CN105779545A - 微波辅助酶法制备甲鱼蛋白源抗氧化肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微波辅助酶法制备甲鱼蛋白源抗氧化肽的方法，包括如下步骤：鲜活甲鱼经处理，得甲鱼肉浆；甲鱼肉浆用体积浓度≥95％的乙醇溶液脱脂，然后依次进行风干、冷冻干燥、粉碎；在所得的甲鱼粗蛋白粉中加入蒸馏水后再加入中性蛋白酶进行微波辅助酶解，所得的酶解体系于39～41℃继续酶解，得酶解液；将酶解液离心，上清液超滤，冷冻干燥，得到甲鱼蛋白源抗氧化肽。

Description

微波辅助酶法制备甲鱼蛋白源抗氧化肽的方法

技术领域

本发明涉及一种甲鱼抗氧化肽及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

1956年DenhamHarman提出了衰老的自由基学说，认为衰老过程中的退行性变化是由于细胞正常代谢过程中产生的自由基的有害作用造成的。生物体内的氧化损伤可改变细胞的结构和功能，进而影响机体健康。食品加工过程中发生的脂质过氧化易破坏食品营养价值，甚至诱发疾病。高效、安全的食源性抗氧化活性成分的寻找和应用，是提高食品营养和提升食品品质的重要研究内容之一。生物活性肽是具有生理功能的特殊蛋白片段。食源性抗氧化肽由于其分子量小、成本低、活性强、易吸收、稳定性强，具有抑制、延缓脂质氧化，保护人体组织器官免受自由基侵害的作用，已成为一种健康、安全的抗氧化剂。目前，国内外学者酶解动、植物蛋白制备活性抗氧化肽，研究表明，水产蛋白制备的抗氧化肽具有良好的抗氧化活性及其他功能特性，是制备抗氧化肽的理想原料。

甲鱼又称鳖、团鱼、脚鱼、水鱼，动物界，脊索动物门，脊椎动物亚门，爬行纲，龟鳖目，鳖科，鳖属，是一种水生经济动物。甲鱼肉质鲜嫩味美，营养丰富，含有蛋白质、多种矿物质元素及多种不饱和脂肪酸，具有强身健体、提高免疫、延年益寿、防癌抗癌的功效，是一种良好的药食同源的佳品。我国甲鱼养殖主要集中在浙江、江苏、湖北和广东省。2012年全国甲鱼总产量约33.14万吨。在动物性食品中，甲鱼蛋白含量居于前位，且甲鱼为冷血动物，经过规范化和标准化养殖，其蛋白的安全性更胜一筹，可以作为制备高品质肽产品的优质原料。

微波又称超高频电磁波，其频率比一般的无线电波高，微波处理因促进反应的高效性、强选择性、操作简便、副产物少、产率高及产物易提纯等优点，已经被广泛应用。有资料表明，微波辅助处理蛋白质，可使其结构变得更松散，暴露出更多的作用位点与酶结合，使酶解反应更快更有效地进行，以提高水解度，从而提高产率。同时，微波技术无化学残留、安全、简单，适合于工业化生产。

目前，现有的甲鱼肽的制备方法为：

CN102286588A公布了一种甲鱼肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：以甲鱼为原料，用原料甲鱼重量的0.2-5％的碱性蛋白酶、原料甲鱼重量0.1-4％的中性蛋白酶酶解1-10h，酶解后酶解液升温至85-120℃，灭酶10-60min，喷雾干燥得到甲鱼肽。

CN102286589B公布了一种甲鱼低聚肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：甲鱼原料用碱性蛋白酶酶解后，再用风味蛋白酶外切和调节风味，酶解液进行超滤，碱性蛋白酶加入量为原料甲鱼重量的0.2-5％，风味蛋白酶加入量为原料甲鱼重量的0.1-2％，膜截留分子量为0.5-30万道尔顿的超滤膜进行超滤，薄膜浓缩喷雾干燥得到甲鱼低聚肽。

采用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、中性蛋白酶对甲鱼蛋白进行酶解1-8h，灭酶、离心、过滤制备甲鱼抗氧化肽。

但是上述技术方法存在酶解时间长、蛋白水解度低，所得甲鱼抗氧化肽的活性不高的缺陷。

目前现有的微波辅助酶法制备动物蛋白源抗氧化肽的方法包括CN104131060A公布的一种河蚬抗氧化肽及其制备方法，以及CN101586139A公布的一种微波辅助酶提取鱼鳞胶原蛋白多肽的方法，但是上述方法的酶解全程均于微波下进行。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种微波辅助酶法制备甲鱼蛋白源抗氧化肽的方法。采用本发明所提供的辅助酶解工艺，可以提高酶解过程中生物活性肽的水解度，增强所得甲鱼抗氧化肽的抗氧化活性。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种微波辅助酶法制备甲鱼蛋白源抗氧化肽的方法，包括如下步骤：

1)、鲜活甲鱼宰杀后，去除内脏，并去壳、去皮、剔骨，并去除肉眼可见的脂肪粒后，用搅拌机绞碎后，得甲鱼肉浆；

2)、甲鱼肉浆用体积浓度≥95％的乙醇溶液脱脂，然后依次进行风干、冷冻干燥、粉碎，得甲鱼粗蛋白粉；

3)、在甲鱼粗蛋白粉中加入蒸馏水直至甲鱼粗蛋白粉的质量浓度为5.9～6.1％，然后调节所得的甲鱼粗蛋白粉溶液的pH值至6.90～7.10，再加入中性蛋白酶进行微波辅助酶解，时间为4～6min；

中性蛋白酶：甲鱼粗蛋白粉的质量比(即，酶底比)为4.9～5.1％，所述中性蛋白酶的酶活为1.4～1.6AU/g；

4)、将步骤3)所得的酶解体系于39～41℃恒温振荡器中继续酶解2.8～3.2h，并调节pH值至6.90～7.10，灭酶，冷却至室温，得到酶解液；

5)、将步骤4)所得的酶解液离心，上清液超滤，冷冻干燥，得到甲鱼蛋白源抗氧化肽(甲鱼抗氧化肽)。

备注说明：在本发明中，可采用1.0mol/L的氢氧化钠溶液、1.0mol/L的盐酸溶液进行pH的调节。

作为本发明的微波辅助酶解法制备甲鱼蛋白源抗氧化肽的方法的改进：所述步骤3)中：微波辅助酶解时，微波功率为0.25～0.35W/mL甲鱼粗蛋白粉溶液。

即，每mL的甲鱼粗蛋白粉溶液对应的微波功率为0.25～0.35W。

作为本发明的微波辅助酶解法制备甲鱼蛋白源抗氧化肽的方法的进一步改进：所述步骤3)中：在甲鱼粗蛋白粉中加入蒸馏水直至甲鱼粗蛋白粉的质量浓度为6％，中性蛋白酶：甲鱼粗蛋白粉的质量比(即，酶底比)为5％，所述中性蛋白酶的酶活为1.5AU/g；微波功率为0.3W/mL，酶解时间为5min。

作为本发明的微波辅助酶解法制备甲鱼蛋白源抗氧化肽的方法的进一步改进：所述步骤4)中：

将酶解体系置于40℃恒温振荡器中继续酶解3h，

所述灭酶为于100℃沸水浴中灭酶15min。

作为本发明的微波辅助酶解法制备甲鱼蛋白源抗氧化肽的方法的进一步改进：所述步骤5)中：

将酶解液于3500～4500r/min离心15～25min(较佳为4000r/min离心20min)；

离心所得的上清液采用孔径为5000Da的超滤膜进行超滤，超滤温度为10～35℃，超滤压力为0.10～0.20MPa，将超滤所得的抗氧化肽溶液(小于5000Da)于-55℃～-70℃的温度、5～15Pa的真空度进行冷冻干燥12～14h，得到甲鱼蛋白源抗氧化肽(甲鱼抗氧化肽)。

本发明所用中性蛋白酶例如可购买于诺维信生物技术有限公司中性蛋白酶(1.5AU/g)。

本发明的制备流程如下：甲鱼→预处理→脱脂→干燥→粉碎→微波辅助酶解处理→灭酶→离心→超滤→冷冻干燥→抗氧化肽。

本发明具有以下技术优势：

(1)采用微波辅助酶解法制备甲鱼抗氧化肽，能耗小、效率高且无化学残留、安全、简单，即提高了生物活性肽的水解度，又增强了甲鱼肽的抗氧化效果，且通过超滤技术，可得到分子量小于5000Da的抗氧化肽，1mg/mL的反应体系DPPH清除率达88.79％；

(2)制备甲鱼抗氧化肽实施过程中所需的酶解、微波、离心、超滤、冷冻干燥等设备技术成熟度高、可行性强，适合于大规模工业化生产；

(3)、经过前期大量的研究，选择了中性蛋白酶进行酶解；且先于微波辅助进行短时间的酶解，再进行恒温酶解；酶解效果好，酶解条件易于控制，且性价比高；本发明不但能降低生产成本，还能提高产物的抗氧化效果。

综上所述，本发明以甲鱼肉为原料制备甲鱼抗氧化肽的方法，为甲鱼肉活性肽作为功能性食品、药品、化妆品辅料及功能因子提供理论基础，对拓宽甲鱼深加工途径、实现甲鱼肉高值化利用，具有重要的现实意义和良好的经济效益。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1、一种微波辅助酶法制备甲鱼蛋白源抗氧化肽的方法，依次进行以下步骤：

(1)原料预处理：鲜活甲鱼宰杀去除内脏及杂物后，去壳、去皮、剔骨，并去除肉眼可见的脂肪粒后，用搅拌机绞碎后得甲鱼肉浆；

(2)脱脂：甲鱼肉浆浸提3次从而实现脱脂，每次浸提的工艺参数如下：用甲鱼肉浆三倍体积的95％乙醇浸提8h；将过滤所得的滤饼于通风橱中风干(一般风干4～6小时)后，冷冻干燥(于-55℃～-70℃，真空度为5～15Pa，冷冻干燥6～8小时)，粉碎(粉碎至能过80目的筛)，得甲鱼粗蛋白粉；

(3)微波处理：取6.0kg的甲鱼粗蛋白粉，通过添加蒸馏水调节底物蛋白浓度为6％(即，所得的甲鱼粗蛋白粉溶液中，甲鱼粗蛋白粉的质量浓度为6％)，用1.0mol/L的氢氧化钠溶液与1.0mol/L的盐酸溶液调节该溶液的pH值为7.0，按照酶底比为5％的添加量加入中性蛋白酶(酶活为1.5AU/g)300g，混匀，将混合物置于微波功率为0.3W/mL条件下，微波辅助处理5min。

(4)酶解：将经过微波处理的混合物(即，步骤3所得的酶解体系)移至40℃恒温振荡器中，继续酶解3h，并利用浓度为1.0mol/L的氢氧化钠溶液与浓度为1.0mol/L的盐酸溶液维持反应体系pH值稳定在7.0；

(5)灭酶：酶解时间到后，将混合物移至100℃沸水浴中灭酶15min，冷却到室温，得酶解液；

(6)离心：将酶解液在4000r/min条件下离心20min，取上清液；

(7)超滤：将上清液通过超滤膜孔径为5000Da的正切流动过滤系统进行超滤处理，超滤温度为20℃，超滤压力为0.15MPa，收集分子量小于5000Da的部分；

(8)冷冻干燥：将超滤得到的超滤液在-18℃条件下预冻后，在温度为-55～-70℃、真空度为5～15Pa的条件下冷冻干燥12h。

得甲鱼抗氧化肽5.3kg，抗氧化肽得率达到88.3％。产品呈淡黄色且略带腥味，1mg/mL浓度时，DPPH自由基清除率为88.79％。

对比例1-1、将实施例1中的酶底比由5％改成7％，其余等同于实施例1。经冷冻干燥后即得甲鱼抗氧化肽4.1kg，1mg/mL时，DPPH自由基清除率为45.3％。

对比例1-2、将实施例1中的酶底比由5％改成3％，其余等同于实施例1。经冷冻干燥后即得甲鱼抗氧化肽3.2kg，1mg/mL时，DPPH自由基清除率为32.4％。

对比例2-1、将实施例1中的中性蛋白酶改成酸性蛋白酶(酶活为5万U/g)，酶底比不变，且相应调节步骤(3)和(4)中的pH值为2.5，其余等同于实施例1。经冷冻干燥后即得甲鱼抗氧化肽1.8kg，1mg/mL时，DPPH自由基清除率为28.9％。

对比例2-2、将实施例1中的中性蛋白酶改成胰蛋白酶(酶活为50万U/g)，酶底比不变，且相应调节步骤(3)和(4)中的pH值为10.0，其余等同于实施例1。经冷冻干燥后即得甲鱼抗氧化肽4.4kg，1mg/mL时，DPPH自由基清除率为18.7％。

对比例3-1、取消实施例1步骤(3)中的“将混合物置于微波功率为0.3W/mL条件下，微波辅助处理5min”，即，混匀后的所得物直接进行步骤(4)的酶解。其余等同于实施例1。经冷冻干燥后即得甲鱼抗氧化肽4.5kg，1mg/mL时，DPPH自由基清除率为61.2％。

对比例3-2、将实施例1步骤(3)中的微波辅助处理时间由5min改成8min；其余等同于实施例1。经冷冻干燥后即得甲鱼抗氧化肽4.8kg，1mg/mL时，DPPH自由基清除率为46.7％。

对比例3-3、将实施例1的步骤(4)改成：将经过微波处理的混合物(即，步骤3所得的酶解体系)继续置于微波功率为0.3W/mL条件下，酶解30min。酶解过程中，维持反应体系pH值稳定在7.0左右。其余等同于实施例1。经冷冻干燥后即得甲鱼抗氧化肽2.7kg，1mg/mL时，DPPH自由基清除率为29.8％。

对比例3-3、将实施例1的步骤(4)改成：将经过微波处理的混合物(即，步骤3所得的酶解体系)继续置于微波功率为0.3W/mL条件下，酶解60min。酶解过程中，维持反应体系pH值稳定在7.0左右。其余等同于实施例1。所得的甲鱼抗氧化肽于1mg/mL的浓度时，DPPH自由基清除率为23.2％。

以上所述仅为本发明的较佳实施案例，对发明而言仅仅是说明性的，并非对本发明的构思和范围进行限定。本领域中专业技术人员理解，在不脱离本发明思想的前提下可对其技术方案作出各种改变和修改，但属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.微波辅助酶法制备甲鱼蛋白源抗氧化肽的方法，其特征是包括如下步骤：

1)、鲜活甲鱼宰杀后，去除内脏，并去壳、去皮、剔骨，并去除肉眼可见的脂肪粒后，用搅拌机绞碎后，得甲鱼肉浆；

2)、甲鱼肉浆用体积浓度≥95％的乙醇溶液脱脂，然后依次进行风干、冷冻干燥、粉碎，得甲鱼粗蛋白粉；

3)、在甲鱼粗蛋白粉中加入蒸馏水直至甲鱼粗蛋白粉的质量浓度为5.9～6.1％，然后调节所得的甲鱼粗蛋白粉溶液的pH值至6.90～7.10，再加入中性蛋白酶进行微波辅助酶解，时间为4～6min；

中性蛋白酶：甲鱼粗蛋白粉的质量比为4.9～5.1％，所述中性蛋白酶的酶活为1.4～1.6AU/g；

4)、将步骤3)所得的酶解体系于39～41℃恒温振荡器中继续酶解2.8～3.2h，并调节pH值至6.90～7.10，灭酶，冷却至室温，得到酶解液；

5)、将步骤4)所得的酶解液离心，上清液超滤，冷冻干燥，得到甲鱼蛋白源抗氧化肽。

2.根据权利要求1所述的微波辅助酶解法制备甲鱼蛋白源抗氧化肽的方法，其特征是所述步骤3)中：微波辅助酶解时，微波功率为0.25～0.35W/mL甲鱼粗蛋白粉溶液。

3.根据权利要求1或2所述的微波辅助酶解法制备甲鱼蛋白源抗氧化肽的方法，其特征是所述步骤3)中：在甲鱼粗蛋白粉中加入蒸馏水直至甲鱼粗蛋白粉的质量浓度为6％，中性蛋白酶：甲鱼粗蛋白粉的质量比为5％，所述中性蛋白酶的酶活为1.5AU/g；微波功率为0.3W/mL，酶解时间为5min。

4.根据权利要求1或2所述的微波辅助酶解法制备甲鱼蛋白源抗氧化肽的方法，其特征是所述步骤4)中：

将酶解体系置于40℃恒温振荡器中继续酶解3h，

所述灭酶为于100℃沸水浴中灭酶15min。

5.根据权利要求1或2所述的微波辅助酶解法制备甲鱼蛋白源抗氧化肽的方法，其特征是所述步骤5)中：

将酶解液于3500～4500r/min离心15～25min；

离心所得的上清液采用孔径为5000Da的超滤膜进行超滤，超滤温度为10～35℃，超滤压力为0.10～0.20MPa，将超滤所得的抗氧化肽溶液于-55℃～-70℃的温度、5～15Pa的真空度进行冷冻干燥12～14h，得到甲鱼蛋白源抗氧化肽。