JP3379950B2 - 新規なペプチド - Google Patents
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- leu
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、例えば高血圧の予防
等を目的とする医薬品、健康食品等として有用なアンジ
オテンシン変換酵素の作用を阻害する新規なペプチドに
関するものである。 【０００２】 【従来の技術】わが国における主要疾病別受診状況をみ
ると、年々高血圧によるものが増加している。これは日
本人の食事パターンが欧米型食事へと変化してきたこと
など、食物による影響が大きな原因になっていると考え
られる。また、高血圧は長期間続くと、心疾患や脳血管
疾患の発症率が高くなることが知られており、早期の改
善が必要である。 【０００３】現在、この高血圧症を改善するために種々
の方法が用いられているが、その中で食事との関連が深
いと言われるタンパク質加水分解酵素であるレニンと高
血圧の原因物質であるアンジオテンシンとの調整が最も
有効な方法の一つとされている。 【０００４】このレニン−アンジオテンシン系の調整に
はアンジオテンシン変換酵素（AngiotensinConvertingE
nzyme、以下ＡＣＥと言う）が介在する。ＡＣＥはペプ
チドからジペプチドを遊離させるジペプチジルカルボキ
シラーゼであり、アンジオテンシンIから血圧を上昇さ
せる昇圧ペプチドであるアンジオテンシンIIの生成を促
進すると共に、血圧を低下させる降圧物質であるブラジ
キニンの分解に関与している。従って、このＡＣＥの作
用を阻害する物質は血圧降下作用を有する。 【０００５】一方、最近大豆、米ぬか、魚肉など各種食
品中にＡＣＥ阻害ペプチドが存在することが報告されて
いる〔食品工業、Vol.33,No.2,20〜30（1990）、Vol.4,
20〜25（1990）、Vol34,No.22,18〜26（1991)〕。そし
て、現在までにこのような食品から多数のＡＣＥ阻害ペ
プチドが単離されている。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】しかし、そのような食
品中からＡＣＥ阻害ペプチドを単離精製するには各種ク
ロマトグラフィー等を用いなければならず、操作が煩雑
で、いずれも極めて低収率である場合が多い。本発明者
らもすでにローヤルゼリー中にＡＣＥ阻害ペプチドが存
在することを見出し、これを酵素により加水分解する方
法によって取得したペプチドについて特許出願を行った
（特願平３−４２０２２号）。 【０００７】この発明は上記従来の技術に鑑みてなされ
たものであって、その目的は、ＡＣＥ阻害作用を有する
とともに、製造が容易で収率良く得られる新規なペプチ
ドを提供することにある。 【０００８】 【課題を解決するための手段】この発明はLeu−Tyr−Le
u−Proなる構造を有するペプチド（以下、ＳＰ４と称す
る）である。なお、Phe−Val−Tyr−Thr−Proなる構造
を有するペプチドを以下ＳＰ５と称し、Trp−Lys−Tyr
なる構造を有するペプチドを以下ＳＰ３と称する。ま
た、Pheはフェニルアラニン、Valはバリン、Tyrはチロ
シン、Thrはトレオニン、Proはプロリン、Leuはロイシ
ン、Trpはトリプトファン、Lysはリジンを意味する。 【０００９】ペプチドの化学合成法は技術的にはほぼ確
立しており、この発明のペプチドも公知の方法によって
合成することが可能である。なお、用いるアミノ酸は通
常Ｌ体が使用され、側鎖の官能基等は必要があれば公知
の保護基で保護される。 【００１０】得られたペプチドの構造確認は、例えば島
津製作所製全自動蛋白質一次構造分析装置ＰＳＱ−１に
より行うことができる。また、アミノ酸組成分析はWate
rs社製ＰＩＣＯ−ＴＡＧシステムにより行うことができ
る。 【００１１】次に、このようにして得られるペプチドを
そのＡＣＥ阻害作用に基づいて、食品（特に機能性食
品）として利用するためには、安全性等の問題から化学
合成法より、酵素合成法が適当であると考えられる。 【００１２】ペプチドの酵素合成法については、すでに
優れた総説が多数報告されている（「酵素の新機能開
発」、ｐ７５〜１２９、発行元：講談社サイエンティフ
ィク（１９８９年）など）が、ペプチド結合の種類によ
って合成の難易があり、またペプチド結合の種類に応じ
て適した酵素を選ぶ必要がある。従って、酵素合成法は
化学合成法とは異なり、完全な方法ではなく、まだ確立
した技術となっていないのが現状であり、目的とするペ
プチドごとに詳細な検討をすることが必要となる。 【００１３】用いる酵素としてはトリプシン、キモトリ
プシン、パパイン、パンクレアチン、ブロメライン、プ
ロリンエンドペプチターゼなどの蛋白分解酵素のほか、
細菌性蛋白分解酵素、例えば、ズブチリシン、サーモラ
イシン、ナガーゼ、プロテアーゼＡ，プロテアーゼＢ、
プロテアーゼＭ、プロテアーゼＮ、プロテアーゼＰ、プ
ロテアーゼＰ−６などが適当である。 【００１４】アミノ酸Ｃ端の官能基を反応に関与させな
いようにする保護基としては、メチル、エチル、プロピ
ルなどの短鎖アルキル基及びアミド型保護基を、アミノ
酸Ｎ端の保護基としてはアセチル、ベンゾイルなどのア
シル基及びベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカ
ルボニルなどのウレタン型保護基が用いられる。反応溶
媒は、酵素の至適ｐＨに合わせて公知の緩衝液を使用
し、これに適宜メタノール、エタノール、プロパノー
ル、ブタノール、グリセリン、エチレングリコール、
１，４−ブタンジオール、ジメチルホルムアミド、ジメ
チルスルホキシドなどの有機溶媒を加えることができ
る。 【００１５】 【実施例】（実施例１）以下に、Trp−Lys−Tyrなる構
造を有するペプチド（ＳＰ３）の酵素による合成法を示
す。 【００１６】グリセリン40mlと炭酸塩緩衝液（ｐＨ10.
4）7mlの混合溶媒に、Ｌ−アセチルトリプトファンメチ
ルエステル1.3g（最終濃度0.1Ｍ）、Ｌ−リジンメチル
エステル塩酸塩0.98g（最終濃度0.1Ｍ）を添加して懸濁
液を調製した。そして、室温で激しく攪拌しながら、α
−キモトリプシン62.5mg（最終濃度50μＭ）を炭酸塩緩
衝液3mlに溶解した溶液を約２分かけて滴下し、さらに
３分間攪拌した後、酢酸を加えて反応を停止させること
により、直線的に反応が進む速度論的制御反応を行っ
た。 【００１７】そして、アンモニア水にて中和後、酢酸エ
チル100mlを加え、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗
浄、さらに飽和食塩水で数回洗浄した。次に、１０％ク
エン酸溶液５０mlを加え、水層を抽出した後再び炭酸水
素ナトリウムで塩基性とし酢酸エチルで再抽出した。酢
酸エチル層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウム
で乾燥し減圧濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲル
のショートカラムに通し、クロロホルム：メタノール：
トリエチルアミン＝51：1：0.1の混合溶媒にて溶出し、
Ac-Trp−Lys−OMeを無色結晶として1.59g（83％）を得
た。 【００１８】次に、エタノール2mlと前記炭酸塩緩衝液3
mlの混合溶媒に、Trp−Lys−Tyr−OMe232mg（最終濃度
0.1Ｍ）、Ｌ−チロシンエチルエステル塩酸塩148mg（最
終濃度0.1Ｍ）を添加して懸濁液を得た。そして、室温
で激しく攪拌しながら、トリプシン3mg（最終濃度20μ
Ｍ）を炭酸塩緩衝液１mlに溶解した溶液を約２分間かけ
て滴下し、さらに３分間攪拌した後、酢酸を加えて反応
を停止させることにより速度論的制御反応を行った。 【００１９】この反応の収率を液体クロマトグラフィ
（ＨＰＬＣ）によって測定した。すなわち、反応混合物
にメタノールを加えて100mlとし、その５μlをＨＰＬＣ
に注入することによりクロマトグラムを得た。そして、
化学合成した標準品との面積比より収率を求めたとこ
ろ、約６８％という良好な収率でAc−Trp−Lys−Tyr−O
Etが得られていることが判明した。なお、ＨＰＬＣの測
定条件は次のとおりである。 【００２０】カラム：ＯＤＰ−５０、φ4.6×150mm、移
動相：アセトニトリル／水混合溶媒（30/70)、検出：紫
外線（ＵＶ）280nm、温度：室温、流量：0.6ml/ｍinま
た、常法に従って精製した保護ペプチドは、Ｃ端及びＮ
端の保護基を公知の塩基又は酸加水分解法により脱保護
を行い、ＳＰ３を無色の結晶として得た。得られたペプ
チドは、液体クロマト質量分析計（島津製作所製の商品
名ＬＣ−ＭＳ、ＱＰ1000ＥＸ）により分子量を測定した
ところ495であり、ペプチドシーケンサー（島津製作所
製の商品名ＰＳＱ−１）及びアミノ酸分析装置（Waters
社製商品名ＰＩＣＯ−ＴＡＧシステム）により構造分析
を行ったところ、Trp−Lys−Tyrであることが判明し
た。 【００２１】このように、酵素合成法によりＳＰ３を比
較的容易に、しかも収率良く収得できる。そして、ＡＣ
Ｅ阻害作用を有するこのペプチドは、適当な無毒性の経
口投与用担体と共に適宜な形状、形態からなる組成物と
して、高血圧の予防、高血圧傾向の緩和又は血圧調整を
目的として、医薬品又は健康食品として用いることがで
きる。 （実施例２）次に、Phe−Val−Tyr−Thr−Proなる構造
を有するペプチド（ＳＰ５）の化学合成法による製造法
について説明する。なお、略号は次のとおりである。 【００２２】Ｂｏｃ：tert-Butoxycarbonyl ＣＢＺ：Benzyloxycarbonyl ＡＡｎ：Ｃ端からｎ番目の原子に置換基を有するアミノ
酸 まず、Ｃ端アミノ酸であるプロリンメチルエステルをジ
クロロメタンに溶解し、ＣＢＺ−又はＢｏｃ−ＡＡ
2（トレオニン）（１等量）、Ｎ−ヒドロキシサクシン
イミド（１．２等量）、ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド（１．２等量）を加え、冷蔵庫内で２０〜４０時間攪
拌することによって縮合反応を行った。反応終了後、不
溶物（ジシクロヘキシルウレア）を留去し、有機層を５
％炭酸ナトリウム、水、１０％クエン酸、水で洗浄し、
無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、減圧濃縮してジペプチ
ドＢｏｃ−Thr−Proメチルエステルを得た。なお、必要
に応じてシリカゲルのカラムクラマトグラフィーによっ
て精製してもよい。 【００２３】次に、チロシンメチルエステル及び上記ジ
ペプチドの各々１当量を、前述の縮合条件で縮合させ
て、トリペプチドTyr−Thr−Proを得た。さらに、生成
したこのトリペプチドとＢｏｃ−Valを同様に縮合させ
て、テトラペプチドVal−Tyr−Thr−Proを得た。最後
に、このテトラペプチドとＢｏｃ−Pheを同様に縮合さ
せた。Ｎ端保護基は、ＣＢＺ基の場合は接触還元によっ
て、Ｂｏｃ基の場合はトリフルオロ酢酸によって除去し
た。以下同様の操作を繰り返し、最後に側鎖保護基とＣ
端のメチルエステルを常法により除去することによって
目的のペプチドＳＰ５が得られた。このペプチドの収率
は３９％で良好であった。 【００２４】このように、化学合成法によりＳＰ５を容
易に、かつ収率良く収得できる。得られたペプチドの構
造確認は、島津製作所製全自動蛋白質一次構造分析装置
ＰＳＱ−１により行った。またWaters社製ＰＩＣＯ−Ｔ
ＡＧシステムにより、アミノ酸組成分析を行った。その
結果を以下に示す。 （ＳＰ５の一次構造）Phe−Val−Tyr−Thr−Pro （ＳＰ５のアミノ酸組成）Phe19.9％、Val20.4％、Tyr2
0.7％、Thr19.8％、Pro19.4％ （実施例３）次に、実施例２と同様にして、この発明の
Leu−Tyr−Leu−Proなる構造を有するペプチド（ＳＰ
４）の化学合成法による製造法について説明する。 【００２５】実施例２において、ＣＢＺ−又はＢｏｃ−
ＡＡ2（トレオニン）（１等量）に代えてＣＢＺ−又は
Ｂｏｃ−ＡＡ2（ロイシン）（１等量）とし、縮合反応
によりジペプチド（Ｂｏｃ−Leu−Pro）を得た。次に、
これにチロシンメチルエステルを加えて縮合反応させ、
トリペプチド（Tyr−Leu−Pro）を得た。最後に、これ
にＢｏｃ−Leuを加えて縮合反応させて、目的とするテ
トラペプチドＳＰ４を得た。 【００２６】その収率は４７％と良好であった。このペ
プチドについて、一次構造とアミノ酸組成の分析を行っ
た。その結果を以下に示す。 （ＳＰ４の一次構造）Leu−Tyr−Leu−Pro （ＳＰ４のアミノ酸組成）Leu49.8％、Tyr25.8％、Pro2
4.4％ （実施例４）次に、実施例２と同様にして、Trp−Lys−
Tyrなる構造を有するペプチド（ＳＰ３）の化学合成法
による製造法について説明する。 【００２７】実施例２において、プロリンメチルエステ
ルに代えてチロシンメチルエステルを用い、ＣＢＺ−又
はＢｏｃ−ＡＡ2（トレオニン）（１等量）に代えてＣ
ＢＺ−又はＢｏｃ−ＡＡ3（リジン）（１等量）とし、
縮合反応によりジペプチド（Ｂｏｃ−Lys−Tyr）を得
た。次に、これにＢｏｃ−Trpを加えて縮合反応させ、
目的とするトリペプチドＳＰ３を得た。 【００２８】このトリペプチドの収率は５３％と良好で
あった。このペプチドについて、一次構造とアミノ酸組
成の分析を行った。その結果を以下に示す。 （ＳＰ３の一次構造）Trp−Lys−Tyr （ＳＰ３のアミノ酸組成）ＰＩＣＯ−ＴＡＧシステムに
よる測定では、Trpは分解して測定不能であった。従っ
て、残りのLysは51.1％、Tyrは48.9％であった。なお、
前記ＰＳＱ−１による３成分の測定結果は、Trp32.1
％、Lys34.8％、Tyr33.1％であった。 （実施例５）次に、前記ペプチドのＡＣＥ阻害活性の測
定について説明する。（ＡＣＥ阻害活性測定）１ｇの家
兎の肺をアセトン中で沈降、乾燥した粉末（シグマ社
製）を5mlのリン酸緩衝液（ｐＨ8.3)に溶解し、10000
Ｇ、３０分の遠心分離処理後の上清液を上記緩衝液で３
倍に希釈してＡＣＥ酵素液として、酵素阻害を測定し
た。その測定法はBiochem.Pharm.,20,p1637〜1648(197
1)及びAnal.Biochem.,84,p361〜369(1978)に記載の方法
に準じた。 【００２９】即ち、100mMリン酸カリウム緩衝液（300mM
塩化ナトリウムを含む、ｐＨ8.3）に、基質として1mMト
リペプチド（Hip−His−Leu，ペプチド研究所製）を100
μl、ＡＣＥ酵素液100μl及び試料液100μlを加え、３
７℃、３０分間の反応後、沸騰水中で５分間加熱するこ
とにより反応を終了させ、反応生成物の馬尿酸をトリク
ロロトリアジン試薬で誘導体化し、測定波長382nmにお
ける吸光度を比色定量する方法である。 【００３０】また、阻害率は次式により算出した。 阻害率＝（ＥO−ＥS）／ＥO×１００（％） ＥO：阻害剤を含まないときの382nmの吸光度 ＥS：阻害剤を含むときの382nmの吸光度 そして、阻害率50％のときの試料濃度をＩＣ50（μg/m
l）とした。このＩＣ50の値は低い方がＡＣＥ阻害活性
が高いことになる。また、対照例として、特願平３−４
２０２２号で開示したペプチド、即ちTyr−Asn−Glu−V
al−Pro（ＲＪＰ5）、Ser−Leu−Pro−Lys−Leu−His−
Glu−Trp（ＲＪＰ8）、Ser−Leu−Pro−Ile−His−Glu
−Trp−Lys（ＲＪＰ9）についても同様にＩＣ50を測定
した。その結果、次の表１のような結果が得られた。 【００３１】 【表１】 表１に示したように、各実施例5-1〜5-3のＩＣ50の値
は、各対照例5-4〜5-6とほぼ同等に低く、十分なＡＣＥ
阻害作用を有することがわかる。 【００３２】 【発明の効果】以上詳述したようにこの発明のペプチド
は、新規なペプチドであり、アンジオテンシン酵素阻害
作用を有するとともに、製造が容易で収率良く得られ、
高血圧の予防、治療などを目的とした医薬品や食品とし
て有用であるという優れた効果を奏する。 【００３３】 【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列 Phe Val Tyr Thr Pro １ ５ 配列番号：２ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列 Leu Tyr Leu Pro １ 配列番号：３ 配列の長さ：３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列 Trp Lys Tyr １
等を目的とする医薬品、健康食品等として有用なアンジ
オテンシン変換酵素の作用を阻害する新規なペプチドに
関するものである。 【０００２】 【従来の技術】わが国における主要疾病別受診状況をみ
ると、年々高血圧によるものが増加している。これは日
本人の食事パターンが欧米型食事へと変化してきたこと
など、食物による影響が大きな原因になっていると考え
られる。また、高血圧は長期間続くと、心疾患や脳血管
疾患の発症率が高くなることが知られており、早期の改
善が必要である。 【０００３】現在、この高血圧症を改善するために種々
の方法が用いられているが、その中で食事との関連が深
いと言われるタンパク質加水分解酵素であるレニンと高
血圧の原因物質であるアンジオテンシンとの調整が最も
有効な方法の一つとされている。 【０００４】このレニン−アンジオテンシン系の調整に
はアンジオテンシン変換酵素（AngiotensinConvertingE
nzyme、以下ＡＣＥと言う）が介在する。ＡＣＥはペプ
チドからジペプチドを遊離させるジペプチジルカルボキ
シラーゼであり、アンジオテンシンIから血圧を上昇さ
せる昇圧ペプチドであるアンジオテンシンIIの生成を促
進すると共に、血圧を低下させる降圧物質であるブラジ
キニンの分解に関与している。従って、このＡＣＥの作
用を阻害する物質は血圧降下作用を有する。 【０００５】一方、最近大豆、米ぬか、魚肉など各種食
品中にＡＣＥ阻害ペプチドが存在することが報告されて
いる〔食品工業、Vol.33,No.2,20〜30（1990）、Vol.4,
20〜25（1990）、Vol34,No.22,18〜26（1991)〕。そし
て、現在までにこのような食品から多数のＡＣＥ阻害ペ
プチドが単離されている。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】しかし、そのような食
品中からＡＣＥ阻害ペプチドを単離精製するには各種ク
ロマトグラフィー等を用いなければならず、操作が煩雑
で、いずれも極めて低収率である場合が多い。本発明者
らもすでにローヤルゼリー中にＡＣＥ阻害ペプチドが存
在することを見出し、これを酵素により加水分解する方
法によって取得したペプチドについて特許出願を行った
（特願平３−４２０２２号）。 【０００７】この発明は上記従来の技術に鑑みてなされ
たものであって、その目的は、ＡＣＥ阻害作用を有する
とともに、製造が容易で収率良く得られる新規なペプチ
ドを提供することにある。 【０００８】 【課題を解決するための手段】この発明はLeu−Tyr−Le
u−Proなる構造を有するペプチド（以下、ＳＰ４と称す
る）である。なお、Phe−Val−Tyr−Thr−Proなる構造
を有するペプチドを以下ＳＰ５と称し、Trp−Lys−Tyr
なる構造を有するペプチドを以下ＳＰ３と称する。ま
た、Pheはフェニルアラニン、Valはバリン、Tyrはチロ
シン、Thrはトレオニン、Proはプロリン、Leuはロイシ
ン、Trpはトリプトファン、Lysはリジンを意味する。 【０００９】ペプチドの化学合成法は技術的にはほぼ確
立しており、この発明のペプチドも公知の方法によって
合成することが可能である。なお、用いるアミノ酸は通
常Ｌ体が使用され、側鎖の官能基等は必要があれば公知
の保護基で保護される。 【００１０】得られたペプチドの構造確認は、例えば島
津製作所製全自動蛋白質一次構造分析装置ＰＳＱ−１に
より行うことができる。また、アミノ酸組成分析はWate
rs社製ＰＩＣＯ−ＴＡＧシステムにより行うことができ
る。 【００１１】次に、このようにして得られるペプチドを
そのＡＣＥ阻害作用に基づいて、食品（特に機能性食
品）として利用するためには、安全性等の問題から化学
合成法より、酵素合成法が適当であると考えられる。 【００１２】ペプチドの酵素合成法については、すでに
優れた総説が多数報告されている（「酵素の新機能開
発」、ｐ７５〜１２９、発行元：講談社サイエンティフ
ィク（１９８９年）など）が、ペプチド結合の種類によ
って合成の難易があり、またペプチド結合の種類に応じ
て適した酵素を選ぶ必要がある。従って、酵素合成法は
化学合成法とは異なり、完全な方法ではなく、まだ確立
した技術となっていないのが現状であり、目的とするペ
プチドごとに詳細な検討をすることが必要となる。 【００１３】用いる酵素としてはトリプシン、キモトリ
プシン、パパイン、パンクレアチン、ブロメライン、プ
ロリンエンドペプチターゼなどの蛋白分解酵素のほか、
細菌性蛋白分解酵素、例えば、ズブチリシン、サーモラ
イシン、ナガーゼ、プロテアーゼＡ，プロテアーゼＢ、
プロテアーゼＭ、プロテアーゼＮ、プロテアーゼＰ、プ
ロテアーゼＰ−６などが適当である。 【００１４】アミノ酸Ｃ端の官能基を反応に関与させな
いようにする保護基としては、メチル、エチル、プロピ
ルなどの短鎖アルキル基及びアミド型保護基を、アミノ
酸Ｎ端の保護基としてはアセチル、ベンゾイルなどのア
シル基及びベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカ
ルボニルなどのウレタン型保護基が用いられる。反応溶
媒は、酵素の至適ｐＨに合わせて公知の緩衝液を使用
し、これに適宜メタノール、エタノール、プロパノー
ル、ブタノール、グリセリン、エチレングリコール、
１，４−ブタンジオール、ジメチルホルムアミド、ジメ
チルスルホキシドなどの有機溶媒を加えることができ
る。 【００１５】 【実施例】（実施例１）以下に、Trp−Lys−Tyrなる構
造を有するペプチド（ＳＰ３）の酵素による合成法を示
す。 【００１６】グリセリン40mlと炭酸塩緩衝液（ｐＨ10.
4）7mlの混合溶媒に、Ｌ−アセチルトリプトファンメチ
ルエステル1.3g（最終濃度0.1Ｍ）、Ｌ−リジンメチル
エステル塩酸塩0.98g（最終濃度0.1Ｍ）を添加して懸濁
液を調製した。そして、室温で激しく攪拌しながら、α
−キモトリプシン62.5mg（最終濃度50μＭ）を炭酸塩緩
衝液3mlに溶解した溶液を約２分かけて滴下し、さらに
３分間攪拌した後、酢酸を加えて反応を停止させること
により、直線的に反応が進む速度論的制御反応を行っ
た。 【００１７】そして、アンモニア水にて中和後、酢酸エ
チル100mlを加え、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で洗
浄、さらに飽和食塩水で数回洗浄した。次に、１０％ク
エン酸溶液５０mlを加え、水層を抽出した後再び炭酸水
素ナトリウムで塩基性とし酢酸エチルで再抽出した。酢
酸エチル層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウム
で乾燥し減圧濃縮した。得られた粗生成物をシリカゲル
のショートカラムに通し、クロロホルム：メタノール：
トリエチルアミン＝51：1：0.1の混合溶媒にて溶出し、
Ac-Trp−Lys−OMeを無色結晶として1.59g（83％）を得
た。 【００１８】次に、エタノール2mlと前記炭酸塩緩衝液3
mlの混合溶媒に、Trp−Lys−Tyr−OMe232mg（最終濃度
0.1Ｍ）、Ｌ−チロシンエチルエステル塩酸塩148mg（最
終濃度0.1Ｍ）を添加して懸濁液を得た。そして、室温
で激しく攪拌しながら、トリプシン3mg（最終濃度20μ
Ｍ）を炭酸塩緩衝液１mlに溶解した溶液を約２分間かけ
て滴下し、さらに３分間攪拌した後、酢酸を加えて反応
を停止させることにより速度論的制御反応を行った。 【００１９】この反応の収率を液体クロマトグラフィ
（ＨＰＬＣ）によって測定した。すなわち、反応混合物
にメタノールを加えて100mlとし、その５μlをＨＰＬＣ
に注入することによりクロマトグラムを得た。そして、
化学合成した標準品との面積比より収率を求めたとこ
ろ、約６８％という良好な収率でAc−Trp−Lys−Tyr−O
Etが得られていることが判明した。なお、ＨＰＬＣの測
定条件は次のとおりである。 【００２０】カラム：ＯＤＰ−５０、φ4.6×150mm、移
動相：アセトニトリル／水混合溶媒（30/70)、検出：紫
外線（ＵＶ）280nm、温度：室温、流量：0.6ml/ｍinま
た、常法に従って精製した保護ペプチドは、Ｃ端及びＮ
端の保護基を公知の塩基又は酸加水分解法により脱保護
を行い、ＳＰ３を無色の結晶として得た。得られたペプ
チドは、液体クロマト質量分析計（島津製作所製の商品
名ＬＣ−ＭＳ、ＱＰ1000ＥＸ）により分子量を測定した
ところ495であり、ペプチドシーケンサー（島津製作所
製の商品名ＰＳＱ−１）及びアミノ酸分析装置（Waters
社製商品名ＰＩＣＯ−ＴＡＧシステム）により構造分析
を行ったところ、Trp−Lys−Tyrであることが判明し
た。 【００２１】このように、酵素合成法によりＳＰ３を比
較的容易に、しかも収率良く収得できる。そして、ＡＣ
Ｅ阻害作用を有するこのペプチドは、適当な無毒性の経
口投与用担体と共に適宜な形状、形態からなる組成物と
して、高血圧の予防、高血圧傾向の緩和又は血圧調整を
目的として、医薬品又は健康食品として用いることがで
きる。 （実施例２）次に、Phe−Val−Tyr−Thr−Proなる構造
を有するペプチド（ＳＰ５）の化学合成法による製造法
について説明する。なお、略号は次のとおりである。 【００２２】Ｂｏｃ：tert-Butoxycarbonyl ＣＢＺ：Benzyloxycarbonyl ＡＡｎ：Ｃ端からｎ番目の原子に置換基を有するアミノ
酸 まず、Ｃ端アミノ酸であるプロリンメチルエステルをジ
クロロメタンに溶解し、ＣＢＺ−又はＢｏｃ−ＡＡ
2（トレオニン）（１等量）、Ｎ−ヒドロキシサクシン
イミド（１．２等量）、ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド（１．２等量）を加え、冷蔵庫内で２０〜４０時間攪
拌することによって縮合反応を行った。反応終了後、不
溶物（ジシクロヘキシルウレア）を留去し、有機層を５
％炭酸ナトリウム、水、１０％クエン酸、水で洗浄し、
無水硫酸ナトリウムにて乾燥後、減圧濃縮してジペプチ
ドＢｏｃ−Thr−Proメチルエステルを得た。なお、必要
に応じてシリカゲルのカラムクラマトグラフィーによっ
て精製してもよい。 【００２３】次に、チロシンメチルエステル及び上記ジ
ペプチドの各々１当量を、前述の縮合条件で縮合させ
て、トリペプチドTyr−Thr−Proを得た。さらに、生成
したこのトリペプチドとＢｏｃ−Valを同様に縮合させ
て、テトラペプチドVal−Tyr−Thr−Proを得た。最後
に、このテトラペプチドとＢｏｃ−Pheを同様に縮合さ
せた。Ｎ端保護基は、ＣＢＺ基の場合は接触還元によっ
て、Ｂｏｃ基の場合はトリフルオロ酢酸によって除去し
た。以下同様の操作を繰り返し、最後に側鎖保護基とＣ
端のメチルエステルを常法により除去することによって
目的のペプチドＳＰ５が得られた。このペプチドの収率
は３９％で良好であった。 【００２４】このように、化学合成法によりＳＰ５を容
易に、かつ収率良く収得できる。得られたペプチドの構
造確認は、島津製作所製全自動蛋白質一次構造分析装置
ＰＳＱ−１により行った。またWaters社製ＰＩＣＯ−Ｔ
ＡＧシステムにより、アミノ酸組成分析を行った。その
結果を以下に示す。 （ＳＰ５の一次構造）Phe−Val−Tyr−Thr−Pro （ＳＰ５のアミノ酸組成）Phe19.9％、Val20.4％、Tyr2
0.7％、Thr19.8％、Pro19.4％ （実施例３）次に、実施例２と同様にして、この発明の
Leu−Tyr−Leu−Proなる構造を有するペプチド（ＳＰ
４）の化学合成法による製造法について説明する。 【００２５】実施例２において、ＣＢＺ−又はＢｏｃ−
ＡＡ2（トレオニン）（１等量）に代えてＣＢＺ−又は
Ｂｏｃ−ＡＡ2（ロイシン）（１等量）とし、縮合反応
によりジペプチド（Ｂｏｃ−Leu−Pro）を得た。次に、
これにチロシンメチルエステルを加えて縮合反応させ、
トリペプチド（Tyr−Leu−Pro）を得た。最後に、これ
にＢｏｃ−Leuを加えて縮合反応させて、目的とするテ
トラペプチドＳＰ４を得た。 【００２６】その収率は４７％と良好であった。このペ
プチドについて、一次構造とアミノ酸組成の分析を行っ
た。その結果を以下に示す。 （ＳＰ４の一次構造）Leu−Tyr−Leu−Pro （ＳＰ４のアミノ酸組成）Leu49.8％、Tyr25.8％、Pro2
4.4％ （実施例４）次に、実施例２と同様にして、Trp−Lys−
Tyrなる構造を有するペプチド（ＳＰ３）の化学合成法
による製造法について説明する。 【００２７】実施例２において、プロリンメチルエステ
ルに代えてチロシンメチルエステルを用い、ＣＢＺ−又
はＢｏｃ−ＡＡ2（トレオニン）（１等量）に代えてＣ
ＢＺ−又はＢｏｃ−ＡＡ3（リジン）（１等量）とし、
縮合反応によりジペプチド（Ｂｏｃ−Lys−Tyr）を得
た。次に、これにＢｏｃ−Trpを加えて縮合反応させ、
目的とするトリペプチドＳＰ３を得た。 【００２８】このトリペプチドの収率は５３％と良好で
あった。このペプチドについて、一次構造とアミノ酸組
成の分析を行った。その結果を以下に示す。 （ＳＰ３の一次構造）Trp−Lys−Tyr （ＳＰ３のアミノ酸組成）ＰＩＣＯ−ＴＡＧシステムに
よる測定では、Trpは分解して測定不能であった。従っ
て、残りのLysは51.1％、Tyrは48.9％であった。なお、
前記ＰＳＱ−１による３成分の測定結果は、Trp32.1
％、Lys34.8％、Tyr33.1％であった。 （実施例５）次に、前記ペプチドのＡＣＥ阻害活性の測
定について説明する。（ＡＣＥ阻害活性測定）１ｇの家
兎の肺をアセトン中で沈降、乾燥した粉末（シグマ社
製）を5mlのリン酸緩衝液（ｐＨ8.3)に溶解し、10000
Ｇ、３０分の遠心分離処理後の上清液を上記緩衝液で３
倍に希釈してＡＣＥ酵素液として、酵素阻害を測定し
た。その測定法はBiochem.Pharm.,20,p1637〜1648(197
1)及びAnal.Biochem.,84,p361〜369(1978)に記載の方法
に準じた。 【００２９】即ち、100mMリン酸カリウム緩衝液（300mM
塩化ナトリウムを含む、ｐＨ8.3）に、基質として1mMト
リペプチド（Hip−His−Leu，ペプチド研究所製）を100
μl、ＡＣＥ酵素液100μl及び試料液100μlを加え、３
７℃、３０分間の反応後、沸騰水中で５分間加熱するこ
とにより反応を終了させ、反応生成物の馬尿酸をトリク
ロロトリアジン試薬で誘導体化し、測定波長382nmにお
ける吸光度を比色定量する方法である。 【００３０】また、阻害率は次式により算出した。 阻害率＝（ＥO−ＥS）／ＥO×１００（％） ＥO：阻害剤を含まないときの382nmの吸光度 ＥS：阻害剤を含むときの382nmの吸光度 そして、阻害率50％のときの試料濃度をＩＣ50（μg/m
l）とした。このＩＣ50の値は低い方がＡＣＥ阻害活性
が高いことになる。また、対照例として、特願平３−４
２０２２号で開示したペプチド、即ちTyr−Asn−Glu−V
al−Pro（ＲＪＰ5）、Ser−Leu−Pro−Lys−Leu−His−
Glu−Trp（ＲＪＰ8）、Ser−Leu−Pro−Ile−His−Glu
−Trp−Lys（ＲＪＰ9）についても同様にＩＣ50を測定
した。その結果、次の表１のような結果が得られた。 【００３１】 【表１】 表１に示したように、各実施例5-1〜5-3のＩＣ50の値
は、各対照例5-4〜5-6とほぼ同等に低く、十分なＡＣＥ
阻害作用を有することがわかる。 【００３２】 【発明の効果】以上詳述したようにこの発明のペプチド
は、新規なペプチドであり、アンジオテンシン酵素阻害
作用を有するとともに、製造が容易で収率良く得られ、
高血圧の予防、治療などを目的とした医薬品や食品とし
て有用であるという優れた効果を奏する。 【００３３】 【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列 Phe Val Tyr Thr Pro １ ５ 配列番号：２ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列 Leu Tyr Leu Pro １ 配列番号：３ 配列の長さ：３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド配列 Trp Lys Tyr １
フロントページの続き
(56)参考文献 食品工業，1991年，34（22），18−26
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07K 5/103
ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 Leu−Tyr−Leu−Proなる構造を有するペ
プチド。
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- 2001-08-30 JP JP2001261168A patent/JP3379950B2/ja not_active Expired - Lifetime
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|---|
| 食品工業，１９９１年，３４（２２），１８−２６ |
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