JP6744079B2 - カスパーゼ−１４発現促進剤 - Google Patents

Description

本発明は、カスパーゼ−１４発現を促進し、皮膚の自然保湿因子の重要な構成物質であるアミノ酸を維持、増大させ、さらには、アトピー性皮膚炎、乾癬などの皮膚症状を予防又は改善、さらには日焼け防止剤有効な製剤に関する。

カスパーゼはCysteine-ASPartic-acid-proteASEを略したもので、システインプロテアーゼの１種であり、現在のところ１４種類知られている。
そのうち、カスパーゼ−１４は、皮膚の保湿に重要な役割を果たすフィラグリンをいくつかのペプチドに分解し、皮膚の自然保湿因子（ＮＭＦ）を維持、増大させる段階の１つとして重要な役割を担っている。(非特許文献１)
さらにカスパーゼ−１４の活性化はアトピー性皮膚炎や乾癬、接触性皮膚炎に有効なことがしられている。（非特許文献２）
また、日焼け防止剤として、カスパーゼ−１４が利用されている。（特許文献１）
さらにカスパーゼ−１４活性化剤として、アツケシソウ、桃、大豆種子、スイートバジル、キュウリ等を配合し、皮膚の湿潤、表皮分化過程の調節、皮膚バリアー強度、または外部ストレス（特に紫外線照射による外部ストレス）に対する保護に有効であることが知られている。（特許文献２）
さらに、日本人皮膚、角質層のカスパーゼ−１４の活性は、白人種皮膚、角質層に比較して半分以下であり、特に日本人にはカスパーゼ−１４活性化剤が必要とされている。（特許文献３）

真珠や貝殻の真珠層に含まれる不溶性タンパク質コンキオリンは加水分解され広く化粧品原料として利用されている。
真珠や貝殻の真珠層に含まれる可溶性のタンパク質は一部皮膚外用剤や角化促進剤として利用されている。（特許文献４）

国際公開第２００８／０２５８３０号 米国特許出願公開第２０１２／２３０９３０号明細書 特表２０１４−５０７４７２公報 特開２０１１−１６２４６９公報 Hosteら、J. Invest. Dermatol. Abstract、2007、S71 Hvidら、Exp Dermatol. 2011 Aug;20(8):633-6）

本発明の目的はカスパーゼ−１４発現を促進することによって、皮膚の自然保湿因子の重要な構成物質であるアミノ酸を維持、増大させ、さらには、アトピー性皮膚炎、乾癬などの皮膚症状を予防又は改善、さらには日焼け防止剤有効な製剤を得ることにある。

本発明者らが鋭意検討した結果、真珠や貝殻の真珠層に含まれるタンパク質の加水分解物にカスパーゼ−１４発現を促進する作用があることがわかった。
真珠や貝殻の真珠層はアコヤガイ、クロチョウガイ、シロチョウガイ等の真珠層を有する貝殻及びその真珠を、原料として用いる。
必要に応じて、真珠は核を取り除き、貝殻は付着物、稜柱層を取り除いたのち、粉砕する。これに酸やキレート剤を加える。酸は塩酸、硫酸等の無機酸、酢酸、乳酸等の有機酸から選択でき、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）、ジ酒石酸、クエン酸、ポリリン酸、メタリン酸、又はこれらの塩が挙げられる。

この操作によってカルシウムとともに、目的の可溶性タンパク質は溶解するので、まず不溶物を取り除く。ただこの不溶物は、皮膚外用剤の原料として有用なコンキオリンと呼ばれる不溶性のタンパク質が大部分を占めるので、場合によっては不溶物は取り除かないこともある。
また、溶解物中にはカルシウムイオン、用いた酸の陰イオンやキレート剤等が多く存在するので、必要に応じて除去する。
除去する方法は限外濾過、イオン交換法、膜分画法、ゲル濾過法、電気透析法、透析法、これらの組合せなどにより選択する。
得られた物質を電気泳動で分析すると、主に、５５ｋＤａと１６ｋＤａでバンドが確認されるが、限外濾過では１００ｋＤａでも通過しない。このことを理解して分画や必要に応じて加水分解等の処理をする必要がある。
さらに必要に応じて加水分解する。
方法は、塩酸、硫酸、硝酸及びリン酸等の無機酸、酢酸、ギ酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸及びクエン酸等の有機酸等の１種以上を必要に応じて加温や撹拌を加えつつ加水分解する方法やパパイン、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン等の蛋白分解酵素で分解する方法等がある。

以上のアコヤ貝真珠層及び真珠の可溶性タンパク質及び又はその加水分解物の他に、医薬品、食品、化粧品に利用できる原料とともに、製剤を作成するか、既存の医薬品、食品、化粧品にこれらを加えて利用することもできる。
利用できる原料を例示すれば、
アボガド油、アーモンド油、ウイキョウ油、エゴマ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラファー油、ゴマ油、カカオ脂、カミツレ油、カロット油、キューカンバー油、牛脂脂肪酸、ククイナッツ油、サフラワー油、シア脂、液状シア脂、大豆油、ツバキ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パーシック油、ヒマシ油、綿実油、落花生油、タートル油、ミンク油、卵黄油、パーム油、パーム核油、モクロウ、ヤシ油、牛脂、豚脂、スクワレン、スクワラン、プリスタン又はこれら油脂類の水素添加物（硬化油等）等の各種油脂類。
ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、カンデリラロウ、モンタンロウ、セラックロウ、ライスワックス等のロウ類。
流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、オゾケライド、セレシン、マイクロクリスタンワックス等の鉱物油。

ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、12-ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール油、ラノリン脂肪酸等の脂肪酸類。
エタノール、イソピロパノール、ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、フェノキシエタノール、2-ヘキシルデカノール、イソステアリルアルコール、2-オクチルドデカノール等のアルコール類。
エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ペンチルグリコール、グリセリン、ペンタエリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、ガラクチトール、ソルビトール、ラクチトール、マルチトール等の多価アルコール類。

ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸オレイル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル、酢酸ラノリン、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸プロピレングリコール、ジオレイン酸プロピレングリコール等のエステル類。
ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、パルミチン酸亜鉛等の金属セッケン類。
アラビアゴム、グアヤク脂、カラヤゴム、トラガントゴム、クインシード、寒天、カゼイン、乳糖、果糖、ショ糖又はそのエステル、トレハロース又はその誘導体、デキストリン、ゼラチン、ペクチン、デンプン、カラギーナン、カルボキシメチルキチン又はキトサン、エチレンオキサイド等のアルキレン(Ｃ２〜Ｃ４)オキサイドが付加されたヒドロキシアルキル(Ｃ２〜Ｃ４)キチン又はキトサン、低分子キチン又はキトサン、キトサン塩、硫酸化キチン又はキトサン、リン酸化キチン又はキトサン、アルギン酸又はその塩、ヒアルロン酸又はその塩、コンドロイチン硫酸又はその塩、ヘパリン、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ニトロセルロース、結晶セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメタアクリレート、ポリアクリル酸塩、ポリエチレンオキサイドやポリプロピレンオキサイド等のポリアルキレンオキサイド又はその架橋重合物、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレンイミン等のガム質、糖類又は水溶性高分子化合物。
アルキルカルボン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、アルキルアミン塩、アルキル四級アンモニウム塩、カルボン酸型両性界面活性剤、硫酸エステル型両性界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル型両性界面活性剤、エーテル型非イオン界面活性剤、エーテルエステル型非イオン界面活性剤、エステル型非イオン界面活性剤、ブロックポリマー型非イオン界面活性剤、含窒素型非イオン界面活性剤等のアニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤。

レチノール、レチナール、デヒドロレチナール、カロチン、リコピン、チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩、リボフラビン、ピリドキシン、シアノコバラミン、葉酸類、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン類、コリン、イノシトール類、ビタミンＣ又はその誘導体、エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、ビタミンＥ又はその誘導体、ユビキノン類等の各種ビタミン類又はその誘導体。
バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒドロキシリジン、オルニチン、ヒスチジン等や、それらの硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、クエン酸塩、或いはピロリドンカルボン酸のごときアミノ酸誘導体等の各種アミノ酸類。

赤芽柏、地黄、木通、地胆頭、一薬草、イチョウ、ウーロン茶、ウイキョウ、ウコン、夏枯草、陳皮、エゾウコギ、決明子、オウレン、白朮、オオバナサルスベリ、オクラ、オタネニンジン又はトチバニンジン (人参)、オリーブ、オレガノ、オレンジ、カミツレ又はローマカミツレ、カムカム、ガラナ、厚朴、ギョリュウ、グースベリー、クララ、クランベリー、グレープフルーツ、クローブ、コブシ、モクレン、威霊仙、サクラ、升麻、サンシチニンジン、山茱萸、山椒、サンズコン、シクンシ、シソ紫蘇、紫蘇、シャクヤク、スイカズラ、セイヨウトチノキ、セロリ、センキュウ、センブリ、ダイオウ、タチジャコウソウ、チクセツニンジン、テングサ、甜茶、テンダイウヤク、トクサ、ドクダミ、トチュウ、トネリコ、ナツメ、桂皮、五倍子、ノイバラ、ノバラ、ハトムギ、バラ、菱実、ビワ、ブラックベリー、プルーン、ホウノキ、ボウフウ(防風)、ホオノキ、ボダイジュ、ボタン、ホップ、ホホバ、マオウ、マカ、マカデミアナッツ、桑白皮、苦参、マンネンタケ、枳実、ミロバラン、ムクロジ、ムラサキ、益母草、メマツヨイグサ、メリッサ、メリロート、モッコウ、ヤーコン、 ユーカリ、ユキノシタ、ユッカ、ユズ、ユリ、ヨロイグサ、ヨモギ、ラベンダー、レモン、レモングラス、ローズマリー、地楡、クロレラ、クロレラ、コンブ、ワカメ、ジャイアントケルプ、ヒジキ、ヒバマタ、キリンサイ、アサクサノリ、スサビノリ、スピルリナ、イシゲ、イロロ、フクロノリ等の植物、海藻、藻類の各種抽出物。

馬又は豚の胎盤抽出物、シルク蛋白及びその分解物又はそれらの誘導体、牛乳、カゼイン及びその分解物又はそれらの誘導体、脱脂粉乳及びその分解物又はそれらの誘導体、ラクトフェリン又はその分解物、鶏卵成分、魚肉分解物、核酸関連物質（リボ核酸、デオキシリボ核酸）等の動物系原料由来物質。
海洋成分深層水、海水塩、海水乾燥物、死海又は大西洋又は太平洋の海より得た無機塩、海泥等の海洋産物。
酵母菌抽出エキス、細菌代謝物、細菌抽出エキス、カビ又は放線菌代謝物、カビ又は放線菌抽出エキス、納豆菌代謝物、納豆抽出エキス、米発酵エキス、米糠（赤糠、白糠）発酵エキス、生乳又は脱脂粉乳の乳酸発酵物、マメ科植物の乳酸菌発酵物、ココヤシ属植物の乳酸菌発酵物等の菌類由来物質。
グリコール酸、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸等のα-ヒドロキシ酸類。
無水ケイ酸、ケイ酸マグネシウム、タルク、カオリン、ベントナイト、マイカ、雲母チタン、オキシ塩化ビスマス、酸化ジルコニウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、酸化チタン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、黄酸化鉄、ベンガラ、黒酸化鉄、グンジョウ、酸化クロム、水酸化クロム、カーボンブラック、カラミン等の無機顔料。
ベンゾフェノン誘導体、パラアミノ安息香酸誘導体、メトキシ桂皮酸誘導体、サリチル酸誘導体、ウロカニン酸誘導等の紫外線吸収または遮断剤。

パラアミノ安息香酸誘導体、サルチル酸誘導体、アントラニル酸誘導体、クマリン誘導体、アミノ酸系化合物、ベンゾトリアゾール誘導体、ハイドロキノン又はその誘導体、ニコチン酸誘導体、コウジ酸又はその誘導体、オキシベンゾン、ベンゾフェノン、アルブチン、グアイアズレン、シコニン、バイカリン、バイカレイン、ベルベリン、胎盤エキス、エラグ酸、ルシノール等の美白剤。
イクタモール、インドメタシン、カオリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸メチル、アセチルサリチル酸、塩酸ジフェンヒドラミン、d-カンフル、dl-カンフル、ヒドロコルチゾン、グアイアズレン、カマズレン、マレイン酸クロルフェニラミン、グリチルリチン酸又はその塩、グリチルレチン酸又はその塩の抗炎症剤。
アクリノール、イオウ、グルコン酸カルシウム、グルコン酸クロルヘキシジン、トリクロサン等の抗菌・殺菌・消毒薬。
ジャコウ、シベット、カストリウム、アンバーグリス、イランイラン精油、イリス精油、ウイキョウ精油、オレンジ精油、カルダモン精油、シンナモン精油、ゲラニウム精油、コパイババルサム精油、シダーウッド精油、ジャスミン精油、バラ精油、ベルガモット精油、ラベンダー精油、レモングラス精油、レモン精油、ローズマリー精油等の動植物性香料、その他合成香料等。
感光素１０１号、感光素２０１号、感光素４０１号、感光素３０１号、ヒノキチオール、パントテン酸又はその誘導体、アラントイン、ペンタデカン酸グリセリド、尿素、グアニジン等の各種薬剤。
その他ホルモン類、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。

これらより、種々選択し、任意の形態にして利用に供する。形態の例としては、カプセル、粉末、顆粒、固形、液体、ゲル、気泡、乳液、クリーム、軟膏、シート等が挙げられる。
なお、アコヤ貝真珠層及び真珠の可溶性タンパク質及び又はその加水分解物の配合量は目的や剤形その他の要因で大きくかわるが、製剤の好ましくは０．００００１〜１０重量％、さらに好ましくは０．０００１〜１重量％を配合する。

実施例−１
アコヤ貝貝殻の付着物を取り除き、稜柱層をグラインダー等により削り除去したのち、約１〜５mm程度に粉砕したアコヤガイ貝殻真珠層４０ｇに、０．５Ｎ-ＥＤＴＡ-２Ｎａ水溶液（水酸化ナトリウムでｐＨを８．０に調整した）８リッターを加え、２４時間、撹拌して、真珠層の主成分である炭酸カルシウムを脱灰した。
これを遠心分離し、上澄を濾過した。この濾液を限外濾過（ＦｌｅｘＳｔａｎｄ^ＴＭＢｅｎｃｈｔｏｐ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケア社製）に５０００ＮＭＷＣのＨｏｌｌｏｗ Ｆｉｂｅｒ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（表面積１．１５ｍ^２）を装着したものに通液することでカルシウム等の低分子量の物質を除去して、粗可溶性タンパク液を得た。この液を固形分量として０．０００１〜０．１重量％に適時調整したのち、固形分に対して１０〜１００重量％のパパインを加え、６０℃で２０時間酵素分解した。酵素分解後、９５℃で３０分間撹拌することで酵素を失活させ、冷却したのち、上述の限外濾過装置に１０００ＮＭＷＣのカートリッジを取り付けたもので限外濾過し、濾過膜を通過した分子量１０００以下の画分を凍結乾燥した。

確認試験（カスパーゼ−１４遺伝子発現試験）
２継代目のヒト包皮由来表皮細胞（クラボウ）を５０−７０％コンフルエントとなるまでＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地を１日おきに交換しながら培養後、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地に検体を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ中で２日間培養した。

＜ＲＮＡの抽出＞
細胞からの Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、添付マニュアルに従い調製した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い算出した。

＜ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ＞
ＲＴ反応 ２μｇのＴｏｔａｌＲＮＡを使用し、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標）（ＴＯＹＯＢＯ）を用い、ＴＯＹＯＢＯ推奨プロトコールに従い、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にてＲＴ反応を行った。
リアルタイムＰＣＲ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｚ，ＴＯＹＯＢＯ）を７５００ ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて添付マニュアルを基に行い、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｃ_Ｔ（△ △ Ｃ_Ｔ）法（Ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用した。

確認試験は、実施例−１及び参考例−１（真珠層の不溶性タンパク質の加水分解物）について行った。
なお、参考例−１は以下のように作成した。
貝殻の付着物を水、ブラシで除去し、グラインダー等で表面の稜柱層を削り除去したのち、約１〜５ｍｍ程度に粉砕したアコヤガイ貝殻５０ｋｇに水４５０kgを加えて撹拌しつつ、塩酸１００kgを徐々に加えた。さらに水１００ｋｇを加え３日間撹拌した。塩酸１０kgを徐々に加えた。さらに水２００kgを加え２日間撹拌した。撹拌しつつ、水酸化ナトリウム３kgを徐々に加えた。
ｐＨ７になるように２５％水酸化ナトリウムで調整した後水２００kg加えた。これをシャープレス遠心機で沈殿を集めた。
沈殿を解砕し、０．１モル塩酸２０ｋｇを加えて２４日間ゆっくり撹拌した。これに水１０００kgを撹拌しつつ加えたのち、シャープレス遠心機で沈殿を集めた。
沈殿を解砕し、これに水１０００kgを撹拌しつつ加えたのち、シャープレス遠心機で沈殿を集めた。
この沈殿２００ｇに１０倍希釈した硫酸を３kg加え、１１０℃のオイルバスで２４時間加水分解した。
放冷後、水酸化バリウムを徐々に加えながらｐＨ３．０に調整した後、遠心分離（６０００rpm、１５分間）し、上澄みにアンバーライトＩＲＡ９１０をｐＨ７．０になるまで徐々に加えた。これを濾過して濾液に活性炭を１０ｇ加え３０分間撹拌した。
これを濾過し、凍結乾燥した。

結果を図１に示す。
実施例−１はカスパーゼ−１４の発現をコントロールに比較して約４０倍も高めることがわかった。また、参考例−１として同じ真珠層に含まれる不溶性タンパク質の加水分解物（加水分解コンキオリン）も試験したが、参考例−１にはカスパーゼ−１４の発現促進作用がないことがわかった。

実施例−１及びこれを配合した製剤は、皮膚の自然保湿因子の重要な構成物質であるアミノ酸を維持、増大させ、さらには、アトピー性皮膚炎、乾癬などの皮膚症状を予防又は改善し、さらには日焼け防止剤有効な製剤が得られた。

実施例−１と参考例−１の最終濃度０．０５％でおこなった確認試験（カスパーゼ−１４遺伝子発現試験）の結果を示す図である。 縦軸は実施例−１と参考例−１のいすれも添加していない場合（コントロール）の遺伝子発現量を１としてときの遺伝子発現量である。

Claims (2)

1. アコヤ貝真珠層又は真珠の可溶性タンパク質の加水分解物のうち分子量１０００以下のものを配合したカスパーゼ−１４発現促進剤。
2. ＥＤＴＡ又はその塩を用いてアコヤ貝真珠層又は真珠から可溶性タンパク質を得、これの加水分解物のうち分子量１０００以下のものを配合したカスパーゼ−１４発現促進剤。