CN103739693A - 一种具有抗氧化活性的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗氧化活性的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列，其特征是：其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。还公开了上述具有抗氧化活性的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列在制备具有抗氧化活性作用的食品、保健食品、化妆品、药物或饲料中的应用。本发明首次确认从合浦珠母贝肉中提取到抗氧化肽的结构序列，并通过合成同一序列肽，进一步证明该序列的肽确实是具有抗氧化活性，从而为其在食品行业及日化行业的应用奠定基础，当天然原料提取效率低，工艺复杂，成本高时，也可通过人工合成的方式得到该抗氧化肽，并应用于产业。

Description

一种具有抗氧化活性的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列及其应用

技术领域

本发明属于多肽技术领域，涉及一种具有抗氧化活性的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列及其应用。

背景技术

珍珠贝的种类很多，有珍珠贝、大珍珠贝、合浦珠母贝、企鹅珍珠贝等，其中以合浦珠母贝最普通，是世界上生产养殖珍珠的主要贝种。我国海南、广东、广西等省合浦珠母贝资源丰富，是南海主要的近海养殖“南珠”的母贝，每年采珠后珠母贝肉达几千吨，由于其风味问题而较少用于冷鲜食品。珍珠具有抗氧化，防衰老美白的功效，也有学者发现合浦珠母贝肉含有丰富的优质蛋白和不饱和脂肪酸，其不同酶的酶解液具有降血压、解离镉金属离子、抗疲劳和抗氧化等作用。与在市面上用于食品、药品以及化妆品和饲料的工业合成的添加剂相比，其安全性和效用都很高，使之成为当前国际的热门研究课题。

抗氧化肽具有延缓机体衰老的功能活性，不仅能够清除体内的自由基，减轻自由基对机体的损伤，而且能够防止紫外线引起的线粒体的损伤和自由基诱导的脂质过氧化，抗氧化肽还能够为抗氧化酶提供氢和螯合金属离子。天然抗氧化剂在医药、化妆品、保健品和食品与饲料添加剂等方面应用前景广阔，筛选具有强抗氧化活性的天然资源已成为食品科学、生物学、医学等研究的新趋势。而从合浦珠母贝肉中获得具有抗氧化活性的抗氧化肽序列，对其今后的开发应用具有广泛的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗氧化活性的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列，该序列具有抗氧化功能。

本发明的目的还在于提供上述具有抗氧化活性的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列在制备具有抗氧化活性作用的食品、保健食品、化妆品、药物或饲料中的应用。

本发明的第一个目的是通过如下技术手段来实现的：一种具有抗氧化活性的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

本发明可以通过微波辅助酶解法制备获得该具有抗氧化活性的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列，具体的制备过程如下：选取合浦珠母贝贝肉，采用微波辅助Alcalase2.4L蛋白酶酶解提取，得酶解液，将酶解液经脱盐和分离纯化处理，收集分子量在800～1200Da之间的分离液，得到的肽液即为具有抗氧化活性的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列。

其中微波辅助Alcalase2.4L蛋白酶酶解提取时，微波温度优选为55～62℃，微波功率优选为280～300W，微波时间优选为15～20min，加酶量优选为在1g合浦珠母贝贝肉中加入4500～5500u的Alcalase2.4L蛋白酶，微波处理后继续在55～62℃下再水浴1.2～2h。

较佳的条件为微波温度为58℃，微波功率300W，微波时间为17min，加酶量为在1g合浦珠母贝贝肉中加入5000u的Alcalase2.4L蛋白酶，微波处理后继续在58℃下再水浴1.5h。

酶解液脱盐处理时优选采用C18柱。也可以用其他脱盐方式，此步骤的目的是脱除酶解液中的盐。

酶解液分离纯化处理时优选采用交联葡聚糖Sephadex G-25层析柱进行分离纯化。

经过RP-HPLC、MALDI-TOF-TOF二级质谱分析和氨基酸组成分析发现，本发明制备获得的上述肽液中所含的主肽段分子量为1039.56Da，分析该肽的序列为：Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg。

因此，本发明申请人又尝试性的采用人工方式合成上述序列的具有抗氧化活性的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列，经还原力、DPPH自由基、OH自由基以及超氧阴离子清除能力分析发现，该人工合成的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列也具有抗氧化性，因此，在从天然原料合浦珠母贝肉中提取效率较低，提取成本较高等的情况下，可以采用人工合成该合浦珠母贝肉抗氧化肽序列，从而可以在工业上大规模应用。

本发明人工合成合浦珠母贝肉抗氧化肽序列采用Fmoc固相合成法，合成原理为先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链；重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。

本发明人工合成合浦珠母贝肉抗氧化肽序列Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg中采用的树脂为王树脂，反应过程为选取氨基酸原料，在缩合剂、碱试剂以及DMF反应溶剂作用下，进行反应，反应过程中，采用树脂和Kaiser试剂进行产物的纯度检测至反应完全，获得高纯度的Gly-Ala产品，然后把Gly-Ala产品溶于切割试剂中进行切割，获得Gly-Ala的粗品；根据要合成多肽的序列，依次合成下一个氨基酸，重复反应步骤、纯度检测和切割操作等过程，即合成得合浦珠母贝肉抗氧化肽序列Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg。

本发明具有如下优点：

（1）本发明从合浦珠母贝贝肉中提取的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列以及人工合成的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列，经还原力、DPPH自由基、OH自由基以及超氧阴离子清除能力分析发现：对DPPH以及OH自由基的清除能力，合成肽的IC₅₀值约为天然提取肽的3～4倍，两者的还原力以及对O₂ ^-清除率的IC₅₀值相近，与Vc、BHT等比较从表1可见，除了还原力外，清除DPPH、OH自由基的清除能力和O₂ ^-的IC₅₀的能力均比Vc、BHT高；

（2）本发明首次确认从合浦珠母贝肉中提取到抗氧化肽的结构序列，并通过合成同一序列肽，进一步证明该序列的肽确实是具有抗氧化活性，从而为其在食品行业及日化行业的应用奠定基础，当天然原料提取效率低，工艺复杂，成本高时，也可通过人工合成的方式得到该抗氧化肽，并应用于产业。

附图说明

图1是实施例1中合浦珠母贝肉分离到的肽液的液相分析图；

图2是实施例1中合浦珠母贝肉分离到的肽液的MALDI-TOF-TOF一级质谱图；

图3是实施例1中合浦珠母贝肉分离到的肽液的红外光谱图；

图4是实施例2中人工合成合浦珠母贝肉抗氧化肽序列的液相分析图；

图5是实施例2中人工合成合浦珠母贝肉抗氧化肽序列的ESI质谱图。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供的具有抗氧化活性的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，其通过从合浦珠母贝贝肉中提取获得，具体提取过程如下：

选用微波辅助Alcalase2.4L蛋白酶酶解合浦珠母贝贝肉，微波温度为58℃、微波功率300W，微波时间17min，加酶量为5000u/g（1g合浦珠母贝贝肉中加入Alcalase2.4L蛋白酶5000u），微波处理后继续在58℃下再水浴1.5h；离心分离，得到酶解液，用C18柱对酶解液进行脱盐处理，脱盐后的酶解液经SephadexG-25进行分离纯化，收集分子量约在800～1200Da分离液，即得到具有抗氧化活性的抗氧化肽。

将合浦珠母贝肉分离到的肽液，经RP-HPLC和MALDI-TOF-TOF二级质谱分析，具体结果见图1-2中所示，结果表明制备到的肽液中所含的主肽段分子量为1039.56Da，分析该肽的序列为：Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg，经红外吸收光谱分析，如图3中所示，其酰胺Ⅰ区和酰胺Ⅱ区域也有较强的α螺旋构型吸收带。

实施例2

本实施例提供的具有抗氧化活性的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列，其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，其通过人工合成，人工合成合浦珠母贝肉抗氧化肽序列采用Fmoc固相合成法，合成原理为先将所要合成肽链的羟末端氨基酸的羟基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应，接长肽链；重复（缩合→洗涤→去保护→中和及洗涤→下一轮缩合）操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，经过纯化等处理，即得所要的多肽。

本发明人工合成合浦珠母贝肉抗氧化肽序列Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg中采用的树脂为王树脂，反应过程为先选取两种氨基酸，在缩合剂、碱试剂以及DMF反应溶剂作用下，进行反应，反应过程中，采用树脂和Kaiser试剂进行产物的纯度检测至反应完全，获得高纯度的Gly-Ala产品，然后把Gly-Ala产品溶于切割试剂中进行切割，获得Gly-Ala的粗品；根据要合成多肽的序列，依次合成下一个氨基酸，重复反应步骤、纯度检测和切割操作等过程，即合成得合浦珠母贝肉抗氧化肽序列Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg。

各物质的用量以及具体的制备过程如下：

首先，根据合成的肽及其量，选择树脂用王树1.8g。

王树脂的清洗过程为：用6mL/g的DMF泡10分钟左右，然后抽干，再加质量浓度为20%的六氢吡啶和DMF溶液6mL/g，在室温下放在摇床上或氮气鼓动，振荡5分钟左右，再抽干，再加质量浓度为20%的六氢吡啶和DMF溶液5～8mL/g，在室温下放在摇床上或氮气鼓动，振荡15分钟，之后用无水甲醇洗3次，二氯甲烷洗3次。

反应：根据多肽的序列加Fmoc保护氨基酸及缩合剂，其中K可通过树脂的重量及取代度计算：

K=树脂取代度×树脂的重量×（2～5）

Fmoc保护氨基酸的量=分子量×K/1000

HOBT的量=0.135×K

Collidine的量=0.124×2K/0.8

将计算好的氨基酸、Fmoc缩合剂（HOBT/DIC）以及碱试剂（碱试剂作用是碱性条件，容易活化，形成酰胺键的试剂），加入到接肽瓶，8mL/g的DMF为反应体系，氮气鼓吹30min，再抽干清洗。

纯度检测：取20粒王树脂放在试管里，加1mLKaiser试剂，100℃加热5分钟，树脂的颜色如果无色表明反应完全，如果有蓝色，淡紫色则说明反应不完全，就需要重复反应，直到Kaiser Test颜色无色或接近无色。

切割：配制切割试剂为三氟乙酸：水：对甲苯酚：乙二硫醇=92.5:2.5:2.5:2.5(V/V)，然后按照10mL/g把多肽树脂加到溶液中，密封好在室温振荡3小时，过滤，用TFA（三氟乙酸）洗，滤液中加无水乙醚，析出沉淀，固体再用乙醚洗若干次，然后抽干，得到多肽的粗品。

根据要合成多肽的序列，依次合成下一个氨基酸，重复反应步骤、纯度检测以及切割试剂切割等操作过程，即合成得合浦珠母贝肉抗氧化肽序列Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg。

最后，合成的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列的液相分析图见图4中所示，ESI质谱图见图5中所示，从图4和图5可见，此高纯度合成肽的主要离子峰质荷比为1040.33，该粗品的主要分子量为1039.33Da，符合需要合成序列的分子量，固相合成成功。

实施例3

合浦珠母贝肉抗氧化肽序列的应用，以还原力、DPPH自由基、OH自由基以及超氧阴离子清除能力的IC50值为抗氧化指标，分析实施例1中从合浦珠母贝肉中分离制备到抗氧化肽序列（Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg）和实施例2中人工合成该序列肽（（Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg））的这些指标，结果如下表1中所示：

表1实施例1和实施例2中合浦珠母贝肉抗氧化肽序列和对照Vc以及BHT的抗

氧化能力分析

抗氧化指标	实施例1	实施例2	VC	BHT
					还原力(2.5mg/mL)	0.43±0.03	0.57±0.01	1.43±0.01	1.33±0.01
DPPH IC50(mg/mL)	0.32	0.385	0.027	0.025
					OH IC50(mg/mL)	0.268	0.975	0.222	0.273
O2 -IC50(mg/mL)	1.046	1.175	0.246	0.302

从表1中可以看出，经还原力、DPPH自由基、OH自由基以及超氧阴离子清除能力分析发现：对DPPH以及OH自由基的清除能力，实施例2中合成肽的IC₅₀值约为实施例1中天然提取肽的3～4倍，两者的还原力以及对O₂ ^-清除率的IC₅₀值相近，与Vc、BHT等比较从表1可见，除了还原力外，清除DPPH、OH自由基的清除能力和O₂ ^-的IC₅₀的能力均比Vc、BHT高。

其中DPPH自由基的清除能力测定、羟基自由基清除能力测定、超氧阴离子清除能力的测定和总抗氧化活性测定—还原能力测定测试过程如下：

（1）DPPH自由基的清除能力测定：

取0.5mL样品（实施例1或实施例2中的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列）液于10mL的离心管，再依次加入0.5mL去离子水，1mLDPPH溶液（2×10-4mol/L，DPPH溶于无水乙醇），混匀后在室温下避光反应20min，10000r/min下离心10min，于517nm下测吸光值A_i，实验空白组为1ml无水乙醇代替DPPH溶液加入1mL去离子水测定吸光值为A_j，对照组为1mL去离子水代替样品液在517nm下测定吸光值A₀，并以等体积去离子水和无水乙醇混合液空白调零，DPPH自由基清除率AOA按以下公式计算：

$\mathrm{AOA}(\%)=(1-\frac{\mathrm{Ai}-\mathrm{Aj}}{A0})\×100\%$

式中：A₀——对照组吸光值；

A_i——样品组吸光值；

A_j——空白组吸光值。

试验结果见上表1中所示。

（2）羟基自由基清除能力测定

利用H₂O₂与Fe^2＋混合可以产生·OH的原理，加入水杨酸捕捉·OH产生的有色物质在510nm处有强吸收。在10mL的离心管中依次加入3mmol/L FeSO₄溶液1mL，1mL无水乙醇溶解的水杨酸（3mmol/L），样品（实施例1或实施例2中的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列）溶液1mL，以及3mmol/L的H₂O₂1mL，摇匀于37℃条件下静置反应30min，反应液在510nm处测定吸光度值，以此作为实验组Ai；空白组为水代替待测液记为A0；对照组为水代替水杨酸-无水乙醇溶液的本底吸收。计算如下：

式中：A0——对照组吸光值；

Ai——样品组吸光值；

Aj——空白组吸光值。

试验结果见上表1中所示。

（3）超氧阴离子清除能力的测定

样品（实施例1或实施例2中合浦珠母贝肉抗氧化肽序列）和Tris-HCl缓冲溶液按照1:25依次加入10mL离心管，在紫外分光光度计上做时间扫描，每30s读取吸光度，然后作吸光度随时间变化的回归方程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V，操作如下表2：

表2O₂ ^-自由基清除能力测定步骤

注：Tris-HCl溶液（pH8.2）；邻苯三酚溶液（3×10^-3mol/l）。

按下式计算样品对超氧阴离子的抑制率:

抑制率(%)=（1－V_对照/V_样品）×100

式中:V_对照-对照组邻苯三酚自氧化速率(ΔA/min)；

V_样品-样品组邻苯三酚自氧化速率(ΔA/min)。

试验结果见上表1中所示。

(4)总抗氧化活性测定—还原能力测定

取待测样液(实施例1或2中的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列)0.5mL，加入质量分数为1%的铁氰化钾溶液2.5mL，0.2mol/L pH6.6的磷酸缓冲液2.5mL，混匀后于50℃水浴下保温20min，再加入质量分数为10%的三氯乙酸(TCA)溶液2mL，振荡混匀后离心。取离心后的上清液2mL，加入2mL去离子水和0.4mL质量分数为0.1%的FeCl₃溶液，振荡混匀后在50℃水浴下保温10min，体系溶液由黄色变为蓝色，在700nm下进行比色，以去离子水代替样品作为空白。试验结果见上表1中所示。

以上列举具体实施例对本发明进行说明。需要指出的是，以上实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明的提示做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种具有抗氧化活性的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列，其特征是：其氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.权利要求1所述的具有抗氧化活性的合浦珠母贝肉抗氧化肽序列在制备具有抗氧化活性作用的食品、保健食品、化妆品、药物或饲料中的应用。

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