JP5072369B2 - 幹細胞増殖因子発現上昇抑制剤及び塩基性線維芽細胞増殖因子発現上昇抑制剤 - Google Patents

Description

本発明は、幹細胞増殖因子発現上昇抑制剤及び塩基性線維芽細胞増殖因子発現上昇抑制剤に関する。

シミ、ソバカス、日焼け後の皮膚色素沈着症等は、皮膚内に存在する色素細胞（メラノサイト）の活性化によりメラニン産生が著しく亢進した結果として生ずるものであり、多くの女性において肌の悩みの一つになっている。従来、美白効果を有するものとして種々の治療薬、皮膚外用剤、化粧料等が知られている。例えば、チロシナーゼ活性を阻害してメラニン産生を抑制するものとして、コロイド硫黄やグルタチオンに代表される硫黄化合物が用いられている。また、産生したメラニンを淡色漂白化するものとして、アスコルビン酸類、過酸化水素、ハイドロキノン、カテコール等が用いられている。

しかしながら、アスコルビン酸類は、含水化粧料のような水分を多く含むものに含有せしめると酸化されやいために不安定であり、化粧料の変色の原因となってしまう。また、過酸化水素水は、保存上の安定性及び使用上の安全性に問題がある。さらに、グルタチオン及びコロイド硫黄等の硫黄化合物は、著しい異臭を放つ点で問題がある。さらにまた、ハイドロキノン及びカテコールは、皮膚刺激性及びアレルギー性等を有し、使用上の安全性に問題がある。したがって、これらの美白成分を化粧料等の製品に使用することは制約されており、未だ十分に満足できる美白成分は知られておらず、より優れた美白剤の開発が所望されている。

幹細胞増殖因子（Stem Cell Factor，ＳＣＦ）は、Must Cell Growth Factor、C-Kit Ligand、Steel Factor等とも呼ばれ、角化細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、骨髄ストローマ細胞等から産生されるタンパク質である。ＳＣＦは、多能性造血幹細胞、生殖細胞、肥満細胞、巨核球系前駆細胞、顆粒球・マクロファージ系前駆細胞、色素細胞等の増殖や分化を促進する作用を有することが知られている。また、ＳＣＦは、シミ部位や紫外線照射等によって発現が亢進することが知られている（非特許文献１参照）。ＳＣＦとしては、２７３のアミノ酸残基からなる膜結合型ＳＣＦと、タンパク質分解酵素の作用により切断され、膜から遊離する分泌型ＳＣＦとが知られている。膜結合型ＳＣＦは、角化細胞等に結合したまま色素細胞のＳＣＦレセプターに結合し、色素細胞の増殖を促進する。また、分泌型ＳＣＦは、その結合部位にて切断され、細胞膜から遊離し、色素細胞のＳＣＦレセプターに結合することによって、色素細胞の増殖を促進する。また、ＳＣＦは、急性骨髄性白血病患者において、インターロイキン−３（Interleukin-3，ＩＬ−３）や顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor ，ＧＭ−ＣＳＦ）の共存下で骨髄芽球の増殖を促進することが知られている（非特許文献２参照）。

塩基性線維芽細胞増殖因子（basic Fibroblast Growth Factor ，ｂＦＧＦ）は、ＦＧＦ−２とも呼ばれ、紫外線照射により角化細胞からの遊離が促進され、遊離されたｂＦＧＦが色素細胞に作用してメラニン合成を促進し、かつ色素細胞の細胞分裂をも促進すると考えられている（非特許文献３参照）。また、ｂＦＧＦは、血管新生促進因子として知られており、腫瘍細胞（特に、悪性腫瘍細胞）における血管新生を促進すること等が知られている。

そのため、ＳＣＦ及びｂＦＧＦの異常産生は、色素細胞の異常増殖につながり、メラニン産生を亢進させ、シミ、ソバカス、くすみ等の原因となると考えられる。また、ＳＣＦの異常産生は、骨髄芽球の異常増殖につながり、それにより骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）等の疾患を引き起こすものと考えられ、ｂＦＧＦの異常産生は、腫瘍細胞における血管新生を促進し、それにより腫瘍細胞の増殖につながるものと考えられる。

したがって、ＳＣＦ及びｂＦＧＦの発現上昇を抑制することは、色素細胞の増殖を抑制し、皮膚におけるメラニンの過剰産生を抑制し、日焼け後の色素沈着、シミ、ソバカス等の予防又は抑制に有用であると考えられる。また、ＳＣＦの発現上昇を抑制することは、骨髄芽球の異常増殖を抑制し、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病等の予防又は治療に有用であると考えられ、ｂＦＧＦの発現上昇を抑制することは、腫瘍細胞における血管新生を抑制し、腫瘍細胞の増殖を抑制することで、がん治療等に有用であると考えられる。
Hachiya A et al., J. Invest. Dermatol., No.116, 2001, p.578-586 Virginia C. Broudy et al., Blood, Vol.80, No.1, 1992, p.60-67 Halaban R. et al., J. Cell. Biol., No.107, 1988, p.1611-1619

本発明は、安全性の高い天然物の中からＳＣＦ発現上昇抑制作用及びｂＦＧＦ発現上昇抑制作用を有するものを見出し、それを有効成分とする幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）発現上昇抑制剤及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）発現上昇抑制剤を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明の幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）発現上昇抑制剤及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）発現上昇抑制剤は、アルニカからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
また、本発明の幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）の発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）の発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤は、アルニカからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。

本発明によれば、天然物であるアルニカからの抽出物を有効成分として含有し、安全性に優れた幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）発現上昇抑制剤及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）発現上昇抑制剤を提供することができる。

以下、本発明について詳細に説明する。
〔幹細胞増殖因子発現上昇抑制剤，塩基性線維芽細胞増殖因子発現上昇抑制剤〕
本発明の幹細胞増殖因子（以下「ＳＣＦ」という。）発現上昇抑制剤及び塩基性線維芽細胞増殖因子（以下「ｂＦＧＦ」という。）発現上昇抑制剤は、アルニカからの抽出物を有効成分として含有する。

ここで、本発明において「アルニカからの抽出物」には、アルニカを抽出原料として得られる抽出液、当該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、当該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物のいずれもが含まれる。

本発明において使用する抽出原料は、アルニカ（学名：Arnica montana L.）である。アルニカ（Arnica montana L.）は、ヨーロッパから南ロシアまでの山岳地方の酸性土壌の牧草地に生育するヒナギク（daisy）に似たキク科の多年草であり、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得る部位としては、例えば、幹部、地上部、花部、根部、全草等が挙げられるが、好ましくは花部である。

ここで、「花」とは、一般に種子植物の有性生殖にかかわる器官の総体をいい、葉の変形である花葉と、茎の変形である花軸とから構成され、花葉には、萼、花弁、オシベ、心皮等の器官が含まれる。本発明において抽出原料として使用し得る「花部」には、種子植物の有性生殖にかかわる器官の総体の他、その一部、例えば、花葉、花被（萼と花冠）、花冠、花弁等も含まれる。

アルニカからの抽出物に含有されるＳＣＦ発現上昇抑制作用及びｂＦＧＦ発現上昇抑制作用を有する物質の詳細は不明であるが、植物の抽出に一般に用いられている抽出方法によって、アルニカからＳＣＦ発現上昇抑制作用及びｂＦＧＦ発現上昇抑制作用を有する抽出物を得ることができる。

例えば、上記植物を乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供することにより、ＳＣＦ発現上昇抑制作用及びｂＦＧＦ発現上昇抑制作用を有する抽出物を得ることができる。乾燥は、天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。脱脂等の前処理を行うことにより、アルニカの極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。

抽出溶媒としては、極性溶媒を用いるのが好ましく、例えば、水、親水性有機溶媒等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて、室温又は溶媒の沸点以下の温度で使用することが好ましい。

抽出溶媒として使用し得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等のほか、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧調整、緩衝化等が含まれる。したがって、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。

抽出溶媒として使用し得る親水性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。

２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として使用する場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族アルコール１〜９０質量部を混合することが好ましく、水と低級脂肪族ケトンとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して低級脂肪族ケトン１〜４０質量部を混合することが好ましく、水と多価アルコールとの混合液を使用する場合には、水１０質量部に対して多価アルコール１０〜９０質量部を混合することが好ましい。

抽出処理は、抽出原料に含まれる可溶性成分を抽出溶媒に溶出させ得る限り特に限定はされず、常法に従って行うことができる。例えば、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）の抽出溶媒に、抽出原料を浸漬し、常温又は還流加熱下で可溶性成分を溶出させた後、濾過して抽出残渣を除去することにより抽出液を得ることができる。得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。

精製は、例えば、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等により行うことができる。得られた抽出液はそのままでもＳＣＦ発現上昇抑制剤及びｂＦＧＦ発現上昇抑制剤の有効成分として使用することができるが、濃縮液又は乾燥物としたものの方が使用しやすい。

アルニカからの抽出物は、特有の匂いと味とを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、ＳＣＦ発現上昇抑制剤又はｂＦＧＦ発現上昇抑制剤に配合する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。

以上のようにして得られるアルニカからの抽出物は、ＳＣＦ発現上昇抑制作用又はｂＦＧＦ発現上昇抑制作用を有しているため、それらの作用を利用してＳＣＦ発現上昇抑制剤又はｂＦＧＦ発現上昇抑制剤の有効成分として用いることができる。また、アルニカからの抽出物は、そのＳＣＦ発現上昇抑制作用を利用して、ＳＣＦの発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤、具体的には骨髄異形成症候群予防・治療剤、急性骨髄性白血病予防・治療剤、抗腫瘍剤等の有効成分として用いることもできる。さらに、アルニカからの抽出物は、そのｂＦＧＦ発現上昇抑制作用を利用して、ｂＦＧＦの発現上昇に起因する疾患の予防・治療剤、具体的には血管新生抑制剤、抗がん剤、抗腫瘍剤、がん細胞の転移を抑制する医薬組成物等の有効成分として用いることもできる。

本発明のＳＣＦ発現上昇抑制剤又はｂＦＧＦ発現上昇抑制剤は、アルニカからの抽出物のみからなるものでもよいし、アルニカからの抽出物を製剤化したものでもよい。

アルニカからの抽出物は、デキストリン、シクロデキストリン等の薬学的に許容し得るキャリアーその他任意の助剤を用いて、常法に従い、粉末状、顆粒状、錠剤状、液状等の任意の剤形に製剤化して提供することができる。この際、助剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯臭剤等を用いることができる。また、アルニカからの抽出物は、他の組成物に配合して使用できるほか、軟膏剤、外用液剤、貼付剤等として使用することができる。

なお、本発明のＳＣＦ発現上昇抑制剤又はｂＦＧＦ発現上昇抑制剤は、必要に応じてＳＣＦ発現上昇抑制作用又はｂＦＧＦ発現上昇抑制作用を有する他の天然抽出物等を、アルニカからの抽出物とともに配合して有効成分として用いることができる。

本発明のＳＣＦ発現上昇抑制剤又はｂＦＧＦ発現上昇抑制剤の患者に対する投与方法としては、皮下組織内投与、筋肉内投与、静脈内投与、経口投与、経皮投与等が挙げられるが、疾患の種類に応じて、その予防・治療等に好適な方法を適宜選択すればよい。また、本発明のＳＣＦ発現上昇抑制剤又はｂＦＧＦ発現上昇抑制剤の投与量も、疾患の種類、重症度、患者の個人差、投与方法、投与期間等によって適宜増減すればよい。

本発明のＳＣＦ発現上昇抑制剤は、アルニカからの抽出物が有するＳＣＦ発現上昇抑制作用を通じて、ＳＣＦの発現の上昇を抑制することができ、これにより色素細胞の増殖やメラニンの産生を抑制し、シミ、ソバカス、皮膚色素沈着症等を予防又は改善することができ、美白効果を得ることができる。また、アルニカからの抽出物が有するＳＣＦ発現上昇抑制作用を通じて、骨髄芽球の異常増殖を抑制することができ、これにより骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病等の疾患を予防、治療又は改善することができる。ただし、本発明のＳＣＦ発現上昇抑制剤は、これらの用途以外にもＳＣＦ発現上昇抑制作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。

本発明のｂＦＧＦ発現上昇抑制剤は、アルニカからの抽出物が有するｂＦＧＦ発現上昇抑制作用を通じて、ｂＦＧＦの発現の上昇を抑制することができ、これにより色素細胞の増殖やメラニンの産生を抑制し、シミ、ソバカス、皮膚色素沈着症等を予防又は改善することができ、美白効果を得ることができる。また、本発明のｂＦＧＦ発現上昇抑制剤は、アルニカからの抽出物が有するｂＦＧＦ発現上昇抑制作用を通じて、腫瘍細胞における異常な血管新生を抑制し、がん等の疾患を予防、治療又は改善をすることができる。ただし、本発明のｂＦＧＦ発現上昇抑制剤は、これらの用途以外にもｂＦＧＦ発現上昇抑制作用を発揮することに意義のあるすべての用途に用いることができる。

〔皮膚外用剤〕
本発明のアルニカからの抽出物を有効成分として含有するＳＣＦ発現上昇抑制剤及びｂＦＧＦ発現上昇抑制剤は、皮膚外用剤に配合して使用することができる。本発明のＳＣＦ発現上昇抑制剤及びｂＦＧＦ発現上昇抑制剤を配合し得る皮膚外用剤としては、例えば、医薬品、医薬部外品、一般皮膚化粧料、薬用化粧料等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

皮膚外用剤におけるＳＣＦ発現上昇抑制剤又はｂＦＧＦ発現上昇抑制剤の配合量は、皮膚外用剤の種類や抽出物の生理活性等によって適宜調整することができるが、好適な配合率は標準的な抽出物に換算して０．００１〜１０質量％である。

本発明のＳＣＦ発現上昇抑制剤又はｂＦＧＦ発現上昇抑制剤を配合し得る皮膚外用剤は、本発明のＳＣＦ発現上昇抑制剤又はｂＦＧＦ発現上昇抑制剤が有する作用を損なわない範囲で、必要に応じて皮膚外用剤の製造に通常使用される各種主剤及び助剤を併用することができる。

本発明のＳＣＦ発現上昇抑制剤又はｂＦＧＦ発現上昇抑制剤とともに皮膚外用剤構成成分として併用可能なものとしては、例えば、グリセリン、コラーゲン、ヒアルロン酸及びその塩、コンドロイチン酸及びその塩、キチン、キトサン等の保湿剤；パラジメチルアミノ安息香酸アミル等の紫外線吸収剤；グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質等の複合脂質；β−カロチン、油溶性甘草エキス、リコカルコンＡ、バイカリン、バイカレイン、その他の活性酸素消去作用を有する物質；アズレン、グリチルリチン酸及びその塩類、グリチルレチン酸及びその誘導体、酸化亜鉛等の抗炎症作用物質；リボフラビン、トロフェロール、アスコルビン酸、葉酸等のビタミン及びその誘導体類；ホホバ油、ラノリン、流動パラフィン、スクワラン、イソステアリルアルコール等の油性成分；ステアリル硫酸ナトリウム、セシル硫酸ジエタノールアミン、ステアリン酸グリセリン等の界面活性剤；エリソルビン酸ナトリウム等の酸化防止剤；エチルパラベン等の防腐剤；オウバク抽出物、カミツレ抽出物、カンゾウ根抽出物、ローズマリー抽出物、マロニエ抽出物等のコレステロール類；植物ステロール類；リポプロテイン類；ビフィズス菌培養物、乳酸菌培養物、酵母抽出物、ブクリョウ抽出物等の微生物由来成分；褐藻抽出物、紅藻抽出物等の藻類抽出物；γ−オリザノール等の血行促進剤；硫黄等の抗脂漏剤；香料；アルコール；カルボキシポリマー等の増粘剤；チタンイエロー、ベニバナ、その他の着色料等が挙げられる。このように併用することで、より一般性のある製品となり、また、それにより、併用された他の有効成分との間の相乗作用が通常期待される以上の優れた効果をもたらすことがある。

本発明の皮膚外用剤は、その構成成分としてのＳＣＦ発現上昇抑制剤又はｂＦＧＦ発現上昇抑制剤が有するＳＣＦ発現上昇抑制作用又はｂＦＧＦ発現上昇抑制作用を通じて、色素細胞の増殖やメラニンの産生を抑制し、シミ、ソバカス、皮膚色素沈着症等を予防又は改善することができ、美白効果を得ることができる。

〔飲食品〕
本発明のＳＣＦ発現上昇抑制剤及びｂＦＧＦ発現上昇抑制剤の有効成分であるアルニカからの抽出物は、消化管で消化されるようなものではないことが確認されている。そのため、本発明のＳＣＦ発現上昇抑制剤及びｂＦＧＦ発現上昇抑制剤は、任意の飲食品や栄養補助食品に配合するのに好適である。この場合の配合量は、添加対象飲食品の一般的な摂取量を考慮して成人１日当たりのアルニカ抽出物摂取量が１〜１００ｍｇになるようにするのが適当である。

本発明のＳＣＦ発現上昇抑制剤及びｂＦＧＦ発現上昇抑制剤を配合し得る飲食品は、特に限定されるものではないが、例えば、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調製用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、カキ氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子等の菓子類；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；スープ、シチュー、サラダ、惣菜、漬物等を挙げることができる。

なお、本発明のＳＣＦ発現上昇抑制剤又はｂＦＧＦ発現上昇抑制剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。

以下、製造例、試験例及び配合例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。

〔製造例１〕アルニカ抽出物の製造
細切りにしたアルニカの花部の乾燥物２００ｇに５０質量％エタノール（水とエタノールとの質量比＝１：１）２０００ｍＬを加え、還流抽出器で８０℃にて２時間加熱抽出し、熱時濾過した。残渣についてさらに同様の抽出処理を行った。得られた抽出液を合わせて減圧下に濃縮し、乾燥してアルニカ抽出物１２ｇを得た。

〔試験例１〕ＳＣＦ及びｂＦＧＦのｍＲＮＡ発現上昇抑制作用試験
製造例１で得られたアルニカ抽出物について、以下のようにしてＳＣＦ ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用及びｂＦＧＦ ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を試験した。

（１）一本鎖ＤＮＡの調製
ヒト正常新生児表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を３５ｍｍ ｄｉｓｈに播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下にて２４時間培養を行った。培養終了後、リン酸生理緩衝液１ｍＬで洗浄し、ハンクス液１ｍＬに交換した。これにTOREX FL20SE-30/DMRを４灯装着した紫外線照射装置を光源として、紫外線ＵＶ−Ｂを５０ｍＪ／ｃｍ^２照射した。照射後直ちに、所定濃度（表１及び表２参照）の試料添加培地に交換し、２４時間培養した。培養終了後、常法により総ＲＮＡを調製した。また、「試料無添加・紫外線照射なし」及び「試料無添加・紫外線照射あり」で培養した細胞に関しても、同様に総ＲＮＡを調製した。総ＲＮＡの調製は、下記の方法を用いて行った。

細胞を１ｍＬのＲＮＡ抽出用試薬（製品名：ISOGEN，ニッポンジーン社製）で溶解させ、クロロホルムを２００μＬ添加後、遠心（１２０００回転，４℃，１５分間）にて上層ＲＮＡ層を単離し、さらにイソプロパノールで濃縮した。濃縮沈殿させた総ＲＮＡをＴＥ溶液（10mM Tris-HCl/1mM EDTA，ｐＨ＝８．０）に溶解して総ＲＮＡ標品とし、ＰＣＲ装置（製品名：TaKaRa PCR Themal Cycler MP，タカラバイオ社製）及びリアルタイムＰＣＲ専用逆転写キット（製品名：TaKaRa ExScript RT reagent Kit，タカラバイオ社製）を用いて、ＳＣＦ及びｂＦＧＦのｍＲＮＡ発現量を測定するための鋳型に使用する一本鎖ＤＮＡを合成した。

（２）サイバーグリーン法を用いたリアルタイム−ＰＣＲ反応
ＳＣＦ遺伝子増幅用プライマーとして下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを作製した（タカラバイオ社製）。
センスプライマー：5'-cccttaggaatgacagcagtagca-3'
アンチセンスプライマー：5'-gcccttgtaagacttggctgtctc-3'

ｂＦＧＦ遺伝子増幅用プライマーとして下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを作製した（タカラバイオ社製）。
センスプライマー：5'-gtgtgctaaccgttacctggctatg-3'
アンチセンスプライマー：5'-ccagttcgtttcagtgccaca-3'

また、内部標準としてのＧ３ＰＤＨ遺伝子増幅用プライマーとして下記の配列を有するセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを作製した（タカラバイオ社製）。
センスプライマー：5'-gcaccgtcaaggctgagaac-3'
アンチセンスプライマー：5'-atggtggtgaagacgccagt-3'

「試料無添加・紫外線照射なし」、「試料無添加・紫外線照射あり」及び「試料添加・紫外線照射あり」でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基に調製した一本鎖ＤＮＡ及び検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液を用いて、リアルタイムＰＣＲ装置（製品名：Real Time PCR System Smart Cycler II，Cepheid社製）及びリアルタイムＰＣＲキット（製品名：SYBR Premix Ex Taq，タカラバイオ社製）でリアルタイムＰＣＲ反応を行った。なお、検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液は、原液濃度の相対値を便宜的に「１０００００」とし、以降１０倍希釈を繰り返して濃度値「１０００００」、「１００００」、「１０００」、「１００」及び「１０」の５段階の希釈系列とした。反応は、９５℃で１０秒間保温の後、９５℃で５秒間、５７℃で２０秒間の反応を４５サイクル繰り返し、１サイクルごとにサイバーグリーン色素の発光量を測定した。

（３）解析
各サイクルのサイバーグリーン色素の発光量からＳＣＦ、ｂＦＧＦ及びＧ３ＰＤＨのそれぞれをコードするＤＮＡ断片の増幅曲線を作成した。検量線作成用一本鎖ＤＮＡ溶液の希釈系列の増幅曲線から横軸に濃度、縦軸に増幅曲線の２次導関数が最大となるサイクル数をとった検量線を作成した。各発現定量用サンプルについては、増幅曲線の２次導関数が最大となるサイクル数を検量線上にプロットし、相対的な発現量を算出した。ＳＣＦ及びｂＦＧＦの発現量は、同一サンプルにおけるＧ３ＰＤＨの発現量の値で補正した後、さらに「試料無添加・紫外線照射なし」の補正値を１００としたときの「試料無添加・紫外線照射あり」及び「試料添加・紫外線照射あり」の補正値として算出した。

ＳＣＦ ｍＲＮＡ発現上昇率（％）及びｂＦＧＦ ｍＲＮＡ発現上昇抑制率（％）は下記式により算出した。
ｍＲＮＡ発現上昇抑制率(％)＝{(Ａ−Ｂ)−(Ａ−Ｃ)}／(Ａ−Ｂ)×１００
式中、Ａは「試料無添加・紫外線照射なしの補正値」を表し、Ｂは、「試料無添加・紫外線照射ありの補正値」を表し、Ｃは、「試料添加・紫外線照射ありの補正値」を表す。
ＳＣＦ ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用試験の結果を表１に、ｂＦＧＦ ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用試験の結果を表２に示す。

表１に示すように、アルニカからの抽出物は、優れたＳＣＦ ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用及びｂＦＧＦ ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用を有することが確認された。また、アルニカからの抽出物が有するＳＣＦ ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用及びｂＦＧＦ ｍＲＮＡ発現上昇抑制作用の程度は、アルニカからの抽出物の濃度に依存し、アルニカからの抽出物の濃度により調節することができるものと考えられる。

〔配合例１〕
下記組成の乳液を常法により製造した。
アルニカ花部５０質量％エタノール抽出物（製造例１） ０．０１ｇ
ホホバオイル ４．０ｇ
プラセンタエキス ０．１ｇ
オリーブオイル ２．０ｇ
スクワラン ２．０ｇ
セタノール ２．０ｇ
モノステアリン酸グリセリル ２．０ｇ
ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．０） ２．５ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．０） ２．０ｇ
グリチルレチン酸ステアリル ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ３．０ｇ
ヒノキチオール ０．１５ｇ
香料 ０．０５ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）

〔配合例２〕
下記組成の化粧水を常法により製造した。
アルニカ花部５０質量％エタノール抽出物（製造例１） ２ｇ
グリセリン ３ｇ
１，３−ブチレングリコール ３ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．０） ０．５ｇ
パラオキシ安息香酸メチル ０．１５ｇ
クエン酸 ０．１ｇ
クエン酸ソーダ ０．１ｇ
香料 ０．０５ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）

〔配合例３〕
下記組成のクリームを常法により製造した。
アルニカ花部５０質量％エタノール抽出物（製造例１） ０．０５ｇ
アロエエキス ０．１ｇ
流動パラフィン ５．０ｇ
サラシミツロウ ４．０ｇ
スクワラン １０．０ｇ
セタノール ３．０ｇ
ラノリン ２．０ｇ
ステアリン酸 １．０ｇ
オレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．０） １．５ｇ
モノステアリン酸グリセリル ３．０ｇ
油溶性甘草エキス ０．１ｇ
１，３−ブチレングリコール ６．０ｇ
パラオキシ安息香酸メチル １．５ｇ
香料 ０．１ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）

〔配合例４〕
下記組成のパックを常法により製造した。
アルニカ花部５０質量％エタノール抽出物（製造例１） ０．０５ｇ
ヨクイニンエキス ０．１ｇ
ポリビニルアルコール １５ｇ
ポリエチレングリコール ３ｇ
プロピレングリコール ７ｇ
エタノール １０ｇ
パラオキシ安息香酸メチル ０．０５ｇ
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１ｇ
香料 ０．０５ｇ
精製水 残部（全量を１００ｇとする）

〔配合例５〕
下記の混合物を打錠して、錠剤状栄養補助食品を製造した。
アルニカ花部５０質量％エタノール抽出物（製造例１） ３０．０質量部
マルチトール ４７．０質量部
結晶セルロース １５．０質量部
ショ糖脂肪酸エステル ８．０質量部

〔配合例６〕
下記の混合物を顆粒状に形成して栄養補助食品を製造した。
アルニカ花部５０質量％エタノール抽出物（製造例１） ３４質量部
ビートオリゴ糖 １０００質量部
ビタミンＣ １６７質量部
ステビア抽出物 １０質量部

本発明の幹細胞増殖因子（ＳＣＦ）発現上昇抑制剤及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）発現上昇抑制剤は、日焼け後の皮膚色素沈着症、シミ、ソバカス等の予防又は改善に有用である。

Claims (1)

1. アルニカからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）発現上昇抑制剤（美白用途を除く）。