JP5697879B2 - 熱ショックタンパク質の発現誘導剤 - Google Patents
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Description
<細胞培養法及びHSP過剰発現株の作成>
マウスメラノーマ由来のB16細胞(理研バイオリソースセンター)を、DMEM培地(10%の牛胎児血清、100U/mLのペニシリン、100U/mLのストレプトマイシン)で、5%炭酸ガス雰囲気下37℃で培養した。次に、リポフェクタミン(TM2000:Invitrogen社)を用いて、pcDNA3.1−human HSP70、又はpcDNA3.1をB16細胞に導入した後、200μg/mLのG418(Sigma社)を用いて、G418耐性クローンであるHSP70過剰発現株を選択した。また、HSP70の発現は、イムノブロット法により調べた。
メラニン発現を誘導する作用のあるIBMXをDMSOに溶解した。次に、IBMXをDMEM培地に100μmol/Lで希釈した後、培地交換を行い、5%炭酸ガス雰囲気下37℃で各時間、B16細胞を培養した。熱ショック処理は、5%炭酸ガス雰囲気下42℃にて1時間、B16細胞を培養することにより行った。さらに5%炭酸ガス雰囲気下37℃で6時間、B16細胞を培養した後、B16細胞を実験に用いた。
熱ショックを1時間行い、更に6時間培養した後、又はIBMX 100μmol/L存在下、48時間培養した後、細胞を遠心して回収した。次に、回収物をPBS(リン酸緩衝生理食塩水:137mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KCl, 1.5mmol/L KH2PO4, 4.3mmol/L NaHPO4)で洗った後、RIPA buffer [50mmol/L Tris−HCl (pH 7.2), 150mmol/L NaCl, 1% NP−40, 1% Sodium, deoxycolate, 0.05% SDS]に溶解し、遠心後の上清を全細胞抽出液として実験に用いた。
IBMX 100μmol/L存在下、72時間培養した後、細胞を遠心して回収しPBSで洗った後、1N NaOHに溶解し、100℃/30分加熱した。遠心後の上清を全細胞抽出液として実験に用いた。各サンプルのタンパク質量を、Bio−Rad protein assay kitにより求め、同量のタンパク質量に揃えた後、490nmの吸光度を、プレートリーダー(Fluostar Galaxy社)により測定した。
IBMX 100μmol/L存在下、48時間培養した後、RNeasy kit(Qiagen社)を用いて細胞から全RNAを抽出した。
RNA 2.5μgを、first−strand cDNA synthesis kit(TAKARA Bio社)を用いて逆転写し、cDNAを合成した。合成したcDNAは、iQ SYBR GREEN Supermix(Bio Rad社)を用いてreal−time RT−PCRに利用し、Opticon Monitor Softwareを用いて解析した。PCR反応は、50℃で2分、90℃で10分の後に、95℃で30秒、63℃で60秒のサイクルを、45サイクルという条件で行った。特異性は、反応生成物をテンプレート(−)及び逆転写(−)のコントロールと一緒にアガロースゲル電気泳動を行って確認した。それぞれの反応において、GAPDH遺伝子を内部標準として用いた。
GAPDH 5'-aactttggcattgtggaagg-3' 5'-acacattgggggtaggaaca-'
以下の実施例を含め、すべての値は、平均値±標準偏差[standard deviation (SD)]で示している。有意差検定は、Tukey's testを用い
た。pの値が0.05未満になったとき有意な差があると判定した。
その結果を、図1乃至図7に示す。
図1は、B16細胞の熱ショックによるHSP70の発現誘導を示す結果であり、図2は、IBMXによるメラニン産生誘導に対する熱ショックの影響を示す結果である。
図1及び図2に示す結果から判明するように、熱ショックによりHSP70が発現誘導されており、IBMXによるメラニンの産生誘導の抑制にHSP70が関与していることが示された。
以上の図1〜図5に示す結果から、HSP70過剰発現株においても同様にIBMXによるメラニンの発現誘導が抑制されることが見られ、特に図4及び図5の結果からは、HSP70が単独でも、IBMXによるメラニンの発現誘導を抑制することに関与していることが示された。
図6は、チロシナーゼのタンパク質の発現結果を、図7は、チロシナーゼのmRNAの発現結果を示すものである。
図中に示す結果より、IBMXによるチロシナーゼの発現誘導をHSP70が抑制することが示された。すなわち、HSP70は、チロシナーゼの発現を抑制することで、メラニンの産生を抑制していることが示された。
HSP70発現誘導剤を構成するアルニカ抽出物は、以下のように調整した。まず、生のアルニカ(丸善製薬)を粉砕した後、凍結乾燥し、ミキサーでさらに粉砕した。なお、乾燥したアルニカを用意した場合は、アルニカを水に戻した後、アルニカをミキサーにより粉砕した。その後、粉砕したアルニカを凍結乾燥し、ミキサーでさらに粉砕した。次に、凍結乾燥した粉砕物にエタノールを加え、3時間抽出し、濾過して濾液を得た。その後、濾液を乾燥状態になるまで濃縮し、アルニカ抽出物を得た。サルビア抽出物及びマジョラム抽出物も、同様の方法により得た。
培養液を満たした直径100mmの培養皿に、4×105個のメラノーマ細胞B16(理研バイオリソースセンター)を播種し、5%炭酸ガス雰囲気下に37℃にて24時間培養した。この培養液に、実施例2で得たアルニカ抽出物を、濃度2.5×10-2mg/mL、5.0×10-2mg/mL、7.5×10-2mg/mL、又は10.0×10-2mg/mLで添加し、さらに12時間又は24時間培養した。なお、コントロールとして、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞も、12時間又は24時間培養した。
培養液を満たした直径100mmの培養皿に、4×105個又は24×105個の表皮細胞PAM212を播種し、5%炭酸ガス雰囲気下に37℃にて24時間培養した。この培養液に、実施例2で得たアルニカ抽出物を、濃度5.0×10-2mg/mL、7.5×10-2mg/mL、10.0×10-2mg/mL、又は20.0×10-2mg/mLで添加し、さらに24時間培養した。なお、コントロールとして、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞も、24時間培養した。
培養液を満たした直径100mmの培養皿に、4×105個のメラノーマ細胞B16を播種し、5%炭酸ガス雰囲気下に37℃にて24時間培養した。この培養液に、実施例2で得たサルビア抽出物を、濃度50×10-2mg/mL、70×10-2mg/mL、80×10-2mg/mL、又は100×10-2mg/mLで添加し、さらに24時間培養した。なお、コントロールとして、サルビア抽出物を添加しなかった細胞も、24時間培養した。
培養液を満たした直径100mmの培養皿に、4×105個のメラノーマ細胞B16を播種し、5%炭酸ガス雰囲気下に37℃にて24時間培養した。この培養液に、実施例2で得たマジョラム抽出物を、濃度40×10-2mg/mL、50×10-2mg/mL、60×10-2mg/mL、又は70×10-2mg/mLで添加し、さらに24時間培養した。なお、コントロールとして、マジョラム抽出物を添加しなかった細胞も、24時間培養した。
培養液を満たした直径100mmの培養皿に、4×105個のメラノーマ細胞B16を播種し、5%炭酸ガス雰囲気下に37℃にて24時間培養した。次に、培養液に、実施例2で得たアルニカ抽出物を、2.5×10-2mg/mL、5.0×10-2mg/mL、7.5×10-2mg/mL、又は10.0×10-2mg/mLの濃度で添加し、24時間培養した。なお、コントロールとして、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞も、24時間培養した。
培養液を満たした直径100mmの培養皿に、4×105個のメラノーマ細胞B16を播種し、5%炭酸ガス雰囲気下に37℃にて24時間培養した。次に、培養液に、実施例2で得たアルニカ抽出物を、2.5×10-2mg/mL、5.0×10-2mg/mL、7.5×10-2mg/mL、又は10.0×10-2mg/mLの濃度で添加し、24時間培養した。なお、コントロールとして、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞も、24時間培養した。
培養液を満たした直径100mmの培養皿に、4×105個のメラノーマ細胞B16を播種し、5%炭酸ガス雰囲気下に37℃にて24時間培養した。次に、培養液に、実施例2で得たサルビア抽出物を、25×10-2mg/mL、50×10-2mg/mL、75×10-2mg/mL、又は100×10-2mg/mLの濃度で添加し、24時間培養した。なお、コントロールとして、サルビア抽出物を添加しなかった細胞も、24時間培養した。
培養液を満たした直径100mmの培養皿に、4×105個のメラノーマ細胞B16を播種し、5%炭酸ガス雰囲気下に37℃にて24時間培養した。次に、培養液に、実施例2で得たマジョラム抽出物を、10×10-2mg/mL、20×10-2mg/mL、30×10-2mg/mL、又は50×10-2mg/mLの濃度で添加し、24時間培養した。なお、コントロールとして、マジョラム抽出物を添加しなかった細胞も、24時間培養した。
培養液を満たした直径100mmの培養皿に、4×105個のメラノーマ細胞B16を播種し、5%炭酸ガス雰囲気下に37℃にて24時間培養した。次に、培養液に、実施例2で得たアルニカ抽出物を、2.5×10-2mg/mL、5.0×10-2mg/mL、7.5×10-2mg/mL、又は10.0×10-2mg/mLの濃度で添加し、24時間培養した。なお、コントロールとして、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞も、24時間培養した。
培養液を満たした直径100mmの培養皿に、4×105個のメラノーマ細胞B16を播種し、5%炭酸ガス雰囲気下に37℃にて24時間培養した。この培養液に、実施例2で得たアルニカ抽出物を、濃度1.0×10-2mg/mL、2.5×10-2mg/mL、5.0×10-2mg/mL、又は10.0×10-2mg/mLで添加し、さらに24時間培養した。なお、コントロールとして、アルニカ抽出物を添加しなかった細胞も、24時間培養した。
培養液を満たした直径100mmの培養皿に、4×105個のメラノーマ細胞B16を播種し、5%炭酸ガス雰囲気下に37℃にて24時間培養した。この培養液に、実施例2で得たサルビア抽出物を、濃度25×10-2mg/mL、50×10-2mg/mL、75×10-2mg/mL、又は100×10-2mg/mLで添加し、さらに24時間培養した。なお、コントロールとして、サルビア抽出物を添加しなかった細胞も、24時間培養した。
培養液を満たした直径100mmの培養皿に、4×105個のメラノーマ細胞B16を播種し、5%炭酸ガス雰囲気下に37℃にて24時間培養した。この培養液に、実施例2で得たマジョラム抽出物を、濃度10×10-2mg/mL、20×10-2mg/mL、30×10-2mg/mL、又は50×10-2mg/mLで添加し、さらに24時間培養した。なお、コントロールとして、マジョラム抽出物を添加しなかった細胞も、24時間培養した。
以下の処方により、皮膚外用剤(クリーム剤)を得た。
スクワラン 20重量%
ミツロウ 5
精製ホホバ油 5
グリセリンモノステアレート 2
ソルビタンモノステアレート 2
ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート 2
グリセリン 5
アルニカ抽出物 1
精製水 100とする残部
(1)ローション
以下の処方により、ローションを得た。
ソルビット 2重量%
1,3−ブチレングリコール 2
ポリエチレングリコール1000 1
ポリオキシエチレンオレイルエーテル(25EO) 2
エタノール 10
テプレノン 1
防腐剤 適量
精製水 100とする残部
以下の処方により、乳液を得た。
スクワラン 1重量%
グリセリン 1
ステアリルアルコール 0.3
ソルビタンモノステアレート 1.5
ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノステアレート 2
1,3−ブチレングリコール 5
アルニカ抽出物 1
精製水 100とする残部
Claims (16)
- アルニカを含有する熱ショックタンパク質の発現誘導剤。ただし、美白化粧料を除く。
- アルニカを含有する熱ショックタンパク質の発現誘導剤からなる抗細胞死作用薬。
- アルニカを含有する熱ショックタンパク質の発現誘導剤からなる抗炎症作用薬。
- アルニカを含有する熱ショックタンパク質の発現誘導剤からなる細胞保護作用薬。
- 前記熱ショックタンパク質が熱ショックタンパク質70ファミリーに属する、請求項1に記載の発現誘導剤。
- 前記熱ショックタンパク質が熱ショックタンパク質70ファミリーに属する、請求項2に記載の抗細胞死作用薬。
- 前記熱ショックタンパク質が熱ショックタンパク質70ファミリーに属する、請求項3に記載の抗炎症作用薬。
- 前記熱ショックタンパク質が熱ショックタンパク質70ファミリーに属する、請求項4に記載の細胞保護作用薬。
- マジョラムを含有する熱ショックタンパク質の発現誘導剤。ただし、美白化粧料を除く。
- マジョラムを含有する熱ショックタンパク質の発現誘導剤からなる抗細胞死作用薬。
- マジョラムを含有する熱ショックタンパク質の発現誘導剤からなる抗炎症作用薬。
- マジョラムを含有する熱ショックタンパク質の発現誘導剤からなる細胞保護作用薬。
- 前記熱ショックタンパク質が熱ショックタンパク質70ファミリーに属する、請求項9に記載の発現誘導剤。
- 前記熱ショックタンパク質が熱ショックタンパク質70ファミリーに属する、請求項10に記載の抗細胞死作用薬。
- 前記熱ショックタンパク質が熱ショックタンパク質70ファミリーに属する、請求項11に記載の抗炎症作用薬。
- 前記熱ショックタンパク質が熱ショックタンパク質70ファミリーに属する、請求項12に記載の細胞保護作用薬。
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