的提取工艺。
技术背景
黄精（学名：Polygonatum sibiricum），又名：鸡头黄精、黄鸡菜、笔管菜、爪子参、老虎姜、鸡爪参。为黄精属植物，根茎横走，圆柱状，结节膨大。叶轮生，无柄。药用植物，具有补脾，润肺生津的作用。根状茎圆柱状，由于结节膨大，因此“节间”一头粗、一头细，在粗的一头有短分枝（中药志称这种根状茎类型所制成的药材为鸡头黄精），直径1-2厘米。茎高50-90厘米，或可达1米以上，有时呈攀援状。叶轮生，每轮4-6枚，条状披针形，长8-15厘米，宽6-16毫米，先端拳卷或弯曲成钩。
一般春、秋两季采收，以秋季采收质量好，栽培3-4年秋季地上部枯萎后采收，挖取根茎，除去地上部分及须根，洗去泥土，置蒸笼内蒸至呈现油润时，取出晒干或烘干，或置水中煮沸后，捞出晒干或烘干。黄精根茎实体临床上具有治疗肺结核、癣菌病的功效，同时还具有抗病源微生物、抗疲劳、降血糖、抗氧化、延缓衰老、止血、抗病毒等功效，食药同源，具有较高的医疗价值。
关于黄精实体小分子肽的制备技术有很多方法，现有技术如申请公布号为
CN 105821105 A的中国发明专利，公开了黄精实体小分子肽的提取工艺，该发明方法首选将黄精细粉加水高温保温预处理，然后先后经过碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶解，最后将酶解液经过滤浓缩干燥后得黄精实体小分子肽，具有酶解效果好、纯度高的优点，但是该发明方法未经脱脂即行酶解，不仅浪费了黄精实体中的油脂资源，而且增加了小分子肽的提纯难度，同时该发明方法中酶解时间太长，增加了时间成本。
发明内容
本发明的目的在于提供黄精实体小分子肽的提取工艺，本提取工艺操作简单、耗时较短，可以分离出油脂，实现了黄精实体的全效利用。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：黄精实体小分子肽的提取工艺，包括：脱脂、初次酶解、二次酶解、纯化，具体包括以下步骤：
脱脂：取无变质、无病虫、干净健康的黄精实体，清洗干净后烘干，粉碎后过100-120目筛，将黄精粉置于超临界CO2萃取釜中，在萃取温度为45-47℃、萃取压力为33-35MPa、CO2流量为22-24L/h的条件下萃取2.5-3.0小时，萃取结束后从釜中出粕，经粉碎、筛分、干燥，即获得黄精脱脂粉；萃取过程中可以回收黄精油脂，实现黄精的完全综合利用，提升了产业的科技含量，增加了经济效益；
初次酶解：按照料液比1:15-16将黄精脱脂粉溶于蒸馏水中，调节温度为38-40℃、pH为8.0-8.2，加入2500-3000U/g复合碱性蛋白酶，水解30-45分钟后水浴灭酶；以复合碱性蛋白酶酶解将黄精中的大蛋白酶解为蛋白片段，露出更多的活性位点，为进一步的彻底酶解做好准备；
二次酶解：将初次酶解液降温至35-37℃，调节pH为2.2-3.5，加入3000-3300U/g胃蛋白酶水解10-15分钟，加入胃蛋白酶重量10-28‰的（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，继续反应15-20分钟，酶解过程中以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解，酶解完成后灭酶，静置15-30分钟，经0-4℃、2000-3500 r/min离心15-25分钟，取上清液；过长的微波辐射时长会影响胃蛋白酶蛋白质的空间结构，进而降低酶的活性，随着反应的进行与微波辐射时长的增加，在酶解反应的中程添加（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚在较强酸性环境下可以发生二聚合、三聚合反应，聚合产物可以与胃蛋白酶产生亲电作用，防止胃蛋白酶蛋白质结构发生变化，从而防止其活性的减低；
纯化：以超滤装置让酶解液通过1KD的超滤膜，收集截留分子量小于1000D的组分，低温干燥后以-80~-100℃冷冻保藏；超滤可以将酶解产物中的大蛋白滤除，操作简单，成本较低，不仅提高了黄精实体小分子肽的纯度，而且有利于更加精细化的考察小肽的分子量、氨基酸序列、功能等指标。
作为优选，复合碱性蛋白酶为重量比为2.5-5:1的胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的混合物；以复合蛋白酶酶解可以发挥两种蛋白酶的协同作用，提高酶解效率，降低酶解时间。
作为优选，二次酶解步骤中的pH为2.5-3.5，酶解温度为36-37℃。
作为优选，双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解的方式为超声45-55秒、微波15-5秒，双频率复合超声的超声频率为25-33kHz、55-60kHz，超声密度为0.50-0.60W/cm2、0.80-0.90W/cm2，微波辐射的功率为150-180W；双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解不仅可以为酶解体系提供能量，而且双频率复合超声的双空化效应为酶粒子与蛋白粒子带来更多的崩溃效应，有助于打散团聚的分子团，同时为酶与蛋白提供更多的碰撞几率，提高酶解效率，降低酶解时间，节约时间成本。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解不仅可以为酶解体系提供能量，而且双频率复合超声的双空化效应为酶粒子与蛋白粒子带来更多的崩溃效应，有助于打散团聚的分子团，同时为酶与蛋白提供更多的碰撞几率，提高酶解效率，降低酶解时间，节约时间成本；2）过长的微波辐射时长会影响胃蛋白酶蛋白质的空间结构，进而降低酶的活性，随着反应的进行与微波辐射时长的增加，在酶解反应的中程添加（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚在较强酸性环境下可以发生二聚合、三聚合反应，聚合产物可以与胃蛋白酶产生亲电作用，防止胃蛋白酶蛋白质结构发生变化，从而防止其活性的减低。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
黄精实体小分子肽的提取工艺，包括以下步骤：
1）将黄精实体清洗干净后烘干，粉碎后过100目筛，将黄精粉置于超临界CO2萃取釜中，在萃取温度为45℃、萃取压力为33MPa、CO2流量为22L/h的条件下萃取2.5小时，萃取结束后从釜中出粕，经粉碎、筛分、干燥，即获得黄精脱脂粉；2）按照料液比1:15将黄精脱脂粉溶于蒸馏水中，调节温度为38℃、pH为8.0，加入2500U/g复合碱性蛋白酶，复合碱性蛋白酶为重量比为5:1的胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的混合物，水解30分钟后水浴灭酶；3）将初次酶解液降温至35℃，调节pH为2.2，加入3000U/g胃蛋白酶水解10分钟，pH为2.5，酶解温度为36℃，加入胃蛋白酶重量10‰的（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，继续反应15分钟，酶解过程中以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解，双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解的方式为超声45秒、微波15秒，双频率复合超声的超声频率为25kHz、55kHz，超声密度为0.50W/cm2、0.80W/cm2，微波辐射的功率为150W，酶解完成后灭酶，静置15分钟，经0℃、2000r/min离心15分钟，取上清液；4）以超滤装置让酶解液通过1KD的超滤膜，收集截留分子量小于1000D的组分，低温干燥后以-80℃冷冻保藏；超滤可以将酶解产物中的大蛋白滤除，操作简单，成本较低，不仅提高了黄精实体小分子肽的纯度，而且有利于更加精细化的考察小肽的分子量、氨基酸序列、功能等指标。
实施例2：
黄精实体小分子肽的提取工艺，包括：脱脂、初次酶解、二次酶解、纯化，具体包括以下步骤：
1）脱脂：取无变质、无病虫、干净健康的黄精实体，清洗干净后烘干，粉碎后过120目筛，将黄精粉置于超临界CO2萃取釜中，在萃取温度为47℃、萃取压力为35MPa、CO2流量为24L/h的条件下萃取3.0小时，萃取结束后从釜中出粕，经粉碎、筛分、干燥，即获得黄精脱脂粉；萃取过程中可以回收黄精油脂，实现黄精的完全综合利用，提升了产业的科技含量，增加了经济效益；
2）初次酶解：按照料液比1:16将黄精脱脂粉溶于蒸馏水中，调节温度为40℃、pH为8.2，加入3000U/g复合碱性蛋白酶，复合碱性蛋白酶为重量比为2.5:1的胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的混合物，水解45分钟后水浴灭酶；以复合碱性蛋白酶酶解将黄精中的大蛋白酶解为蛋白片段，露出更多的活性位点，为进一步的彻底酶解做好准备；
3）二次酶解：将初次酶解液降温至37℃，调节pH为3.5，加入3300U/g胃蛋白酶水解15分钟，pH为3.5，酶解温度为37℃，加入胃蛋白酶重量28‰的（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，继续反应20分钟，酶解过程中以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解，双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解的方式为超声55秒、微波5秒，双频率复合超声的超声频率为33kHz、60kHz，超声密度为0.60W/cm2、0.90W/cm2，微波辐射的功率为180W，酶解完成后灭酶，静置30分钟，经4℃、3500 r/min离心25分钟，取上清液；过长的微波辐射时长会影响胃蛋白酶蛋白质的空间结构，进而降低酶的活性，随着反应的进行与微波辐射时长的增加，在酶解反应的中程添加（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚在较强酸性环境下可以发生二聚合、三聚合反应，聚合产物可以与胃蛋白酶产生亲电作用，防止胃蛋白酶蛋白质结构发生变化，从而防止其活性的减低；
4）纯化：以超滤装置让酶解液通过1KD的超滤膜，收集截留分子量小于1000D的组分，低温干燥后以-100℃冷冻保藏；超滤可以将酶解产物中的大蛋白滤除，操作简单，成本较低，不仅提高了黄精实体小分子肽的纯度，而且有利于更加精细化的考察小肽的分子量、氨基酸序列、功能等指标。
实施例3：
黄精实体小分子肽的提取工艺，包括：脱脂、初次酶解、二次酶解、纯化，具体包括以下步骤：
脱脂：取无变质、无病虫、干净健康的黄精实体，清洗干净后烘干，粉碎后过100目筛，将黄精粉置于超临界CO2萃取釜中，在萃取温度为45℃、萃取压力为34MPa、CO2流量为23L/h的条件下萃取2.5小时，萃取结束后从釜中出粕，经粉碎、筛分、干燥，即获得黄精脱脂粉；萃取过程中可以回收黄精油脂，实现黄精的完全综合利用，提升了产业的科技含量，增加了经济效益；
初次酶解：按照料液比1:15将黄精脱脂粉溶于蒸馏水中，调节温度为40℃、pH为8.1，加入2800U/g复合碱性蛋白酶，水解35分钟后水浴灭酶；以复合碱性蛋白酶酶解将黄精中的大蛋白酶解为蛋白片段，露出更多的活性位点，为进一步的彻底酶解做好准备；
二次酶解：将初次酶解液降温至36℃，调节pH为2.8，加入3200U/g胃蛋白酶水解12分钟，pH为3.0，酶解温度为36℃，加入胃蛋白酶重量18‰的（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，继续反应18分钟，酶解过程中以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解，酶解完成后灭酶，静置20分钟，经2℃、3200r/min离心20分钟，取上清液；过长的微波辐射时长会影响胃蛋白酶蛋白质的空间结构，进而降低酶的活性，随着反应的进行与微波辐射时长的增加，在酶解反应的中程添加（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚在较强酸性环境下可以发生二聚合、三聚合反应，聚合产物可以与胃蛋白酶产生亲电作用，防止胃蛋白酶蛋白质结构发生变化，从而防止其活性的减低；
纯化：以超滤装置让酶解液通过1KD的超滤膜，收集截留分子量小于1000D的组分，低温干燥后以-90℃冷冻保藏；超滤可以将酶解产物中的大蛋白滤除，操作简单，成本较低，不仅提高了黄精实体小分子肽的纯度，而且有利于更加精细化的考察小肽的分子量、氨基酸序列、功能等指标。
复合碱性蛋白酶为重量比为4:1的胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的混合物；以复合蛋白酶酶解可以发挥两种蛋白酶的协同作用，提高酶解效率，降低酶解时间。
双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解的方式为超声50秒、微波10秒，双频率复合超声的超声频率为30kHz、58kHz，超声密度为0.55W/cm2、0.85W/cm2，微波辐射的功率为160W；双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解不仅可以为酶解体系提供能量，而且双频率复合超声的双空化效应为酶粒子与蛋白粒子带来更多的崩溃效应，有助于打散团聚的分子团，同时为酶与蛋白提供更多的碰撞几率，提高酶解效率，降低酶解时间，节约时间成本。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.黄精实体小分子肽的提取工艺，包括：脱脂、初次酶解、二次酶解、纯化，其特征在于：所述二次酶解步骤为：将初次酶解液降温至35-37℃，调节pH为2.2-3.5，加入3000-3300U/g胃蛋白酶水解10-15分钟，加入（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚，继续反应15-20分钟，酶解过程中以双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解，酶解完成后灭酶，静置15-30分钟，经0-4℃、2000-3500 r/min离心15-25分钟，取上清液。
2.根据权利要求1所述的黄精实体小分子肽的提取工艺，其特征在于：所述二次酶解步骤中的pH为2.5-3.5，酶解温度为36-37℃。
3.根据权利要求1所述的黄精实体小分子肽的提取工艺，其特征在于：所述二次酶解步骤中（S）-1-氨基-2-羟甲基二氢吲哚的添加量为胃蛋白酶重量的10-28‰。
4.根据权利要求1所述的黄精实体小分子肽的提取工艺，其特征在于：所述二次酶解步骤中的双频率复合超声与微波辐射交替间隔辅助酶解的方式为超声45-55秒、微波15-5秒，双频率复合超声的超声频率为25-33kHz、55-60kHz，超声密度为0.50-0.60W/cm2、0.80-0.90W/cm2，微波辐射的功率为150-180W。
5.根据权利要求1所述的黄精实体小分子肽的提取工艺，其特征在于：所述脱脂步骤为：取无变质、无病虫、干净健康的黄精实体，清洗干净后烘干，粉碎后过100-120目筛，将黄精粉置于超临界CO2萃取釜中，在萃取温度为45-47℃、萃取压力为33-35MPa、CO2流量为22-24L/h的条件下萃取2.5-3.0小时，萃取结束后从釜中出粕，经粉碎、筛分、干燥，即获得黄精脱脂粉。
6.根据权利要求1所述的黄精实体小分子肽的提取工艺，其特征在于：所述初次酶解步骤为：按照料液比1:15-16将黄精脱脂粉溶于蒸馏水中，调节温度为38-40℃、pH为8.0-8.2，加入2500-3000U/g复合碱性蛋白酶，水解30-45分钟后水浴灭酶。
7.根据权利要求6所述的黄精实体小分子肽的提取工艺，其特征在于：所述初次酶解步骤中的复合碱性蛋白酶为重量比为2.5-5:1的胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的混合物。
8.根据权利要求1所述的黄精实体小分子肽的提取工艺，其特征在于：所述纯化步骤为：以超滤装置让酶解液通过1KD的超滤膜，收集截留分子量小于1000D的组分，低温干燥后以-80~-100℃冷冻保藏。
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