JP6951908B2 - 皮膚外用剤 - Google Patents

Description

本発明は、植物素材又はその抽出物の加水分解物又は発酵物を有効成分とする皮膚外用剤に関するものである。

従来、皮膚の老化、乾燥、肌荒れの状態、シミ、ソバカスは、加齢に伴う細胞増殖・分化の不活化、ホルモン分泌の低下、細胞外マトリックス成分の量的低下などの内的要因と、太陽光（紫外線）に誘発される活性酸素による細胞・組織の損傷、又は炎症などの外的要因とが複雑に絡み合って生ずる現象であることが知られている。

ここで、皮膚老化の外的要因である活性酸素は皮膚細胞に直接傷害を及ぼすばかりでなく、細胞外マトリックス成分等を変性又は架橋させてシワの形成や皮膚の弾力性の低下をもたらし、さらにはメラニン色素の異常沈着を誘発してシミ、ソバカスを生じさせるなど、肌に様々なダメージを与えることも知られている。

従来、皮膚の老化を防ぎ、皮膚を健全、かつ、若々しい状態に保持するため、種々の活性成分の使用が提案され、それら抗老化成分、保湿成分やシミを改善する成分を配合した皮膚外用剤が上市されている。例えば、ビタミンＣ、ビタミンＥ、スーパーオキシドジスムターゼ（Superoxide dismutase）、カタラーゼなどの抗酸化剤；グリチルリチン酸などの抗炎症剤；各種紫外線吸収剤；α−ヒドロキシカルボン酸、胎盤抽出液、γ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸などの細胞賦活成分；コラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸などの細胞外マトリックス成分；尿素などの保湿剤がそれである。また、皮膚のシミ、ソバカス等の色素沈着の発生を抑制する物質としては、アルブチン、リノール酸又はコウジ酸などが知られており、美白剤の有効成分として広く使用されている。

しかし、それら従来の成分は、皮膚外用剤の配合原料として見た場合に、安定性、安全性、又は実際に皮膚に適用した際の有効性の観点で問題が存在する。また、安全性の観点から、植物等の天然物由来の成分も皮膚外用剤の配合原料として提案されているが、例えば、有効性及び安定性（着色、臭い等）の点で問題がある。従って、以上の点が改善された皮膚外用剤の新規有効成分が求められている。

以上の従来技術の課題を鋭意検討した結果、本発明者らは、キク科(Compositae)ウサギギク属(Arnica）の植物であるアルニカ(Arnica montana)又はその抽出物の加水分解物又は発酵物が、すぐれた美白効果、抗老化効果及び肌荒れ改善効果を有することを見出して、本発明を完成させるに至った。

従来、アルニカ抽出物を化粧料等の皮膚外用剤に配合することは特許文献１，２により公知化されているが、アルニカ又はその抽出物の酵素分解物又は発酵物を有効成分とする皮膚外用剤については知られていなかった。
特開昭60-104005号 特開昭60-258104号

本発明は、キク科(Compositae)ウサギギク属(Arnica）の植物であるアルニカ(Arnica montana)又はその抽出物の酵素分解物を含む組成物である。
また、本発明は、キク科(Compositae)ウサギギク属(Arnica）の植物であるアルニカ(Arnica montana)又はその抽出物の発酵物を含む組成物である。
本発明は、キク科(Compositae)ウサギギク属(Arnica）の植物であるアルニカ(Arnica montana)又はその抽出物の酵素分解物又は発酵物を有効成分とする皮膚外用剤である。

本発明によれば、天然物由来で生体安全性にすぐれ、かつ、美白効果、抗老化効果及び肌荒れ改善効果を有する新規有効成分を含む皮膚外用剤を提供することができる。また、本発明によれば、着色が抑えられた天然物由来の皮膚外用剤の有効成分を提供することができる。

以下、本発明の好ましい実施の形態について詳細に説明する。
本発明において、「アルニカ」とは、キク科(Compositae)ウサギギク属(Arnica）の植物であるアルニカ(Arnica montana)をいう。使用部位としては、全草、葉、花部、茎、根、子実等が挙げられる。なお、花部を使用する場合は、開花時期及び大きさ等は特に限定されるものではなく、又花弁、萼等のいずれか又はそれらの全部を含むものを使用してもよい。

以下に本発明に係る加水分解物、又は発酵物を得るための方法を示す。まず、本発明において、上記各植物の抽出を行う場合には、必要ならば使用部位を予め水洗して異物を除いた後、そのまま又は乾燥した上、必要に応じて細切又は粉砕し、抽出溶媒と接触させる処理を行う。抽出方法は、浸漬法等の常法に従って抽出溶媒と接触させることで行うことが可能であるが、超臨界抽出法や水蒸気蒸留法を用いることも可能である。

抽出溶媒としては、水；メタノール、エタノール、プロパノール等の低級アルコール類；エチレングリコール、１，３−プロパンジオール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等の多価アルコール類；酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル等のエステル類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；エチルエーテル、イソプロピルエーテル等のエーテル類；ｎ−ヘキサン、トルエン、クロロホルム等の炭化水素系溶媒等が挙げられ、それらは単独で又は二種以上混合して用いられる。

それら抽出溶媒のうちでも、得られる抽出物の有効性、さらには、皮膚刺激性の観点から、又皮膚外用組成物等への幅広い適用が可能であるという点からも、本発明においては、水、低級アルコール類又は多価アルコール類等の親水性溶媒が好適である。この親水性溶媒を用いる場合の好ましい例としては、例えば、水、低級アルコール類（特にエタノール）、又は多価アルコール（特に、１，３−プロパンジオール、１，３−ブチレングリコール）の単独使用、或いは、水と低級アルコール類（特にエタノール）との混合溶媒、又は水と多価アルコール類（特に１、３−ブチレングリコール、１，３−プロパンジオール、グリセリン）との混合溶媒の使用等が挙げられる。

混合溶媒を用いる場合の混合比は、例えば水と１、３−ブチレングリコール若しくは１，３−プロパンジオールとの混合溶媒であれば、容量比（以下同じ）で１：１〜２０：１、水とエタノールとの混合溶媒であれば、１：１〜２５：１、水とグリセリンとの混合溶媒であれば１：１〜２０：１の範囲とすることが好ましい。

また、乾燥部位と抽出溶媒との重量比は好ましくは１：１〜１：５０の範囲であり、より好ましくは、１：５〜１：２０の範囲である。

抽出物の調製に際して、そのｐＨに特に限定はないが、一般には３〜９の範囲とすることが好ましい。かかる意味で、必要であれば、前記抽出溶媒に、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ性調整剤、又はクエン酸、塩酸、リン酸、硫酸等の酸性調整剤を配合し、所望のｐＨとなるように調整してもよい。

抽出温度、抽出時間等の抽出条件は、用いる溶媒の種類やｐＨによっても異なるが、例えば、水、１，３−ブチレングリコール、若しくは１，３−プロパンジオールを単独で溶媒とする場合、又は水と１，３−プロパンジオール若しくは１，３−プロパンジオールとの混液を溶媒とする場合であれば、抽出温度は好ましくは０℃〜８５℃の範囲であり、又抽出時間は好ましくは１時間〜１週間である。

以上のようにして得られた抽出物に対して加水分解処理を行う。酵素による加水分解法、アルカリや酸による加水分解法等が挙げられるが、特に、酵素による加水分解法が好ましい。酵素としては、蛋白分解酵素、澱粉分解酵素、ペクチン質分解酵素、及びリパーゼ等の脂肪分解酵素のいずれかの酵素群から選ばれた１種又は２種以上を用いてもよいが、それらの酵素群からそれぞれ選ばれた１種又は２種以上の酵素を組み合わせて用いることがより好ましい。

蛋白分解酵素としては、例えば、アクチナーゼ等のアクチナーゼ類、ペプシン等のペプシン類、トリプシン、キモトリプシン等のトリプシン類、パパイン、キモパパイン等のパパイン類、グリシルグリシンペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ等のペプチダーゼ類、ブロメライン等を用いることができる。

また。糖質分解酵素としては、例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ等を用いることができる。

また、ペクチン質分解酵素としては、例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンデメトキシラーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンエステラーゼ、ポリガラクチュロナーゼ等を用いることができる。

酵素の使用量は、懸濁液中の各植物の固形分に対して、合計で０．０００１〜１０重量％が好ましく、より好ましくは０．００１〜２．０重量％である。

また、本発明においては、アルニカ又はその抽出物を発酵しても良い。アルニカの発酵に用いる微生物としては、乳酸菌、ビフィズス菌、麹菌、納豆菌、テンペ菌、酵母等が挙げられ、一般にはそれら各菌種のいずれかから選ばれた１種又は２種以上を用いるが、場合によっては、又相互に発酵の妨げとならない限り、別の菌種に属するもの同士を組み合せて用いるようにしてもよい。

例えば、乳酸菌としては、例えばラクトバシルス プランタラム（Lactobacillus plantarum)、ラクトバシルス ブレビス（L. brevis)、ラクトバシルス カゼイ（L. casei)、ラクトバシルス デルブルッキー（L. delbrueckii）等のラクトバシルス（Lactobacillus）属の乳酸菌；カルノバクテリウム ディバージェンス（Carnobacterium divergens)、カルノバクテリウム ピシコーラ(Carnobacterium piscicola)等のカルノバクテリウム（Carnobacterium）属の乳酸菌；ロイコノストック メセンテロイズ（Leuconostoc mesenteroides)、ロイコノストック シトレウム（Leuconostoc citreum)等のロイコノストック（Leuconostoc）属の乳酸菌； ストレプトコッカス フェーカリス（Streptococcus faecalis)、ストレプトコッカス ピオジェネス（Streptococcus pyogenes)等のストレプトコッカス属の乳酸菌；エンテロコッカス カゼリフラバス（Enterococcus caseliflavus)、エンテロコッカス サルフレウス（Enterococcus sulfreus)等のエンテロコッカス（Enterococcus）属の乳酸菌；ラクトコッカス プランタラム（Lactococcus plantarum)、ラクトコッカス ラフィノラクティス（Lactococcus rafinolactis)等のラクトコッカス属の乳酸菌；ヴェイセラ コンフューザ（Weissella confusa)、ヴェイセラ カンドウレリ（Weissella kandleri)等のヴェイセラ属の乳酸菌；アトポビウム ミニュタム（Atopobium minutum)、アトポビウム パービュラス（Atopobiumparvulus)等のアトポビウム（Atopobium）属の乳酸菌；バゴコッカス フルビアリス（Vagococcus fluvialis）、バゴコッカス サーモニナラム（Vagococcus salmoninarum)等のバゴコッカス（Vagococcus）属の乳酸菌；ペディオコッカス ダムノサス（Pediococcus damnosus)、ペディオコッカス ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus)等のペディオコッカス（Pediococcus）属の乳酸菌、マリニラクトバシルス・フィコロトレランス（Marinilactobacillus phychrotolerans）のような海洋起原の乳酸菌等が挙げられる。

例えば、ビフィズス菌としては、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）等が挙げられるが、ビフィズス菌に分類されるものであれば、いずれも使用可能である。

麹菌としては、例えばアスペルギルス オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス フラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス ポリオキソジェネス（Aspergillus polyoxogenes）、アスペルギルス ソーヤ（Aspergillus sojae）等の黄麹菌、アスペルギルス アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス カワウチ（Aspergillus kawauchii）、アスペルギルス ウサミ（Aspergillus usami）、アスペルギルス ニガー（Aspergillus niger）等の黒麹菌、モナスカス アンカ（Monascus anka）、モナスカス ピロサス（Monascus pilosus）等の紅麹菌等が挙げられる。

納豆菌としては、例えばバシルス ナットー(Bacillus natto)、バシルス サブチルス(Bacillus subtilis)、バシルス サーキュランス(Bacillus circulans)等のバシルス属の細菌等が挙げられる。なかでも、食品に広く使用されており、安全性が高い点でバシルス ナットー(Bacillus natto)が最も好ましい。

テンペ菌としては、リゾプス アジゴスポラス(Rhizopus azygosporus)、リゾプス ミクロスポラス チネンシス(Rhizopus microsporus chinensis)、リゾプス ミクロスポラス オリゴスポラス(Rhizopus microsporus oligosporus)、リゾプス ニベウス(Rhizopus niveus)、リゾプス オリゼー(Rhizopus oryzae)等のリゾプス属の真菌（カビ）が挙げられる。

酵母としては、例えばサッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス アワモリ(Saccharomyces awamori)、サッカロミセス チェバリエリ(Saccharomyces chevalieri)、サッカロミセス カールスバージェンシス(Saccharomyces carlsbergensis)、サッカロミセス バヨナス（Saccharomyces bayon us)等のサッカロミセス属の酵母、トルラスポラ デルブルエキ(Torulaspora delbruekii)、トルラスポラ ファーメンタチ(Torulaspora fermentati)、トルラスポラ ロゼイ(Torulaspora rosei)等のトルラスポラ属の酵母、ジゴサッカロミセス ローキシ(Zygosaccharomyces rouxii)、ジゴサッカロミセス ソーヤ(Zygosaccharomyces soya)、ジゴサッカロミセス サケ(Zygosaccharomyces sake)、ジゴサッカロミセス ミソ(Zygosaccharomyces miso)、ジゴサッカロミセス ラクティス(Zygosaccharomyces lactis)等のジゴサッカロミセス属の酵母、カンディダ ベルサチリス(Candida versatilis)、カンディダ エチェリシイ(Candida etchellsii)、カンディダ ケフィール（Candida kefyr）、カンディダ サケ（Candida sake）、カンディダ スコッティ（Candida scottii）等のカンディダ属の酵母、オーレオバシディウム プルランス（Aureobasidium Pullulans）、オーレオバシディウム マンソニー（Aureobasidium mansonii）、オーレオバシディウム マイクロスティクタム（Aureobasideium microstictum）等のオーレオバシディウム属の酵母等が挙げられる。上述の酵母のうち、安全性及び有効性の観点から、サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)が好ましいが、サッカロミセス セレビシエとしては、清酒、ユリ、サクラの花等の植物由来のものや、海洋起源のもの等、いずれの由来のものでも使用することができる。

上記の微生物を用いて、上記植物を発酵させる方法の好ましい具体例を挙げれば以下の通りである。まず、それら植物の発酵素材を発酵媒体中に浸漬又は懸濁させて、発酵のための懸濁液を調製する。この場合、植物は生のまま用いても、又予め乾燥若しくは半乾燥した上用いてもよい。又、形状としては、採取したものをそのまま用いることもできるが、細断或いは粉砕して微細化すれば発酵効率を上げることができる。

発酵素材を懸濁させるための発酵媒体としては、水或いは水と低級アルコール類（メタノール、エタノール、プロパノール等）若しくはグリコール類（エチレングリコール、プロピレングリコール（プロパンジオール）、１、３−ブチレングリコール、グリセリン等）との混液等が用いられ、又それら媒体中にはグルコース、フルクトース、シュークロース等の糖類を添加してもよいが、微生物が最もその作用を発揮しやすいことと、発酵素材である植物以外の資化成分が存在することによる発酵副産物の生成を避けるという意味から、水の単独使用が最も好ましい。

この発酵素材の懸濁液は、これを発酵工程に供する前に、殺菌を行って発酵の障害となる雑菌を除去する。この場合殺菌除去方法としては、発酵素材を予め殺菌用エタノール等で洗浄殺菌した上無菌水等の無菌媒体に懸濁する方法を用いてもよく、又発酵素材を媒体に懸濁した後、懸濁液を加熱殺菌する方法を用いるようにしてもよい。加熱殺菌法としては、懸濁液を１２０〜１３０℃で１０〜２０分間加熱するオートクレーブ殺菌法や、懸濁液を８０〜９０℃に６０〜１２０分間保持することを１日１回２〜３日間繰り返す間断殺菌法が一般に用いられる。

次に、この無菌化した懸濁液を発酵タンクに入れ、これに微生物を植菌して発酵処理を行う。 微生物の接種量は１０^７〜１０^８個／ｍＬが適量である。接種量が上記の範囲より多くなっても発酵の進行時間は殆ど変わらず、一方上記の範囲より少なくなると発酵完了までに長時間を要することとなって好ましくない。

発酵温度は一般に５〜５０℃の範囲、好ましくは各微生物の生育至適温度である３０〜４０℃（例えば、乳酸菌であれば３５℃〜４０℃）の範囲である。発酵日数は、至適温度に於いて一般に１〜１０日、好ましくは２〜５日の範囲である。発酵日数が上記の一般的範囲より短くなると発酵が十分に行われず発酵物の有効性が低下する傾向にあり、一方１０日を越えて長くしても有効性のそれ以上の上昇は認められないだけでなく、着色や発酵臭の増加が生ずることとなっていずれも好ましくない。

以上の発酵処理を行うに当たって、植物の成分が微生物によってより有効に利用されるようにするため、微生物の植菌前若しくは植菌時、或いは場合によっては植菌後発酵継続中に、前記の懸濁液に酵素を添加して、発酵素材である植物に酵素による加水分解処理を施すことが好ましい。この場合、酵素としては、上述したように、蛋白分解酵素、糖質分解酵素、ペクチン質分解酵素及び脂質分解酵素から選ばれた少なくとも１種の酵素を用いることができる。

ｐＨ、温度、時間等の処理条件としては、酵素処理を発酵の前に行うのであれば、使用する酵素の至適ｐＨ及び至適温度付近で１〜２４時間の処理を行うのがよく、一方発酵と並行して行うのであれば、当該発酵と同条件であって差し支えない。

以上の発酵処理が終ったならば、微生物の殺菌のため、又酵素処理を併用した場合であれば酵素の失活も兼ねて、発酵液に８０〜１００℃で１０〜１２０分程度の加熱殺菌処理を施す。殺菌処理を終わった発酵液は、これをそのまま、或いは一般かつ好適には濾過或いは遠心分離等の固液分離手段によって液相を分取し、必要ならばｐＨを通常の化粧料のｐＨ領域であるｐＨ４〜９に調整し、さらに必要ならば希釈若しくは濃縮によって適宜の濃度とした上、化粧料の配合原料として供する。又、場合によっては、固液分離後の液相を、スプレードライ法、凍結乾燥法等常法に従って固体化し、さらに必要に応じて粉砕して粉末状にしてもよい。

本発明に係る抽出物、加水分解物又は発酵物を配合してなる皮膚外用剤（化粧料、医薬部外品も含む）としては、例えば、乳液、クリーム、ローション、エッセンス、パック、口紅、ファンデーション、リクイドファンデーション、メイクアッププレスパウダー、ほほ紅、白粉、洗顔料、ボディシャンプー、スリミング剤、毛髪用シャンプー、石けん等が挙げられ、また、育毛剤、さらには浴剤等も挙げられるが、勿論これらに限定されるものではない。

皮膚外用剤（化粧料や医薬部外品）における本発明に係る加水分解物又は発酵物の配合量は、その固形分として、基礎化粧料の場合は、一般に０．００２〜１．０重量％（固形分重量％、以下同じ）、好ましくは０．０２〜０．２重量％の範囲、メイクアップ化粧料の場合は、一般に０．００２〜１．０重量％、好ましくは０．０２〜０．２重量％の範囲、又清浄用化粧料の場合は、一般に０．００２〜１０．０重量％、好ましくは０．０２〜７．０重量％の範囲である。また、毛髪用化粧料の場合は、抽出物の固形分として、一般的には０．００００１〜５．０重量％であり、好ましくは、０．０００１〜３．０重量％である。また、経口組成物における本発明の抽出物の配合量は、抽出物の固形分として、０．１〜１５重量％の範囲が好ましい。

皮膚外用剤（化粧料や医薬部外品）には、本発明に係る抽出物、加水分解物又は発酵物のほかに、通常、皮膚外用組成物に用いられる成分、例えば油性成分、界面活性剤（合成系、天然物系）、保湿剤、増粘剤、防腐・殺菌剤、粉体成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、色素、香料等を必要に応じて適宜配合することができる。また、本発明に係る抽出物、加水分解物又は発酵物の有効性、特長を損なわない限り、他の生理活性成分を組み合わせて配合することも何ら差し支えない。

ここで、油性成分としては、例えば、オリーブ油、ホホバ油、ヒマシ油、大豆油、米油、米胚芽油、ヤシ油、パーム油、カカオ油、メドウフォーム油、シアーバター、ティーツリー油、アボガド油、マカデミアナッツ油、ベルガモット油、ラベンダー油、バラ油、ベルガモット油、カミツレ油等の植物由来スクワラン等の植物由来の油脂類；ミンク油、タートル油等の動物由来の油脂類；ミツロウ、カルナウバロウ、ライスワックス、ラノリン等のロウ類；流動パラフィン、ワセリン、パラフィンワックス、スクワラン等の炭化水素類；ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸、ｃｉｓ−１１−エイコセン酸等の脂肪酸類；ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール等の高級アルコール類；ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オレイン酸ブチル、２−エチルヘキシルグリセライド、高級脂肪酸オクチルドデシル（ステアリン酸オクチルドデシル等）等の合成エステル類及び合成トリグリセライド類等が挙げられる。

界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル等の非イオン界面活性剤；脂肪酸塩、アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレン脂肪アミン硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル燐酸塩、α−スルホン化脂肪酸アルキルエステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル燐酸塩等のアニオン界面活性剤；第四級アンモニウム塩、第一級〜第三級脂肪アミン塩、トリアルキルベンジルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩、２−アルキル−１−アルキル−１−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム塩、Ｎ、Ｎ−ジアルキルモルフォルニウム塩、ポリエチレンポリアミン脂肪酸アミド塩等のカチオン界面活性剤；Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−アルキル−Ｎ−カルボキシメチルアンモニオベタイン、Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリアルキル−Ｎ−アルキレンアンモニオカルボキシベタイン、Ｎ−アシルアミドプロピル−Ｎ′、Ｎ′−ジメチル−Ｎ′−β−ヒドロキシプロピルアンモニオスルホベタイン等の両性界面活性剤等を使用することができる。

乳化剤及び／又は乳化助剤としては、酵素処理ステビア等のステビア誘導体、サポニン又はその誘導体、カゼイン又はその塩（ナトリウム等）、糖と蛋白質の複合体、ショ糖又はそのエステル、ラクトース、大豆由来の水溶性多糖、大豆由来蛋白質と多糖の複合体、ラノリン又はその誘導体、コレステロール、ステビア誘導体（ステビア酵素処理物等）、ケイ酸塩（アルミニウム、マグネシウム等）、炭酸塩（カルシウム、ナトリウム等）サポニン及びその誘導体、レシチン及びその誘導体（水素添加レシチン等）、乳酸菌醗酵米、乳酸菌醗酵発芽米、乳酸菌醗酵穀類（麦類、豆類、雑穀等）等を配合することもできる。

保湿剤としては、保湿剤としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１、３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、キシリトール、ピロリドンカルボン酸ナトリウム等があり、さらにトレハロース、ラフィノース等の糖類、ムコ多糖類（例えば、ヒアルロン酸及びその誘導体、ヒアルロン酸発酵液、コンドロイチン及びその誘導体、ヘパリン及びその誘導体等）、エラスチン及びその誘導体、コラーゲン及びその誘導体、コラーゲンペプチド、ＮＭＦ関連物質、乳酸、尿素、高級脂肪酸オクチルドデシル、海藻抽出物、シラン根（白及）抽出物、各種アミノ酸及びそれらの誘導体が挙げられる。

増粘剤としては、例えばアルギン酸、寒天、カラギーナン、フコイダン等の褐藻、緑藻又は紅藻由来成分；シラン根（白及）抽出物；ペクチン、アロエ多糖体等の多糖類；トラガントガム、ローカストビーンガム、キサンタンガム、グアーガム等のガム類；カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のセルロース誘導体；カルボシキビニルポリマー、アルキル変性カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、アクリル酸・メタクリル酸共重合体等の合成高分子類；ヒアルロン酸及びその誘導体；ポリグルタミン酸及びその誘導体等が挙げられる。

防腐・殺菌剤としては、例えば尿素；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル等のパラオキシ安息香酸エステル類；フェノキシエタノール、ジクロロフェン、ヘキサクロロフェン、塩酸クロルヘキシジン、塩化ベンザルコニウム、サリチル酸、エタノール、ウンデシレン酸、フェノール類、ジャマール（イミダゾデイニールウレア）、１、２−ペンタンジオール、プロパンジオール、各種精油類、樹皮乾留物、大根発酵液、サトウキビ、トウモロコシ等の植物由来のエタノール又は１、３−ブチレングリコール等がある。

粉体成分しては、例えばセリサイト、酸化チタン、タルク、カオリン、ベントナイト、酸化亜鉛、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム、硫酸バリウム、無水ケイ酸、雲母、ナイロンパウダー、ポリエチレンパウダー、シルクパウダー、セルロース系パウダー、穀類（米、麦、トウモロコシ、キビ等）のパウダー、豆類（大豆、アズキ等）のパウダー等がある。

紫外線吸収剤としては、例えばパラアミノ安息香酸エチル、パラジメチルアミノ安息香酸エチルヘキシル、サリチル酸アミル及びその誘導体、パラメトキシ桂皮酸２−エチルヘキシル、桂皮酸オクチル、オキシベンゾン、２、４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホン酸塩、４−ターシャリーブチル−４−メトキシベンゾイルメタン、２−（２−ヒドロキシ−５−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、ウロカニン酸、ウロカニン酸エチル、アロエ抽出物等がある。

抗酸化剤としては、例えばブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピル、ビタミンＥ及びその誘導体（例えば、ビタミンＥニコチネート、ビタミンＥリノレート等）等がある。

美白剤としては、ｔ−シクロアミノ酸誘導体、コウジ酸及びその誘導体、アスコルビン酸及びその誘導体、ハイドロキノン又はその誘導体、エラグ酸及びその誘導体、ニコチン酸及びその誘導体、レゾルシノール誘導体、トラネキサム酸及びその誘導体、４−メトキシサリチル酸カリウム塩、マグノリグナン（5、5'−ジプロピル−ビフェニル−2、2’−ジオール）、ヒドロキシ安息香酸及びその誘導体、ビタミンＥ及びその誘導体、α−ヒドロキシ酸、ＡＭＰ（アデノシンモノホスフェイト、アデノシン１リン酸）等が挙げられ、これらを単独で配合しても、複数を組み合わせて配合しても良い。

上記のコウジ酸誘導体としては、例えばコウジ酸モノブチレート、コウジ酸モノカプレート、コウジ酸モノパルミテート、コウジ酸ジブチレート等のコウジ酸エステル類、コウジ酸エーテル類、コウジ酸グルコシド等のコウジ酸糖誘導体等が、アスコルビン酸誘導体としては、例えばＬ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸エステルマグネシウム、Ｌ−アスコルビン酸−２−硫酸エステルナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸−２−硫酸エステルマグネシウム等のアスコルビン酸エステル塩類、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド、Ｌ−アスコルビン酸−５−グルコシド、アスコルビルトコフェリルマレイン酸、アスコルビルトコフェリルリン酸Ｋ、ミリスチル３−グリセリルアスコルビン酸、カプリリル２−グリセリルアスコルビン酸等のアスコルビン酸糖誘導体、それらアスコルビン酸糖誘導体の６位アシル化物（アシル基は、ヘキサノイル基、オクタノイル基、デカノイル基等）、Ｌ−アスコルビン酸テトライソパルミチン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸テトララウリン酸エステル等のＬ−アスコルビン酸テトラ脂肪酸エステル類、３−Ｏ−エチルアスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸−６−Ｏ−パルミテートナトリウム、グリセリルアスコルビン酸又はそのアシル化誘導体、ビスグリセリルアスコルビン酸等のアスコルビン酸グルセリン誘導体、Ｌ−アスコルビン酸リン酸アミノプロピル、Ｌ−アスコルビン酸のヒアルロン酸誘導体、３−Ｏ−Ｄラクトース−Ｌ−アスコルビン酸、イソステアリルアスコルビルリン酸塩等が、ハイドロキノン誘導体としては、アルブチン（ハイドロキノン−β−Ｄ−グルコピラノシド）、α−アルブチン（ハイドロキノン−α−Ｄ−グルコピラノシド）等が、トラネキサム酸誘導体としては、トラネキサム酸エステル（例えば、トラネキサム酸ラウリルエステル、トラネキサム酸ヘキサデシルエステル、トラネキサム酸セチルエステル又はその塩）、トラネキサム酸のアミド体（例えば、トラネキサム酸メチルアミド）等が挙げられ、レゾルシノール誘導体としては、例えば、４−ｎ−ブチルレゾルシノール、４−イソアミルレゾルシノール等が、２、５−ジヒドロキシ安息香酸誘導体としては、例えば２、５−ジアセトキシ安息香酸、２−アセトキシ−５−ヒドロキシ安息香酸、２−ヒドロキシ−５−プロピオニルオキシ安息香酸等が、ニコチン酸誘導体としては、例えばニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル等が、α−ヒドロキシ酸としては、例えば乳酸、リンゴ酸、コハク酸、クエン酸、α−ヒドロキシオクタン酸等がある。

生理活性成分としては、例えば、胎盤抽出液、ソウハクヒ抽出物、ユキノシタ抽出物、シソ抽出物、米糠抽出物又はその加水分解物、白芥子抽出物又はその加水分解物、白芥子の発酵物、シャクヤク抽出物又はその加水分解物、乳酸菌醗酵米、ムラサキシキブ抽出物、ハス種子抽出物又はその加水分解物、ハス種子発酵物、党参抽出物又はその加水分解物、ハトムギ加水分解物、ハトムギ種子発酵物、ハイビスカスの発酵物、ローヤルゼリー発酵物、酒粕抽出物又はそれに含まれるセラミド、酒粕発酵物、パンダヌス・アマリリフォリウス抽出物、アルカンジェリシア・フラバ抽出物、カミツレ抽出物等が挙げられる。また、サンゴ草抽出物、イネの葉の抽出物又はその加水分解物、ナス（ハス、長ナス、賀茂ナス、米ナス等）抽出物又はその加水分解物、アンズ果実の抽出物、カタメンキリンサイ等の海藻の抽出物、アマモ等の海産顕花植物の抽出物、豆乳発酵物、クラゲ水、米抽出物又はその加水分解物、米醗酵エキス、発芽米抽出物又はその加水分解物、発芽米発酵物、黒豆抽出物又はその加水分解物、ダマスクバラの花の抽出物、タケノコの皮の抽出物、リノール酸及びその誘導体もしくは加工物（例えばリポソーム化リノール酸等）、動物又は魚由来のコラーゲン及びその誘導体、エラスチン及びその誘導体、グリチルリチン酸及びその誘導体（ジカリウム塩等）、ｔ−シクロアミノ酸誘導体、ビタミンＡ及びその誘導体、アラントイン、ジイソプロピルアミンジクロロアセテート、γ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸、ゲンチアナ抽出物、甘草抽出物、ニンジン抽出物、オタネニンジン抽出物又はその発酵物、紅参抽出物、ミツイシコンブ抽出物、ヘチマ抽出物、アナアオサ抽出物、モモ抽出物、桃仁抽出物、キウイ抽出物、ジュアゼイロ抽出物、パウダルコ樹皮抽出物、萱草（デイリリー）抽出物又は発酵物、ハゴロモグサ抽出物、チェリモヤ抽出物、マンゴー抽出物、マンゴスチン抽出物、フノリ抽出物、烏龍茶抽出物、紅富貴抽出物、シラン抽出物、山椒果皮又は種皮の抽出物又は加水分解物、ベニバナ花抽出物、カサブランカ抽出物、甘藷抽出物又はその発酵物、ヒマワリ抽出物、グアバ葉抽出物、ドクダミ抽出物、晩白柚抽出物、アロエ抽出物、イチジク花抽出物、リンゴ抽出物、ホワイトアスパラガス抽出物等がある。

次に、製造例、処方例及び試験例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。なお、以下において、部はすべて重量部を、また％はすべて重量％を意味する。

製造例１．アルニカ加水分解物の調製（１）
アルニカの花部10ｇに精製水300gを加えて抽出懸濁液を調製した。この抽出懸濁液にパパイン0.1gを加えた後40℃で3時間、加水分解抽出処理を行った。その後、１時間加温して酵素を加熱失活させ、濾過を行って酵素加水分解物溶液202ｇ（固形分濃度0.88％）を得た。

製造例２．アルニカ加水分解物の調製（２）
アルニカの花部10ｇに精製水300gを加えて抽出懸濁液を調製した。この抽出懸濁液にグルコアミラーゼ0.1g及びパパイン0.1gを加えた後40℃で3時間、加水分解抽出処理を行った。その後、1時間加温して酵素を加熱失活させ、濾過を行って酵素加水分解物溶液201ｇ（固形分濃度0.85％）を得た。

製造例３．アルニカ加水分解物の調製（３）
アルニカの花部10ｇに精製水300gを加えて抽出懸濁液を調製した。この抽出懸濁液にペクチンナーゼ1.0g及びパパイン0.1gを加えた後40℃で3時間、加水分解抽出処理を行った。その後、1時間加温して酵素を加熱失活させ、濾過を行って酵素加水分解物溶液205ｇ（固形分濃度0.89％）を得た。

製造例４．アルニカ加水分解物の調製（４）
アルニカの花部10ｇに精製水300gを加えて抽出懸濁液を調製した。この抽出懸濁液にリパーゼ0.3g及びパパイン0.3gを加えた後40℃で3時間、加水分解抽出処理を行った。その後、1時間加温して酵素を加熱失活させ、濾過を行って酵素加水分解物溶液203ｇ（固形分濃度0.86％）を得た。

製造例５．アルニカ発酵物の調製（１）
アルニカの花部の乾燥物10gに精製水300gとグルコース1gを加えて抽出懸濁液を作り、80〜90℃で１時間加温して殺菌を行った。殺菌した抽出懸濁液に乳酸菌（ラクトバシルス プランタラム）を10⁸個/mL接種し、窒素気流下、37℃で3日間静置培養した。培養終了後、培養液を加熱殺菌し、濾過して乳酸菌発酵物溶液210g（固形分濃度0.77％）を得た。

製造例６．アルニカ発酵物の調製（２）
乳酸菌としてラクトバチルス プランタラムに代えてラクトバシルス ブレビス（L. brevis)を用いる他は製造例５と同様にして、アルニカの乳酸菌発酵物溶液205g（固形分濃度0.71％）を得た。

製造例７．アルニカ発酵物の調製（３）
微生物として、乳酸菌（ラクトバチルス プランタラム）に代えて酵母であるサッカロミセス セレビシエを用いる他は製造例５と同様にしてアルニカの酵母発酵物溶液198ｇ（固形分濃度0.68％）を得た。

製造例８．アルニカ発酵物の調製（４）
微生物として、乳酸菌（ラクトバチルス プランタラム）に代えて麹菌であるアスペルギルス オリゼーを用いる他は製造例５と同様にして、アルニカの麹菌発酵物溶液201ｇ（固形分濃度0.64％）を得た。

比較例１．アルニカ抽出物の調製（１）
アルニカの花部10ｇに精製水300gを添加して混合し、加熱殺菌した。この抽出懸濁液を窒素気流下、37℃で3日間静置した。この抽出液を加熱殺菌して濾過し、アルニカ抽出物溶液200g（固形分濃度0.99％）を得た。

処方例１．化粧水
［成分］ 部
オリーブ油 １．０
ポリオキシエチレン（５．５）セチルアルコール ５．０
ブチルパラベン ０．１
製造例１の加水分解物 ５．０
エタノール ５．０
グリセリン ５．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
水酸化カリウム 適量
精製水 全量が１００部となる量
香料 適量

処方例２．化粧水
処方例１に含まれる製造例１の加水分解物に代えて、製造例２の加水分解物５．０部を用いるほかは、処方例１と同様にして化粧水を得た。

処方例３．化粧水
処方例１に含まれる製造例１の加水分解物に代えて、製造例３の加水分解物５．０部を用いるほかは、処方例１と同様にして化粧水を得た。

処方例４．化粧水
処方例１に含まれる製造例１の加水分解物に代えて、製造例４の加水分解物５．０部を用いるほかは、処方例１と同様にして化粧水を得た。

処方例５．化粧水
処方例１に含まれる製造例１の加水分解物に代えて、製造例５の発酵物５．０部を用いるほかは、処方例１と同様にして化粧水を得た。

処方例６．化粧水
処方例１に含まれる製造例１の加水分解物に代えて、製造例６の発酵物５．０部を用いるほかは、処方例１と同様にして化粧水を得た。

処方例７．化粧水
処方例１に含まれる製造例１の加水分解物に代えて、製造例７の発酵物５．０部を用いるほかは、処方例１と同様にして化粧水を得た。

処方例８．化粧水
処方例１に含まれる製造例１の加水分解物に代えて、製造例８の発酵物５．０部を用いるほかは、処方例１と同様にして化粧水を得た。

処方例９．乳液
［成分］ 部
流動パラフィン ６．０
ヘキサラン ４．０
ホホバ油 １．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート １．０
親油型ステアリン酸グリセリル １．０
大豆レシチン １．５
製造例５の発酵物 ３．０
Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド ２．０
水酸化カリウム ０．５
グリセリン ３．０
１、３−ブチレングリコール ２．０
カルボキシメチルセルロース ０．３
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０１
精製水 全量が１００部となる量
香料 適量

処方例１０．乳液
処方例９の成分中、製造例５の発酵物３．０に代えて、製造例７の発酵物３．０部を用いるほかは処方例９と同様にして乳液を得た。

処方例１１．乳液
処方例９の成分中、製造例５の発酵物３．０に代えて、製造例１の加水分解物３．０部を用いるほかは処方例９と同様にして乳液を得た。

処方例１２．乳液
処方例９の成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてアルブチン３．０部を用いるほかは処方例９と同様にして乳液を得た。

処方例１３．乳液
処方例９の成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてトラネキサム酸２．０部を用いるほかは処方例９と同様にして乳液を得た。

処方例１４．乳液
処方例９の成分中、Ｌ−アスコルビン酸−２−グルコシド２．０部及び水酸化カリウム０．５部に代えてニコチン酸アミド３．０部を用いるほかは処方例９と同様にして乳液を得た。

処方例１５．ローション
［成分］ 部
製造例５の発酵物 １０．０
エタノール １０．０
グリセリン ３．０
１、３−ブチレングリコール ２．０
メチルパラベン ０．２
クエン酸 ０．１
クエン酸ナトリウム ０．３
カルボキシビニルポリマー ０．１
キサンタンガム ０．１
香料 適量
水酸化カリウム 適量
精製水 全量が１００部となる量

処方例１６．エッセンス
［成分］ 部
エタノール ２．０
グリセリン ５．０
１、３−ブチレングリコール ５．０
メチルパラベン ０．１
ヒアルロン酸 ０．１
製造例６の発酵物 ５．０
クエン酸 ０．３
クエン酸ナトリウム ０．６
精製水 全量が１００部となる量

実施例１７．リキッドファンデーション
［成分］ 部
ステアリン酸 ２．４
モノステアリン酸プロピレングリコール ２．０
セトステアリルアルコール ０．２
液状ラノリン ２．０
流動パラフィン ３．０
ミリスチン酸イソプロピル ８．５
プロピルパラベン ０．０５
製造例８の発酵物 ５．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．２
ベントナイト ０．５
プロピレングリコール ４．０
トリエタノールアミン １．１
メチルパラベン ０．１
精製水 全量が１００部となる量
酸化チタン ８．０
タルク ４．０
着色顔料 適量

処方例１８．ボディシャンプー
［成分］ 部
Ｎ−ラウロイルメチルアラニンナトリウム ２５．０
ヤシ油脂肪酸カリウム液（４０％） ２６．０
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド ３．０
メチルパラベン ０．１
製造例５の発酵物 ５．０
１，３−ブチレングリコール ２．０
精製水 全量が１００部となる量

処方例１９．育毛料
［成分］ 部
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１
モノニトログアヤコールナトリウム ０．０２
塩酸ピリドキシン ０．０３
ｌ−メントール ０．８
タマサキツヅラフジ根エキス ０．３
褐藻エキス ０．３
オタネニンジンエキス ０．３
ゲンチアナエキス ２．０
製造例５の発酵物 ３．５
トリメチルグリシン ０．５
乳酸 ０．２
１、３−ブチレングリコール １０．０
フェノキシエタノール ０．２
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ０．４
Ｌ−アルギニン 適量
エタノール ２０．０
精製水 全量が１００部となる量

処方例２０．ヘアシャンプー
［成分］ 部
Ｎ−ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム １０．０
ポリオキシエチレン（３）アルキルエーテル硫酸ナトリウム ２０．０
ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン １０．０
ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド ４．０
メチルパラベン ０．１
クエン酸 ０．１
製造例６の発酵物 ２．０
１、３−ブチレングリコール ２．０
精製水 全量が１００部となる量

実施例２１．ヘアコンディショナー
［成分］ 部
ポリオキシエチレン（１０）硬化ヒマシ油 １．０
塩化ジステアリルジメチルアンモニウム １．５
塩化ステアリルトリメチルアンモニウム ２．０
２−エチルヘキサン酸グリセリル １．０
セタノール ３．２
ステアリルアルコール １．０
メチルパラベン ０．１
製造例７の加水分解物 ２．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
精製水 全量が１００部となる量

試験例１．DPPH(1,1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル）ラジカル消去作用評価試験
まず、DPPH2.4部をエタノール20部に溶解し、これに精製水20部を加えてDPPH溶液を調製した。このDPPH溶液24部に対して、18v/v％エタノール溶液を19.2部、2M酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)を4.8部加えて、DPPH添加溶液として調製した。また、抽出液そのものの色調が試験に及ぼす影響を差し引くため、DPPH溶液の代わりに50v/v％エタノール溶液を用いて、18v/v％エタノール溶液と2M酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を混合した液を対照液とした。次に、製造例1〜4の加水分解物、製造例5〜8の発酵物、及び比較例１の抽出物を精製水で希釈して試料溶液を調製した。ここで、試料溶液としては、その全量に対する各抽出物溶液の終濃度（溶液としての濃度）がそれぞれ2.0％となるように調製したものを使用した。この試料溶液とDPPH添加溶液又は対照液とを1：3の割合で混合し、37℃で20分間静置後、各試験溶液をDPPH添加溶液と混合した場合の550nmにおける吸光度と、同じく各試験溶液を対照液と混合した場合の550nmにおける吸光度との差を測定し、DPPHラジカルの残存量を確認した。また、同時にコントロールとして試料溶液の代わりに、精製水を用いて上記と同様の操作を行い、ここに得られるDPPHラジカル残存率に対する各試料添加時のDPPHラジカル残存率の相対値を求めた。また、試験系が正常に機能しているかを確認するために、試料溶液の代わりに陽性対照として水溶性ビタミンＥ誘導体［Trolox］(終濃度25μM)を添加した場合についても、同様の試験を行った。

試験例１の結果を表１に示す。
［表１］

表１に示すように、本発明に係る製造例1〜4の加水分解物及び製造例5〜8の発酵物は、比較例1と比較して、格段にすぐれたDPPHラジカル消去作用を有することが認められた。また、陽性対照のTroloxも同様の作用が認められたことから、本試験系が正常に行われたことも確認された。

試験例２．SOD様活性評価試験
0.2Mトリス−塩酸緩衝液50μL、1mMエチレンジアミン四酢酸・二ナトリウム塩溶液20μL、1mMキサンチン溶液20μL、0.75mMニトロブル-テトラゾリウム溶液0.20mL、試料溶液（製造例1〜4の加水分解物、及び製造例5〜8の発酵物）10μL、0.06U/mLキサンチンオキシダーゼ溶液50μL、製造例1〜4の加水分解物及び製造例5〜8の発酵物50μL（その濃度が0.5%になるように調整した）を混合して試料溶液を調製した。また、上記試料溶液に代えて精製水50μLを含むこと以外は上記試験溶液と同様の組成からなる混合液（コントロール）を調製した。さらに、上記試験溶液において試料溶液に代えて、0.875Unit/mLのスーパーオキシドジスムターゼ溶液50μLを用いる他は上記試験溶液と同様の組成からなる混合液（陽性対照）を調製した。上記試験溶液、又は試料無添加の混合液をそれぞれ37℃で5分間インキュベートし、各被験液の570nmにおける吸光度（被験液中のスーパーオキシドアニオン量の指標）を測定した。結果は、コントロールの混合液の吸光度を100％とした時の各試験溶液、又は陽性対照（スーパーオキシドジスムターゼ［SOD］）の混合液の吸光度を％で示した。

試験例２の結果を表２に示す。
［表２］

表２に示すように、本発明に係る製造例1〜4の加水分解物及び製造例5〜8の発酵物は、格段にすぐれたSOD様活性作用を有することが認められた。また、陽性対照のSODも同様の作用が認められたことから、本試験系が正常に行われたことも確認された。

試験例３．メラニン合成抑制効果
培養B16マウスメラノーマ細胞B16−F10を、24穴マイクロプレートに2.4×10⁴個／穴播種し、10％FBS含有RPMI1640培地中、37℃、5.0％CO₂の条件下に１日間プレ培養した後、10％FBS含有RPMI1640培地で、試料溶液を0.5％の終濃度（溶液として）となるように希釈した溶液と終濃度1mMになるように調整したテオフィリン含有培地を添加し、同条件で２日間培養した。次に培養液を除去し、1N NaOH/10％ジメチルスルフォキシド溶液を１穴あたり200μL添加し、シールして50℃、2時間インキュベートして細胞を溶解させた。この溶液100μLを別の96穴マイクロプレートに移し、マイクロプレートリーダー（Model 680、バイオラッド社製）を用い、波長490nmでメラニン値を測定した。一方同じ細胞を溶解させた溶液を5μL別の96穴マイクロプレートに移し、さらに精製水で5倍希釈したDye Reagent Concentrate（バイオラッド社）溶液を200μL添加し、 マイクロプレートリーダー（Model 680、バイオラッド社製）を用い、波長570nmの吸光度を測定した。別で既知の量の牛血清アルブミン（Sigma社製）を段階希釈し、同様に操作して得られた検量線から、アルブミン当量のタンパク質量を計測した。得られた吸光度をタンパク質量で徐して、タンパク質あたりのメラニン量を求めた。試料溶液に代えて30％1,3-ブチレングリコール水溶液を添加した試料無添加の場合（対照）についても上記と同様の操作を行い、ここに得られたタンパク質あたりのメラニン量に対する各試料添加時のタンパク質あたりのメラニン量の相対値を求め、メラニン合成率（％）とした。なお、比較のため、試料溶液の代わりに、2mMのコウジ酸を添加した場合（陽性対照）についても同様の試験を行った。

試験例３の結果を表３に示す。
［表３］

表３に示すように、本発明に係る製造例1〜4の加水分解物及び製造例5〜8の発酵物は、比較例１と比較して、格段にすぐれたメラニン合成抑制効果を有することが認められた。また、陽性対照のコウジ酸も同様の効果が認められたことから、本試験系が正常に行われたことも確認された。

試験例４．着色試験
製造例５，６の発酵物と、比較例１の抽出物の着色をTransmission Color meter（日本電色工業株式会社製）により測定した。各発酵物、抽出物の着色度をガードナー数値で示す。
［表４］

表４に示すように、本発明に係る製造例1〜4の加水分解物及び製造例5〜8の発酵物は、比較例１と比較して、着色の度合いが抑えられたものであり、皮膚外用剤等の配合原料としてすぐれたものであることが確認された。

Claims (1)

1. キク科(Compositae)ウサギギク属(Arnica）の植物であるアルニカ(Arnica montana)の花部の乳酸菌発酵物を含有する皮膚外用剤。