CN113024633B - 一种珍珠贝肉来源ace活性抑制肽及其制备筛选方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种珍珠贝肉来源ACE活性抑制肽及其制备筛选方法和应用。以ACE抑制活性为导向，将酶解物经超滤、凝胶色谱法、高效液相色谱法等一系列方法分离纯化，结合生物信息学筛选得到一个高纯度的ACE抑制四肽，其氨基酸序列为：Phe‑Arg‑Val‑Trp(FRVW)，采用固相合成法对四肽FRVW进行生物合成并测定活性，结果表明其对ACE的IC50值为18.34μM，是一个高活性小分子肽，将该肽应用于医药或者食品领域，具有极大的保健价值。本发明实现了海洋贝类产品珍珠贝高值化利用，为贝类产品深加工提供了可靠依据。

Description

一种珍珠贝肉来源ACE活性抑制肽及其制备筛选方法和应用
技术领域
本发明属于ACE抑制肽技术领域，涉及一种珍珠贝肉来源ACE活性抑制肽及其制备筛选方法和应用。
背景技术
高血压是心脑血管疾病发生发展的主要危险因素之一。而在高血压的发病机理中，血管紧张素转换酶(ACE)起着至关重要的作用，它可以催化血管紧张素I向血管紧张素II转化，同时催化缓激肽的降解，从而升高血压。因此，抑制血管紧张素转化酶是治疗高血压的有效方法。临床上常使用的ACE抑制剂包括卡托普利，依那普利和苯那普利。然而，这些合成药物通常产生一些不良反应，例如服用期间出现咳嗽，失眠，皮疹和发烧等症状。因此，寻找高效低毒的替代治疗品势在必行。近年，各类蛋白诸如奶酪、大豆等的酶解产物已被报道具有ACE抑制功能。然而这些被开发的蛋白资源大多集中在陆地。我国海域面积广阔，海洋生物种类繁多，蛋白资源丰富。并且，极端的海洋环境使得海洋生物与陆地生物相比具有更加独特的蛋白序列。合浦珠母贝Pinctada fucata(P.fucata)是中国的一种海洋经济贝类，其蛋白质含量高，有效利用却不足。因此通过酶解实现珍珠贝蛋白的高值化利用，是海洋贝类产品深加工重要的一步。
发明内容
本发明的目的在于提供一种珍珠贝(合浦珠母贝)肉来源ACE活性抑制肽，其安全性高，具有产业应用价值。
本发明通过对合浦珠母贝肉酶解液多次分离纯化，筛选出一种高活性的ACE活性抑制肽，所述的ACE活性抑制肽，其氨基酸序列为：Phe-Arg-Val-Trp(FRVW)，如SEQ ID NO.1所示。
以所述的ACE活性抑制肽为核心，任何对其进行的相应的调整或修饰都属于本发明的保护范围。
本发明的第二个目的是提供上述ACE活性抑制肽在制备血管紧张素转换酶抑制剂中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种血管紧张素转换酶抑制剂，其含有上述ACE活性抑制肽作为活性成分。
所述的血管紧张素转换酶抑制剂是治疗高血压的药物。
本发明的第三个目的是提供一种ACE活性抑制肽的制备筛选方法，其是从合浦珠母贝肉中分离出来的。
具体包括以下步骤：
(1)珍珠贝肉酶解液的制备：取脱脂后的合浦珠母贝肉，加入蛋白酶酶解，酶解完后灭酶，然后离心过滤，得上清液；
(2)酶解液的分离纯化：将上清液采用超滤管进行截留分段，取低分子段的组分经葡聚糖凝胶柱分离纯化，分别测定各组分的ACE抑制率，最后将凝胶柱洗脱后具有最高ACE抑制活性的组分在RP-HPLC柱上分离制备，并测定各组分的ACE抑制活性；
(3)肽的鉴定：将经高效液相色谱分离后活性较高的组分进行鉴定，采用ESI/LC-MS/MS获得其二级质谱数据，denovo测序后得到多肽序列；
(4)结合序列的ALC值及Pepsite2预测的P值对鉴定的多肽进行筛选；
(5)肽的合成及活性验证：合成可靠且理论上具有高活性的肽，测定其ACE抑制率，验证合成肽的活性。
所述的步骤(1)中的蛋白酶为碱性蛋白酶。
所述的步骤(2)的低分子段的组分是分子量小于2K Da的组分。
所述的步骤(2)中的葡聚糖柱为Sephadex G25柱，柱内径为3.5cm，柱长为30cm。
所述的步骤(2)中的RP-HPLC柱为YMC-Pack ODS-A C18半制备色谱柱，粒径5um，内径10mm,柱长250mm。
本发明的有益效果如下：
1、选用高蛋白的海洋经济产品珍珠贝(合浦珠母贝)进行酶解，经碱性蛋白酶酶解10h后获得高ACE抑制活性的酶解物，其ACE抑制活性较高，且小分子肽占比高。
2、以ACE抑制活性为导向，将酶解物经超滤、凝胶色谱法、高效液相色谱法等一系列方法分离纯化，结合生物信息学筛选得到一个高纯度的ACE抑制四肽，其氨基酸序列为：Phe-Arg-Val-Trp(FRVW)，采用固相合成法对四肽FRVW进行生物合成并测定活性，结果表明其对ACE的IC50值为18.34μM，是一个高活性小分子肽，将该肽应用于医药或者食品领域，具有极大的保健价值。
3、本发明实现了小分子活性肽的高效制备及筛选。该方法操作简单，提升了高活性单个肽筛选成功的几率。
4、本发明实现了海洋贝类产品珍珠贝高值化利用，为贝类产品深加工提供了可靠依据。
附图说明：
图1为本发明ACE抑制活性肽分离纯化和鉴定筛选的流程图。
图2为凝胶色谱Sephadex G25洗脱曲线图。
图3为凝胶色谱各分离组分的ACE抑制活性图。
图4为本发明的ACE抑制活性肽的高效液相色谱图。
图5为本发明的ACE抑制肽的抑制活性图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
如图1所述，一种珍珠贝来源的ACE抑制肽的分离纯化及筛选方法，包括以下几个步骤：
S1、珍珠贝肉酶解物的制备
珍珠贝(合浦珠母贝)肉适量，用绞肉机绞碎为肉糜，加入异丙醇脱脂三小时，通风处晾干，即为脱脂的珍珠贝肉，取脱脂后的珍珠贝肉适量，加入碱性蛋白酶酶解10小时，酶解条件为：温度50℃，pH值10.0，底物浓度8％(质量分数)，酶底比8000u/g。酶解完后将酶解产物置于沸水中水浴15min灭酶活，冷却后8000转/分钟离心20分钟，以除去不溶的颗粒状物质，然后用0.45um滤膜过滤，收集澄清的淡黄色滤液，真空冷冻干燥，得到淡黄色的酶解物粉末，即为珍珠贝蛋白酶解物，-20℃下保存备用。
S2、酶解物的分离纯化
(1)具体步骤为：取适量冻干的珍珠贝蛋白酶解物溶解于水中，采用超滤管(截留分子量为3kDa)进行超滤截留，得到分子量大于3kDa和小于3kDa的组分，收集滤过的液体组分(小于3kDa的组分)，冷冻干燥得到小分子活性肽粗品。
(2)取(1)获得的小分子活性肽粗品0.4g溶解到水中，配置成浓度为100mg/ml的肽溶液，上样到Sephadex G-25柱上分离，采用纯水洗脱，流速为1ml/min，10分钟收集一管，监测波长为220nm。根据吸光度值收集了四个组分，如图2所示。测定了四个组分的ACE抑制活性，结果如图3显示，峰3的ACE抑制率最大。反复收集目标峰3，冷冻干燥得到活性肽粗品。
(3)取(2)中的活性肽粗品进一步在YMC-Pack ODS-A C18半制备色谱柱(250×10.0mm，5um)上分离纯化，洗脱条件如下：流速为2mL/min，流动相A为含0.1％TFA的Milli-Q水溶液，洗脱液B为纯甲醇。将100μL样品溶液上样到C18色谱柱后，线性梯度洗脱条件为：按体积百分数，99％A(0-5min)，99-39％A(5-65min)，39％A(65-70min)，39％-99％A(70-75min)以及99％A(75-80min)，监测波长为220nm。多次制备收集保留时间为50分钟的色谱峰，合并后冻干得活性肽纯品，其在分析柱上的色谱图如图4所示。
S3、珍珠贝肉来源ACE抑制肽的序列鉴定
采用ESI-LC-MS/MS对RP-HPLC分离的活性肽纯品进行鉴定。质谱仪连接着一台安捷伦色谱仪用作分离，分离过程在安捷伦反相柱(4.6×150mm，5um)上进行。洗脱液A为超纯水中含0.1％的甲酸水溶液(v/v)，洗脱液B为纯甲醇。以1.0mL/min的流速洗脱，洗脱程序为：v/v 1％B(0-5min)，1-61％B(5-65min)。鉴定采用布鲁克Maxis质谱仪，以正离子模式进行，母离子扫描范围：m/z 200-3000。碎裂模式：HCD。其它参数设置如下：干燥温度，180℃；电喷雾毛细管电压，4.5kV；干气流量，4.0L/min。使用PEAKS Studio7来分析质谱数据并使用从头测序法鉴定。母离子和碎片离子参数分别设置为10ppm和0.02Da。当鉴定的肽的置信度(ALC)值(>80％)才被认为可信。
S4、活性肽的筛选
对鉴定后ALC值大于80的23个肽进一步筛选，采用Pepsite2在线预测小分子肽与ACE蛋白表面的结合，其结果以P值表示，P值越小，表示结合力越大，即抑制活性可能更强。结合肽鉴定的ALC值。最终选定肽序列为Phe-Arg-Val-Trp的四肽进行合成，并验证其活性。
S5、活性验证
人工固相合成Phe-Arg-Val-Trp四肽后，采用高效液相色谱法进行ACE抑制活性测试。结果如图5所示，在浓度为18.34μM时，其ACE抑制率达到50％。
ACE抑制活性测定方法为：
将所有试剂溶解在硼酸盐缓冲液(200mM硼酸盐，300mM NaCl，pH＝8.3)中。接下来，将30μL的2.5mmol HHL和10μL的样品溶液混合并在37℃下预孵育6分钟。在相同条件下，用10μL硼酸盐缓冲液代替10μL样品溶液制备空白溶液。之后，分别将30μL预先孵育的ACE溶液分别加入空白和样品溶液中，然后在37℃孵育30分钟。最后添加60μL的0.1M HCl溶液淬灭整个反应。每个处理重复3次。通过配备有Angilent Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6×150mm，5um)的RP-HPLC(Agilent 1260)测定马尿酸(HA)的量。使用含0.05％TFA的Milli-Q水及乙腈的混合溶液等度洗脱，洗脱比例为75:25，流速为1mL/min。监测波长为在228nm。ACE抑制率的计算公式如下：ACE抑制率＝(A1-A2)/A1×100％，其中A1为空白溶液中HA的峰面积，而A2为含肽抑制剂时HA的峰面积。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一种珍珠贝肉来源ACE 活性抑制肽及其制备筛选方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 合浦珠母贝(Pinctada fucata)
<400> 1
Phe Arg Val Trp
1

Claims (5)

1.一种ACE活性抑制肽，其特征在于，氨基酸序列为：Phe-Arg-Val-Trp。
2.权利要求1所述的ACE活性抑制肽在制备血管紧张素转换酶抑制剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的血管紧张素转换酶抑制剂是治疗高血压的药物。
4.一种血管紧张素转换酶抑制剂，其特征在于，含有权利要求1的ACE活性抑制肽作为活性成分。
5.根据权利要求4所述的血管紧张素转换酶抑制剂，其特征在于，所述的血管紧张素转换酶抑制剂是治疗高血压的药物。
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