KR102561708B1 - 약제로서의 적용을 위한 모링가 페레그리나 종자 케이크의 단백질 가수분해물, 그를 수득하는 방법 및 약학적 및 피부과용 조성물 - Google Patents

약제로서의 적용을 위한 모링가 페레그리나 종자 케이크의 단백질 가수분해물, 그를 수득하는 방법 및 약학적 및 피부과용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 모링가 페레그리나 (Moringa peregrina) 종자 케이크의 특정 단백질 가수분해물을 수득하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 모링가 페레그리나 종자 케이크의 단백질 가수분해물 및 약제로서의 그의 용도에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 활성제로서 유효량의 모링가 페레그리나 종자 케이크의 단백질 가수분해물을 포함하는, 섬유화 질환의 치료, 염증의 치료, 암의 치료, 박테리아 또는 바이러스 타입의 감염성 질환의 치료, 및 피부 색소침착과 연관된 병리 및 유전적 부동의 치료를 위한 약제로서 사용하기 위한 약학적 또는 피부과용 조성물에 관한 것이다.

Description

약제로서의 적용을 위한 모링가 페레그리나 종자 케이크의 단백질 가수분해물, 그를 수득하는 방법 및 약학적 및 피부과용 조성물
본 발명은 약학 및 피부과 분야에 관한 것이고, 보다 구체적으로, 약물의 제형의 활성 성분에 관한 것이다. 본 발명은 모링가 페레그리나(Moringa peregrina) 종자 케이크(seed cake)로부터 단백질 가수분해물을 수득하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 모링가 페레그리나 종자 케이크로부터의 단백질 가수분해물, 이러한 타입의 가수분해물을 포함하고 섬유화 질환의 치료, 염증, 암, 감염성 박테리아 또는 바이러스 타입의 질환의 치료, 및 피부 색소 침착과 관련된 병리 및 유전적 부동의 치료에서의 사용을 위한 약학적 및 피부과용 조성물에 관한 것이다.
모링가과(Moringaceae)는 동아프리카와 아시아 전역에 분포하는, 저자들에 따르면 12종에서 14종으로 구성되는 사하로-신디아 식물상의 일부(saharo-sindian flora)인 단일 속 과(단일 속, 모링가 아단스(Moringa Adans))를 구성한다. 속은 통상적으로 3개의 섹션으로 나뉘나, 계통발생학적 분석에 의해 단계통인 것으로 확인되지는 않았다. 후자는 특정 형태학적 특징을 지향하는 계통군(clade)을 강조했다: 파키콜(pachycauls)(병 나무), 구근성 관목 및 파키콜도 구근성 관목도 아닌 나무(가느다란 나무). 모링가 페레그리나(Forssk.) 종 Fiori는 세 번째 그룹에 속한다. 속 또는 과에 대한 소수의 유전적 연구는 이 속의 다른 종과 비교하여, 특히 인도 모링가(Indian Moringa), 모링가 올레이페라 람(Moringa oleifera Lam)과 비교하여 종의 실체를 확인한다. (특히, 논문: Olson, M. E., 2002, Combining Data from DNA Sequences and Morphology for a Phylogeny of Moringaceae (Brassicales), Systematic Botany 27(1): p. 55-73; Hassanein, A. M. A. et al., 2018, Morphological and genetic diversity of Moringa oleifera and Moringa peregrina genotypes, Horticulture, Environment and Biotechnology 59(2): p. 251-261 참조). 사우디아라비아의 여러 지역에서 샘플을 채취하고 ITS 마커를 사용한 모링가 페레그리나에 대한 최근 논문은 이 종이 안정적이라고 결론지었으나(Alaklabi, A., 2015, Genetic diversity of Moringa peregrina species in Saudi Arabia with ITS sequences, Saudi Journal of Biological Sciences 22: p. 186-190), 높은 수준의 개체군내 유전적 변이가 있었다.
모링가 페레그리나는 예멘, 오만, 및 사우디아라비아, 동아프리카, 수단, 에티오피아, 에리트레아, 소말리아, 및 지부티의 암석 환경에서 발견된다. 이란에서 모링가 페레그리나의 존재도(presence)는 남동부 지방에 한정된 것으로 보이나, 확인이 필요하다(PROTA14 = Munyanziza, E. et al. Vegetable oils/oilseed plants, Moringa peregrina (Forssk.) Fiori, http://database.prota.org/protahtml/moringa peregrina_fr.htm, 2019년 10월 23일 접속). 레반트 및 이집트에서, 주로 수단 지역의 일부에서 희귀한 퍼져있는 잔존(relic) 식물로서만 발견되는 종이다(일부 고지대 개체군 제외). 모링가 페레그리나는 또한 현재 수단과 예멘에서 희귀하고 멸종 위기에 처한 것으로 간주된다. 그의 계통군의 다른 종과 비교할 때, 모링가 페레그리나는 가장 건조하고 부적합한 서식지를 차지한다. 열대 및 아열대 지역에서 대규모로 상업적으로 재배되는 모링가 올레이페라(Moringa oleifera)보다 가뭄에 명확히 더 강하다. 최근 연구는 종자의 크기 및 중량이 어린 개체의 발아 시간과 성장률 및 성장 속도에 유리한 영향을 미칠 것이라는 것을 보여주어(Gomaa, N. H. et al., 2011, Seed germination, seedling traits, and seed bank of the tree Moringa peregrina (Moringaceae) in a hyper-arid environment, American Journal of Botany 98(6): p. 1024-1030), 종자의 개수보다 종자의 품질에 대한 자원의 할당의 조정을 나타냈고, 이는 모링가 페레그리나가 극단적인 비생물적 환경(과도한 건조 환경)에서 효과적으로 번식할 수 있게 한다. 모링가 페레그리나의 종자는 모링가 올레이페라의 종자보다 세포층의 측면에서 더 두꺼운 중앙 중간종피를 갖는다.
역사적으로 모링가 페레그리나 오일이 Al-Ula 지역에서 이슬람이 시작될 때 활발하게 거래되었다는 것을 나타내는 경향이 있는 일부 언급이 있었다(Naseef, A. A. S., 1995,　Al-' Ul
Figure 112022137672486-pct00001
, A study of Cultural and Social Heritage). 모링가 페레그리나로부터 생산된 오일은 현재 주로 국내 소비 또는 현지 시장을 목적으로 한다. 사우디아라비아에서는 전통적으로 잎을 당뇨병, 결장 질환, 눈 질환 및 빈혈을 치료하기 위해 내복용 탕제(decoction)(Abdel-Kader et al., A survey on the traditional plants used in Al Kobah village, Saudi Pharmaceutical Journal 26(6): p. 817-821) 및 이뇨제, 발적제 및 수렴제(Aqeel, A. A. M. et al., 1984, Plants used in Arabian Folk medicine, Report submitted to Saudi Arabian National Centre for Science and Technology, Riyadh, Saudi Arabia)로 사용했다. 오만에서는 여름이 끝날 때 여성이 추출한 모링가 페레그리나 오일을 편두통, 발열, 화상, 열상 및 골절, 변비 및 복통, 근육통 및 두피 건조에 사용한다(Ghazanfar, S. A., 1994, Handbook of Arabian Medicinal Plants, 1st edition, CRC Press, Boca Raton, Ann Harbor, USA; Ghazanfar, S.A., 1998, Plants of Economic Importance, chapter 15, in Ghazanfar, S.A. et al. (ed.) Vegetation of the Arabian Peninsula. Geobotany 25, p. 241-264, Kluwer Academic Publishers, table 11.1, p. 247 and 11.7 p. 251). 모링가 페레그리나 오일은 또한 향료 조성물(perfumed composition)에 사용되었고(Ghazanfar, S. A., 1998, p. 259), 오만과 예멘에서는 얼굴 로션으로 사용되었다(Ghazanfar, S. A. et al., 1996, Two multi-purpose seed oils from Oman. Plants for Food and Medicine. Paper presented at the joint meeting of the Society for Economic Botany and International Society for Ethnopharmacology, 1-7 July 1996, London).
일부 모링가 올레이페라 종자에서 유래한 추출물이 특히 화장품 분야에서 사용되는 것으로 알려져 있다. 피부과 분야에서 문헌 FR 2 776 519로부터, 혼탁한 물에 대한 정화 효과로 알려진 모링가 올레이페라 종자의 단백질 추출물이 피부 및 점막에 대한 완화제, 생리학적 컨디셔닝, 수화, 재생(restructuring), 복구, 및 오염 방지 효과를 갖는다는 것이 알려져 있다. 이 문서에서 활성 성분은 모링가 올레이페라 케이크로부터 수성 추출에 의해 수득된 6500 내지 8800 Da에 속하는 분자량을 갖는 단백질이다.
제약 분야에서, KR 2014 0143655로부터, 암을 치료 또는 예방하기 위해 모링가 올레이페라 잎의 수용성 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물이 알려져 있다. 모링가 올레이페라 잎 추출물의 효소 가수분해 방법이 분자량이 6000 내지 8000인 분자량을 갖는 단백질을 단리하기 위해 이용될 수 있다.
문헌 CN 107012190은 오일을 추출하고 마이크로웨이브 방사선을 사용하여 효소적 가수분해를 수행한 후 종자 단백질로부터 폴리펩티드를 수득하기 위해 모링가 올레이페라 종자를 사용하는 것에 관한 것이다. 수득된 산물은 경구로 사용되며 항암 활성에 유용한다. 실제로 분말 제형의 산물은 화학요법의 부작용을 감소시키고 간암 환자의 식욕을 높이거나 백혈구 지수 및 체온을 조절하는 작용이 있다고 기술된다.
마지막으로, 문헌 IN2009CH02906에서, 항당뇨 제품으로 사용될 수 있는, 양이온성 단백질과 조합된 글루코시놀레이트를 포함하는 모링가 올레이페라 케이크의 수성 추출물이 알려져 있다.
전술된 모든 문헌은 모링가 올레이페라 종의 용도에 관한 것이고, 그들 중 어느 것도 약학 또는 피부과 분야에서 모링가 페레그리나 종으로부터의 추출물의 용도를 기재하지 않는다.
또한, 10시간에 걸쳐 효소적 가수분해에 의해 생산된, 껍질을 벗긴 모링가 페레그리나 종자로부터의 가수분해물의 추출을 기술하는, Abu Tarbosh 등에 의한 문헌 XP055753092, 2005가 알려져 있다. 추출의 목적은 오일 및 물을 흡수하는 능력이 높은 제품을 얻는 것이다.
(1/1) 디클로로메탄/메탄올 혼합물을 사용하여 이집트 종자로부터 생산된 모링가 페레그리나 오일 추출물은 2.92, 9.40 및 9.48 ㎍/mn의 IC50 값으로 3개의 인간 암 세포주, MCF-7(유방 선암종), Hep-G2(간세포 암종) 및 HCT-116(결장 암종)에 대해 활성을 보였다(Abd el Baky et al., 2013, Characterization of Egyptian Moringa peregrina seed oil and its bioactivities, International Journal of Management Sciences and Business Research, 2(7): p. 98-108). 저자들은 또한 DPPH(2,2-디페닐 1-피크릴히드라질), ABTS(음이온 소거 능력 및 환원력) 및 항증식 분석을 통해 높은 항산화 활성을 입증했다. 추출물을 얻는 방법이 본 발명의 방법과 다르기 때문에, 수득된 분자는 매우 다른 극성을 갖는다.
Abou-Hashem 등(Abou-Hashem, M. M. M. et al., 2019, Induction of sub-G0 arrest and apoptosis by seed extract of Moringa peregrina (Forssk.) Fiori in cervical and prostate cancer cell lines, Journal of Integrative Medicine 17: p. 410-422)은 또한 자궁경부(HELA) 암 세포주 및 전립선(PC-3) 암 세포주에서 서브-G0(sub-G0) 정지 및 아폽토시스의 유도 활성을 입증했다. 프로토콜은 이집트산 모링가 페레그리나 종자를 분말화하고 95% 에탄올로 추출하고, 수용액에 용해시키는 것을 포함했고, 상기 수용액으로부터의 3개의 분획 추출물(석유 에테르(PE), CHCl3 및 EtOAc를 사용한 분획) 및 하이드로알코올 추출 잔류물을 연구했다. 활성은 전체 클로로포름 분획에 대해 입증되었고, 메커니즘에 대한 특정한 연구 없이, 포화 및 불포화 지방산과 폴리페놀에서 기인한 것으로 사료되었다. 상기 추출물을 수득하는 방법이 본 발명의 방법과 다르기 때문에, 수득되는 활성 분자는 매우 다른 극성을 가졌다.
전술을 고려하여, 본 발명이 극복하고자 하는 문제는 약학 또는 피부과 분야에서 이용될 수 있고, 사용하기 용이한 모링가 속 및 모링가(Moringaceae) 과로부터의 모링가 페레그리나 종의 추출물에 기초한 신규한 제품의 개발이다.
따라서, 본 출원인은 놀랍게도, 약물로서 그의 적용, 및 특히 섬유화 질환의 치료(푸린 전환효소(furin convertase)의 억제제로서), 염증의 치료, 암의 치료, 박테리아 또는 바이러스 타입의 감염성 질환의 치료, 및 피부 색소 침착과 관련된 병리 및 유전적 부동(genetic drift)의 치료를 위한, 모링가 페레그리나 종자 케이크로부터 수득된 특정한 단백질 가수분해물을 개발했다.
모링가 페레그리나 종은 매우 건조한 기후에서 자란다. 따라서, 그의 가뭄에 저항하고 극한 생물(extremophile) 조건에서 번식하는 능력은 본 출원인이 모링가 페레그리나 종자 케이크에 특정한 추출 방법을 수행하여 확인할 수 있었던 특정한 고유한 특징을 얻을 수 있게 했다. 본 발명에 따른 단백질 가수분해물은 약물로서의 특성을 갖는 것으로 나타났으며, 특히 푸린 전환효소 억제 활성이 매우 높은 것으로 입증되었다.
푸린 전환효소(이하 푸린(furin)이라 함)는 상이한 세포 유형에서 발현되는 794개의 아미노산을 갖는 타입 1 막관통 단백질이다. 푸린은 수많은 생물학적 과정에 관여하는 것으로 밝혀진 단백질이다(Braun E. et al., 2019, Furin-mediated protein processing in infectious diseases and cancer, Clinical & Translational Immunology https://doi.org/10.1002/cti2.1073). 푸린은 특히, 섬유증이 주요 조직 수복 메커니즘인 장애의 치료에서 또는 과도한 섬유증이 병리학적 붕괴 및 조직 기능 장애를 유발하는 경우, 섬유증의 조절 및 상처의 반흔 형성에 관여한다(이와 관련하여, 손상 치유 동안 반흔 형성을 감소시키고 섬유증 상태의 치료에서 섬유증을 감소시키기 위한 전환효소의 사용에 관한 문헌 WO 2004/09113 참조). 성인의 상처 반흔화는 복잡한 복구 과정이다. 상처는 조직이나 폐, 신장, 심장, 장, 힘줄 또는 간과 같은 내부 장기에 대한 손상, 부상 또는 외상을 포함할 수 있다. 조직에서 상처 치유 과정은 일반적으로 피부의 혈관 손상에 의해 유발되는 지혈 반응에 의해 시작된다. 이 과정 동안, 치유 과정 중에 형성되는 결합 조직은 종종 본질적으로 섬유질이며 일반적으로 결합 조직 흉터(섬유증으로 알려진 과정)로 형성된다. 따라서, 섬유증은 폐 섬유증, 신장 섬유증, 간 섬유증, 피부 섬유증, 안구 섬유증, 심장 섬유증 및 기타 다양한 섬유증 상태를 포함할 수 있다. 본 발명의 단백질 가수분해물은 또한 푸린에 의해 매개되는 다른 병리학적 상태, 예를 들어 고혈압, 암, 감염성 질환(세균성 및 바이러스성) 및 유전적 장애(예를 들어, 낭포성 섬유증(CF)) 및 신경퇴행성 질환(이와 관련하여, 신규한 푸린 전환효소 억제제 화합물 및 이를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이고, 억제제의 약학적 활성을 입증하는 다수의 간행물을 인용하는, 문서 WO 2019/215341 참조; 이러한 인용문헌은 참조에 의해 본원의 발명의 설명에 포함됨). 현재 설명은 참조로)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 병리학적 상태의 치료에 유용할 수 있다.
2018년 4월 10일자 프랑스 공화국 정부와 사우디아라비아 왕국 간의 정부 간 협정에 따라, 본원의 출원인, AFALULA(Agence Francaise Pour Le Developpement d'AlUla) [AlUla의 프랑스 기관] 및 RCU(Commission Royale pour AlUlA)(RCU) [AlUla의 왕립 위원회(Royal Commission)]는 특히 토착 식물로부터 유래된 천연 제품의 현지 생산을 통한, 책임 있는 농업 및 지역 경제 개발, 및 사우디아라비아 왕국의 알울라 지역의 생물다양성 및 법률 보호를 위한 공동 프로젝트를 시작했다. 사우디아라비아 왕국은 2020년 10월 8일부터 나고야 의정서에 가입했다. 본 특허를 작성하는 시점에, 나고야 의정서를 현지 법률의 관련 측면에 통합시킬 법칙이 고려 되고 있다. 결과적으로, 현 단계에서 사우디아라비아 왕국은 이 특허 출원 및 나고야 의정서와 관련하여 특별한 요구 사항이 없다. 따라서, 본 특허 출원의 출원일에, 유전 자원의 접근에 관한 의무준수 인증서에 대한 요건이 없다.
요약
제1 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 모링가 페레그리나 종자 케이크로부터 단백질 가수분해물을 수득하는 방법을 제공한다:
a) 익은 모링가 페레그리나 열매로부터 껍질을 벗기지 않은 성숙한 종자를 수집하고 내부 수분 함량(internal moisture content)이 8% 미만이 되도록 건조시키는 단계,
b) 상기 종자의 잔여물부터 오일을 분리하기 위한 방식으로 건조된 종자를 압착하여 6 중량% 미만의 잔류 오일을 포함하는 케이크를 수득하는 단계,
c) 단계 b)에서 수득된 케이크를 분쇄하는 단계,
d) 단계 c)에서 수득된 분쇄된 케이크를 수성 상에 분산시키는 단계,
e) 단계 d)에서 수득된 수성 분산액에 약 2시간 동안 13보다 높은 pH 및 16℃ 내지 25℃의 온도에서 화학적 단백질 가수분해를 수행하는 단계,
f) 상기 단백질 가수분해를 중화시켜, 수득된 단백질 가수분해물을 안정화시키는 단계,
g) 고체/액체 분리에 의해 단백질 가수분해물을 회수하는 단계,
h) 상기 단백질 가수분해물을 한외여과 및/또는 나노여과에 의해 정제하는 단계, 및 선택적으로,
i) 단계 h)에서 얻은 단백질 가수분해물을 동결건조하는 단계.
제2 양태에서, 본 발명은 익은 모링가 페레그리나 열매로부터 수확되고, 껍질을 벗기지 않은 종자 케이크로부터의 단백질 가수분해물로서, 상기 단백질 가수분해물은 분자량 P1이 1500 Da 내지 5000 Da에 포함되는 것인 아미노산 유도체, 아미노산, 펩티드, 및 글리코펩티드의 주요 분획, 분자량 P2가 10000 내지 17000 Da에 포함되는 것인 약 20%의 분획, 및 분자량 P3이 약 23000 Da인 것인 약 20%의 분획을 포함하고, 상기 단백질 가수분해물은 약 2시간 동안, 13보다 높은 pH에서 16℃ 내지 25℃에 포함된 온도에서 화학적 단백질 가수분해에 의해 수득되며, 상기 가수분해물은 액체이고 1 초과 바람직하게는 약 1.1의 밀도를 갖는 것을 특징으로 하는 단백질 가수분해물에 관한 것이다.
그의 특징 때문에, 본 발명에 따른 모링가 페레그리나 단백질 가수분해물은 모링가 속 및 모링가과에서 개시된 적이 없다. 모링가 페레그리나 종으로부터의 추출물은 그 속의 다른 종, 모링가 올레이페라 종과 다른 특정한 펩티드 프로필을 가지며, 본 출원인은 이를 입증할 수 있었다.
제3 양태에서, 본 발명은 약물로서의 적용을 위한 모링가 페레그리나 종자 케이크로부터의 단백질 가수분해물에 관한 것이다.
제4 양태에서, 본 발명은 활성제로서 유효량의 모링가 페레그리나 종자 케이크로부터의 단백질 가수분해물 및 생리학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 또는 피부과용 조성물에 관한 것이다.
마지막으로, 제5 양태에서, 본 발명은 섬유화 질환(fibrotic disease)의 치료, 염증, 암, 박테리아 또는 바이러스 타입의 감염성 질환의 치료, 및 피부 색소 침착(skin pigmentation)과 연관된 병리 및 유전적 부동의 치료에서 사용하기 위한 약학적 또는 피부과용 조성물에 관한 것이다.
본 설명에서, 달리 명시되지 않는 한, 범위가 주어진 경우, 범위는 상기 범위의 상한 및 하한을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서, 하기의 약어는 다음을 의미한다:
- MTT: 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(MTT 테스트는 살아있는 세포를 계수하는 신속한 방법임)
- SDS: 소디움 도데실 술페이트 (Sodium Dodecyl Sulfate)
- PBS: 인산 완충 염수 (Phosphate Buffer Saline)
- ELISA: 효소-결합 면역흡착 분석(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
- PCR: 중합효소연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction)
- ANOVA: 분산 분석 (Analysis of Variance)
- MSH: 멜라닌세포 자극 호르몬 (Melanocyte Stimulating Hormone)
본 발명에서:
- "주로 아미노산 유도체, 아미노산, 펩티드 및 글리코펩티드"는 건조 물질의 중량 기준 아미노산 유도체, 아미노산, 펩티드 및 글리코펩티드의 20% 초과, 보다 바람직하게는 30% 초과, 및 가능하게는 최대 약 40% (w/w) 건조 물질, 보다 바람직하게는 건조 물질의 중량 기준 50%를 의미한다.
- "유효량"은 원하는 결과를 수득하기 위해, 즉 원하는 치료 활성을 보장하기 위해 필요한 활성 분자의 양을 의미한다.
- "단백질 가수분해(proteolysis)"는 단백질을 화학적 가수분해에 의해 펩티드, 올리고펩티드 및 그의 기초 단편(아미노산) 및 그의 잔기로 분할하는 것을 의미한다.
- "국소 투여(local administration)"는 약물이 그의 작용 지점에 직접 적용되어 질병의 정확한 부위에 약리적 효과를 발휘한다는 사실을 의미한다. 국소 투여의 목적은 투여 부위로부터 활성 성분의 확산을 제한하여, 바람직하지 않은 효과를 최소화하는 것이다. 피부, 비강 및 호흡기 투여, 안구 투여, 귀 투여, 질 투여 및 협부(buccal) 투여가 이용되는 주요 국소 투여 방식이다.
- "국소 적용(topical application)"은 본 발명에 따른 활성 성분 또는 이를 함유하는 조성물을 피부, 점막 또는 손발톱 및 모발의 표면에 적용하거나 도포하는 것을 의미한다.
- 국소 사용의 맥락에서 "생리학적으로 허용되는(physiologically acceptable)"은 인간 피부와의 접촉을 의미하거나, 또는 다른 투여 방식의 맥락에서, 예를 들어 경구 투여 또는 피부 주사에 의한 경우, 독성, 비적합성(incompatibility), 불안정성, 또는 알레르기 반응의 위험이 없음을 의미한다.
- "케이크(cake)"는 압착 후 탈지된 종자를 의미한다. 종자로부터 오일을 추출한 후 남은 고체 잔류물이다. 오일 생산 공정인 분쇄(trituration)의 부산물(co-product)이다. 일반적으로 종자의 질량의 50% 내지 75%를 차지한다.
- "껍질을 벗기지 않은 종자(unshelled seed)"는 수확한 종자의 껍질(과피) 및 외피(coat)가 낟알 주위에 유지된다는 것을 의미한다.
- "열매가 익은(ripe) 경우"는 열매가 성숙하고, 바람직하게는 껍질이 벌어질 준비가 되고, 짙은 베이지 내지 갈색을 띠고 껍질의 아래쪽 1/4이 180°비틀리면(twist), 꼬투리 조각 개방(valve opening)이 유발된다는 것을 의미한다.
- "약 (approximately)"은 주어진 정보에 대해 ± 10% 내지 20%의 여유(margin)를 의미한다.
- "활성 분자의 풀(pool of active molecules)", "활성제(active agent)" 및 또한 "활성 성분(active principle)"은 모링가 페레그리나 종자 케이크에서 출발하여 본 발명의 방법에 따라 추출된 단백질 가수분해물을 의미한다. 이 가수분해물이 본 발명에 기술된 생물학적 활성을 초래한다.
- "활성제"는 설명된 생물학적 활성을 수득하기 위해 본 발명에 따른 추출물의 충분한 양을 의미한다. 추출물이 액체인지 건조 상태인지 또는 농축된 것인지 여부에 따라, 활성제의 양은 조성물의 총 중량에 대해 0.0001 중량% 내지 40 중량%의 비율 내에서 변할 수 있다.
제1 양태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 모링가 페레그리나 종자 케이크로부터 단백질 가수분해물을 수득하는 방법에 관한 것이다:
a) 익은 모링가 페레그리나 열매로부터 껍질을 벗기지 않은 성숙한 종자를 수집하고 건조시켜 8% 미만의 내부 수분 함량(internal moisture content)을 수득하는 단계,
b) 상기 종자의 잔여물부터 오일을 분리하기 위한 방식으로 건조된 종자를 압착하여 6 중량% 미만의 잔류 오일을 포함하는 케이크를 수득하는 단계,
c) 단계 b)에서 수득된 케이크를 분쇄하는 단계,
d) 단계 c)에서 수득된 분쇄된 케이크를 수성 상에 분산시키는 단계,
e) 단계 d)에서 수득된 수성 분산액에 약 2시간 동안 13보다 높은 pH 및 16℃ 내지 25℃의 온도에서 화학적 단백질 가수분해를 수행하는 단계,
f) 상기 단백질 가수분해를 중화시켜, 수득된 단백질 가수분해물을 안정화시키는 단계,
g) 고체/액체 분리에 의해 단백질 가수분해물을 회수하는 단계,
h) 상기 단백질 가수분해물을 100 내지 25000 Da에 속하는 컷오프 임계값으로 한외여과 및/또는 나노여과에 의해 정제하는 단계, 및 선택적으로,
i) 단계 h)에서 얻은 단백질 가수분해물을 동결건조하는 단계.
껍질을 벗기지 않은 종자를 수집하고, 즉, 열매가 익었을 때, 바람직하게는 겉껍질(hull)이 갈라지기 시작할 때 껍질을 유지시킨다.
종자를, 8% 미만, 바람직하게는 약 6%의 내부 수분 함량을 얻기 위해 건조시키고, 건조는 바람직하게는 태양 광선으로부터 보호되는 통풍이 잘 되는 선반에서, 바람직하게는 야외 그늘에서 수행될 것이다.
다음으로, 건조된 종자를, 압착된 종자의 나머지 부분, 즉 케이크로부터 오일을 기계적으로 분리하기 위해 이용될 수 있는, 저온 압착(cold pressing)으로 즉석 분쇄한다.
그 후, 케이크를 해머 밀(hammer mill), 도리깨 밀(flail mell), 나이프 밀, 파쇄/분쇄(crushing/shredding) 밀, 볼 밀 또는 비터(beater) 밀과 같은 임의의 타입의 기계 분쇄기, 및 동결분쇄기(cryomill)로 기계적으로 분쇄한다.
단계 d)에 따른 수성상을 형성하기 위한 분산 및 단계 e)에 따른 단백질 분해는 유리하게는 연속 교반을 이용하여 수행되어, 액체 중 고체의 분산 및 균질화를 가능하게 하여, 교환을 위한 전체 표면적을 개선하고, 결과적으로 단백질 분해를 향상시킨다.
1% 내지 6%의 질소 함유 화합물, 특히, 0.5% 내지 1.5%, 바람직하게는 약 0.8% 비율의 휘발성 니트릴 유도체 및 20 mg/리터의 폴리페놀(0.002%)을 포함하는, 10% 내지 15%, 바람직하게는 약 12.5%의 건조 물질 함량(dry matter content)을 포함하는, 밀도가 1 초과, 바람직하게는 약 1.1인 액체 단백질 가수분해물을 수득한다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 f)의 단백질분해 온도는 약 22℃이다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 g)의 고체/액체 분리는 원심분리, 배수(draining), 여과와 같은 상이한 방법을 사용하여 수행된다.
액체 모링가 페레그리나 단백질 가수분해물을 수득하는 방법의 일 구체예에서, 단백질 가수분해물을 추출되는 유기 물질, 특히, 추출되는 기타 유도체 대비 목적 화합물로 농축하기 위해 증류, 미세여과(microfiltration), 한외여과 및/또는 나노여과에 의해 단백질 가수분해물을 정제한다. 이러한 정제 단계는 언급된 다른 추출된 화합물 대비 목적 화합물의 풀을 농축하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 나노여과는 분자량이 10000 Da 미만인 밴드 P1, 분자량이 10,000 내지 17,000 Da에 속하는 것인 밴드 P2 및 분자량이 약 23,000 Da인 것인 밴드 P3을 포함하는 단백질 가수분해물의 3개의 밴드 또는 분획을 분리하기 위한 방식으로 수행된다.
또한, 단백질 가수분해물을 수득하는 방법에 의해 하기를 수득하기 위해 나노여과에 의해 3개의 밴드를 분리하는 것이 유리하다:
- 1500 Da 내지 5000 Da 사이에 포함된 컷오프 임계값, 바람직하게는 3000 Da 내지 4500 Da 사이에 포함된 컷오프 임계값으로 수행된 나노여과에 의한 밴드 P1.
- 10000 Da 내지 17000 Da 사이에 포함된 컷오프 임계값으로 수행된 나노여과에 의한 밴드 P2.
- 17000 Da 내지 25000 Da 사이에 포함된 컷오프 임계값으로 수행된 나노여과에 의한 밴드 P3.
본 발명에 따른 추출 방법의 또 다른 구체예에서, 수득된 액체 단백질 가수분해물은 10% 초과, 바람직하게는 20% 초과, 보다 바람직하게는 30% 초과 및 가능하게는 최대 약 40%(중량/중량)의 펩티드, 올리고펩티드, 글리코펩티드 및 아미노산 또는 이들의 휘발성 니트릴 유도체, 보다 바람직하게는 건조 물질의 50 중량%의 양을 포함하는 모링가 페레그리나 종자 케이크의 건조 가수분해물을 얻기 위한 방식으로 건조된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 수득된 모링가 페레그리나 종자 케이크로부터의 액체 단백질 가수분해물은, 예를 들어 모링가 페레그리나 종자의 고체 가수분해물을 얻기 위한 방식으로 분무화, 동결건조 또는 지오드레이션(zeodration)에 의해 건조되며, 물은 증발된다. 건조는 말토덱스트린, 시클로덱스트린 또는 이눌린과 같은 유기 지지체(organic support), 또는 필로실리케이트, 마그네슘 규산염 또는 탄산염 및 그의 염과 같은 무기 지지체의 존재 하에 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 추출 방법에 의해 수득된 모링가 페레그리나 종자 케이크로부터의 단백질 가수분해물에 관한 것이다.
제2 양태에서, 본 발명은 분자량이 1500 Da 내지 5000 Da에 속하는 것인 아미노산 유도체, 아미노산, 펩티드, 및 글리코펩티드의 주요 분획 P1, 분자량이 10000 내지 17000 Da에 속하는 것인 약 20%의 분획 P2, 및 분자량이 약 23000 Da인 것인 약 20%의 분획 P3을 포함하는, 껍질을 벗기지 않고, 익은 모링가 페레그리나 열매에서 수확한 종자 케이크로부터의 단백질 가수분해물로서, 상기 단백질 가수분해물은 약 2시간 동안 13 초과의 pH에서 16℃ 내지 25℃ 사이의 온도에서 약 2시간 동안 화학적 단백질 가수분해에 의해 수득되고, 상기 단백질 가수분해물은 액체이고 1 초과 및 바람직하게는 약 1.1의 밀도를 갖는 것인 단백질 가수분해물에 관한 것이다.
일 구체예에 따르면, 수득된 액체 단백질 가수분해물은 모링가 페레그리나 종자 케이크로부터 건조 물질의 중량 기준 20% 초과, 더 바람직하게는 30% 초과, 가능하게는 약 40% (중량/중량) 이하의 양의 올리고펩티드, 글리코펩티드 및 아미노산 또는 이들의 휘발성 니트릴 유도체의 건조 물질, 보다 바람직하게는 건조 물질의 50 중량% 이하의 양을 포함하는 건조 가수분해물을 수득하기 위한 방식으로 건조된다.
바람직한 구체예에 따르면, 상기 단백질 가수분해물은 또한 0.3% 내지 3%의 휘발성 화합물을 포함하며, 이들 화합물의 50%, 즉 본 발명에 따른 추출물의 0.15% 내지 1.5%는 경질 니트릴 화합물(light nitrile compound), 주로 이소부티로니트릴 및 메틸부탄니트릴을 포함한 화합물로 구성되고(constituted by); 이들 화합물의 5% 내지 10%, 즉 본 발명에 따른 추출물의 0.015% 내지 0.3%는 이소티오시아네이트 유도체, 주로 이소프로필 이소티오시아네이트 및 이소부틸 이소티오시아네이트로 구성되며; 이들 화합물의 1% 내지 5%, 즉 0.003% 내지 0.15%는 정유, 주로 유칼립톨, 멘톨 및 벤즈알데히드로 구성된다.
또 다른 구체예에 따르면, 상기 단백질 가수분해물은 1% 내지 6%의 질소 함유 화합물, 특히, 0.5% 내지 1.5%, 바람직하게는 약 0.8% 비율의 휘발성 니트릴 유도체 및 20 mg/리터의 폴리페놀을 포함하는, 10% 내지 15%, 바람직하게는 약 12.5%의 건조 물질 함량을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 선택되는 식물의 부분은 모링가 페레그리나 종자이다. 모링가 페레그리나 종자는 오일을 추출하기 위해 사용되는 것으로 알려져 있으며, 이는 가정용 소비 또는 다양한 전통 약재 치료제에 유용한다. 종자를 탈지한 후 수득된 케이크는 현재 특히 동물 사료에 사용되는 폐기물이다.
또 다른 구체예에 따르면, 상기 단백질 가수분해물은 분자량이 1500 Da 내지 5000 Da에 포함되는 것인 주요 분획 P1을 포함한다.
또 다른 구체예에 따르면, 상기 단백질 가수분해물은 분자량이 10000 Da 내지 17000 Da에 포함되는 것인 약 20%의 분획 P2를 포함한다.
또 다른 구체예에 따르면, 상기 단백질 가수분해물은 분자량이 약 23000 Da인 것인 약 20%의 분획 P3을 포함한다.
또 다른 구체예에 따르면, 상기 단백질 가수분해물은 분자량이 1500 Da 내지 5000 Da에 포함되는 것인 분획 P1 및 분자량이 10000 Da 내지 17000 Da에 포함되는 것인 분획 P2를 포함한다.
제3 양태에서, 본 발명은 약물로서의 적용을 위한 모링가 페레그리나 종자 케이크로부터의 단백질 가수분해물에 관한 것이다.
제4 양태에서, 본 발명은 활성제로서 유효량의 본 발명에 따른 모링가 페레그리나 종자 케이크로부터의 단백질 가수분해물 및 생리학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 또는 피부과용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 조성물이 복용되거나, 피부 또는 점막에 주사 또는 도포되는 여부에 따라, 일반적으로 사용되는 임의의 생약 제형일 수 있다.
제1 변형(variation)에 따르면, 다양한 조성물이 복용(ingestion)에 적합하고; 상기 조성물은 캡슐, 시럽, 과립 또는 정제의 제형일 수 있다. 상기 조성물은 어떠한 부형제도 포함할 필요가 없고, 그 전체가 건조 형태의 단백질 가수분해물을 포함하는 식물 추출물에 의해 구성될 수 있다.
제2 변형에 따르면, 다양한 조성물이 주사에 적합하고; 상기 조성물은 수성 또는 유성 로션의 형태, 또는 세럼의 제형일 수 있다.
제3 변형에 따르면, 다양한 조성물은 특히 국소 투여에 적합하여, 피부 또는 점막을 통해 장애의 정확한 부위에서 약리적 효과를 얻을 수 있게 한다.
본 발명에 따른 활성제의 투여에 이용되는 주요 국소 모드는 피부 및 경피 모드, 비강 및 호흡 모드, 안구 모드, 귀 모드(auricular mode) 및 질 모드이다. 미세 주사에 의한 피하 모드 및 점막을 통한 조성물의 투여를 위한 기타 모드, 특히 협부 모드가 고려될 수 있다.
약학적 용도를 위한 본 발명에 따른 조성물은 국소 경로를 통한 적용에 일반적으로 사용되는 임의의 생약 제형일 수 있다. 이들은 점막에, 특히 비강 또는 호흡기, 안구, 협부, 질 및 귀 투여에 의해 점막에 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 피부과용 조성물은 피부 적용을 위해 피부과 분야에서 일반적으로 사용되는 임의의 생약 제형일 수 있다. 이들은 경피적으로 투여되거나 피부에 국소적으로 도포될 수 있다.
본 발명에 따른 단백질 가수분해물을 포함하는 조성물은 국소 또는 피부 투여를 위한 이러한 타입의 제제에 일상적으로 사용되는 성분을 포함할 수 있다.
바람직한 구체예에 따르면, 다양한 조성물은 국소 투여에 적합하고, 크림, 수중유 및 유중수 에멀젼, 밀크, 연고, 로션, 오일, 밤(balm), 수성 또는 수성알코올 또는 글리콜 용액, 세럼, 파우더, 패치, 스프레이 또는 외부 적용을 위한 기타 제품, 예를 들어 압축 분사제(propellant under pressure)를 포함하는 의료 기기 또는 에어로졸 제품을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 다양한 조성물은 피하 주사 및 경피 투여에 적합하다; 상기 조성물은 수성 로션, 에멀젼의 제형, 또는 세럼의 제형일 수 있다. 경피 또는 패치 시스템에서, 활성 성분 또는 성분들의 방출은 일반적으로 접착성이고 피부와 직접 접촉하는 투과성 막에 의해 제어된다.
보다 구체적으로 국소 투여용으로 의도된 본 발명에 따른 조성물은 허용가능한 약학적 또는 피부과적 매질, 즉 피부 및 점막에 적합한 매질(medium)을 포함하고, 모든 적합한 생약 제형을 포함한다. 이러한 조성물은 특히 크림, 수중유 에멀젼 또는 유중수 또는 다중 에멀젼, 세럼, 용액, 현탁액, 겔, 밀크, 로션, 스틱, 에어로졸, 스프레이 또는 외부 적용을 위한 기타 제품, 예를 들어 가압 분사제를 포함하는 의료 기기 또는 에어로졸 제품, 또는 예를 들어 가압 분사제를 포함하는 의료 기기 또는 사실상 피부 및 점막에 적용하기에 적합한 임의의 형태의 파우더의 제형일 수 있다. 이러한 조성물은 용매, 연화제, 증점제, 희석제, 계면활성제, 항산화제, 생활성제(bioactive agent), 착색제, 방부제, 향료와 같은 그들의 제제에 필요한 부형제를 포함한다.
따라서 본 발명에 따른 조성물은 예상되는 적용 분야에서 일상적으로 사용되는 임의의 첨가제, 및 그들의 제제에 필요한 보조제, 예를 들면, 용매, 증점제, 희석제, 항산화제, 착색제, 자외선 차단제, 셀프-태닝제(self-tanning agent), 안료, 충전제, 방부제, 방향제, 탈취제, 피부과용 또는 약학적 활성제, 정유, 비타민, 필수 지방산, 계면활성제, 필름 형성 중합체 등을 포함한다.
모든 경우에, 당업자는 본 발명에 따른 조성물의 원하는 유리한 특성에 유해한 영향을 미치지 않도록 이러한 보조제 및 그들의 비율이 선택되도록 주의를 기울일 것이다.
본 발명의 조성물에서, 본 발명에 따른 단백질 가수분해물은 조성물의 총 중량에 대해 0.0001% 내지 40 중량% 범위의 양으로 사용된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 단백질 가수분해물은 조성물의 총 중량에 대해 0.001 내지 10 중량%, 보다 바람직하게는 조성물의 총 중량에 대해 0.01 내지 5 중량% 범위의 양으로 사용된다.
마지막으로, 제 5 양태에서, 본 발명은
- 활성제로서, 유효량의 상기 단백질 가수분해물의 분획 P1 또는 P2, 바람직하게는 분획 P1을 포함하는, 섬유화 질환 및 염증 치료용,
- 활성제로서, 유효량의 상기 단백질 가수분해물의 분획 P3을 포함하는, 암 치료용,
- 활성제로서, 유효량의 상기 단백질 가수분해물을 전체로 포함하는, 박테리아 또는 바이러스 타입의 감염성 질환의 치료, 특히 스파이크-COV2 단백질의 억제용,
- 활정제로서, 유효량의 단백질 가수분해물의 분획 P1 또는 P2, 바람직하게는 분획 P1을 포함하는, 피부 색소 침착과 연관된 병리 및 유전적 부동의 치료용 약물로서 사용하기 위한 약학적 또는 피부과용 조성물에 관한 것이다. 특히 용어 "유전적 부동"은 환경적 스트레스를 의미한다. 용어 "색소 침착과 연관된 병리"는 예를 들어 암종 및 흑색점을 의미한다.
섬유화 질환(fibrotic disease)의 치료에 대해, 용어 섬유증(fibrosis)은 폐 섬유증, 신장 섬유증, 간 섬유증, 피부 섬유증, 안구 섬유증, 심장 섬유증 및 기타 다양한 섬유화 상태를 의미하고, 기타 푸린-매개 병리학적 상태의 치료에 대해, 고혈압, 암, 바이러스성 및 세균성 질환을 포함한 감염성 질환, 유전적 장애(예를 들면, 낭포성 섬유증(CF)) 및 신경퇴행성 장애를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명이 여러 특정 구체예와 관련하여 설명되었으나, 본 발명은 어떤 방식으로도 이들에 한정되지 않으며, 기술된 수단의 임의의 기술적 균등물 및 본 발명의 범위 내에 속하는 한, 이들의 조합을 포함한다는 것이 명백하다.
동사 "구성하다(compose of)", "포함한다(comprise)" 또는 "함유한다(include)" 및 그의 복합 형태는 청구항에서 정의된 요소 또는 단계 이외의 요소 또는 단계의 존재를 배제하지 않는다.
본 발명은 첨부된 도면을 참조하여, 단지 비제한적인 예시로 주어진 본 발명의 여러 구체예의 하기 설명으로부터 더 잘 이해될 것이며, 그의 다른 목적, 세부사항, 특징 및 장점이 더욱 명백해질 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물의 SARS COV2((Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) 코로나바이러스 슈도비리온(pseudovirion)에 대한 항-감염 및 항바이러스(virostatic) 효과를 입증하는 SARS-COV2 코로나바이러스에 의한 감염 다이어그램을 나타낸다.
도 2는 페레그리나 오일의 추출물을 이용한 푸린(furin)에 대한 억제 다이어그램을 나타낸다. 이 도면에서 **는 "대조(control)"군과의 유의미한 차이를 의미한다(P＜0.001).
도 3은 페레그리나 케이크 추출물(96°에탄올)을 이용한 푸린에 대한 억제 다이어그램을 나타낸다. 이 도면에서 *는 "대조"군과의 유의미한 차이를 의미한다(P＜0.001).
도 4는 본 발명에 따른 페레그리나 케이크로부터의 단백질 가수분해물을 이용한 푸린에 대한 억제 다이아그램을 나타낸다. 이 그림에서 ***는 "대조"군과의 유의미한 차이를 의미한다(P＜0.001).
실시예
실시예 1: 모링가 페레그리나 케이크로부터 본 발명에 따른 식물성 단백질 가수분해물의 제조
모링가 페레그리나(Forssk.) Fiori의 종자를 8% 미만, 바람직하게는 약 6%의 내부 수분 함량을 수득하기 위해 건조시키고, 한편으로는 버진 오일(virgin oil)을 수득하고, 다른 한편으로부터 케이크를 수득하기 위해 오일을 종자의 나머지로부터 분리하기 위한 방식으로 무한 스크류 기계식 프레스(endless screw mechanical press)로 압착하였다. 그 후, 상기 케이크를 1 내지 2 cm 조각으로 미리 절단된 압출물의 형태로 단리하고, 그에 대해 추출을 수행하였다.
사용된 출발 물질은 다음과 같다.
재료 % 압착된 실제량
1 내지 2cm 조작으로 미리 절단된
페레그리나 케이크 		8.4% 33.6
수도물 (Mains water) 80.68% 322.7
수산화 나트륨 3.36% 13.5
시트르산 일수화물 F6000 7.14% 28.7
벤조산 나트륨 0.42% 1.7
100 400.2
프로토콜:
a) 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 수산화칼슘과 같은 강알칼리의 농축된 1몰 용액, 또는 1몰 농도의 강알칼리, 그러나 바람직하게는 수산화나트륨과의 수성 혼합물을 제조하였고; 이 강알칼리 용액은 13 내지 14의 pH를 가졌다.
b) 1cm 조각으로 미리 절단된 페레그리나 케이크 9.1%(중량/중량)를 약 90.9%(중량/중량)의 상기 알칼리 용액에 칭량하고,
c) 단계 b)에서 수득된 케이크를 분쇄하고,
d) 단계 c)에서 수득된 분쇄된 케이크를 수성 상에 분산시키고,
e) 단계 d)에서 수득된 수성 분산액에 2시간 동안 22℃의 온도에서 화학적 단백질 가수분해를 수행하고,
f) 수득된 단백질 가수분해물을 안정화하기 위해 단백질 분해를 중화시키고,
g) 상기 단백질 가수분해물을 1㎛ 필터를 통한 통과에 의한 고체/액체 분리에 의해 회수하고,
h) 상기 단백질 가수분해물을 한외여과로 정제하였다.
약 12.48%의 건조 물질을 함유하는 반투명한 황색 여액을 수득했다. 수득된 액체 추출물은 하기에서 "본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물" 또는 "페레그리나 단백질 가수분해물" 또는 "본 발명에 따른 추출물"로 기재된다.
1% 내지 6%의 질소 함유 화합물, 특히 0.5% 내지 1.5%, 바람직하게는 약 0.8% 비율의 휘발성 니트릴 유도체, 및 20mg/리터의 폴리페놀을 포함한, 10% 내지 15%, 바람직하게는 약 12.5%의 건조 물질을 포함하는, 이러한 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물은 1 초과, 바람직하게는 약 1.1의 밀도를 가졌다. 본 발명에 따른 건조 페레그리나 단백질 가수분해물의 조성은 하기와 같다.
RT CAS 번호 화합물 % DM
4.42. 64-17-5 에탄올 0.809
5.58 67-64-1 아세톤 0.444
6.10 75-15-0 이황화탄소 0.327
7.83 78-93-3 2-부타논 0.165
8.57 141-78-6 에틸 아세테이트 0.047
8.99 78-82-0 이소부티로니트릴 20.720
10.39 78-82-0 이소부티로니트릴 0.127
12.06 547-63-7 메틸 이소부티레이트 0.201
14.10 18936-17-9 2-메틸부탄니트릴 2.194
14.56 625-28-5 3-메틸부탄니트릴 27.495
18.77 66-25-1 헥산알 0.186
21.09 2253-73-8 이소프로필 이소티오시아네이트 4.590
23.65 628-73-9 헥산니트릴 0.198
24.43 110-43-0 2-헵타논 0.093
27.18 4426-79-3 2-부틸 이소티오시아네이트 1.058
27.59 80-56-8 알파-피넨 0.048
28.45 591-82-2 이소부틸 이소티오시아네이트 2.299
28.99 100-52-7 벤즈알데히드 1.753
29.77 108-95-2 페놀 0.413
30.80 13475-82-6 2,2,4,6,6-펜타메틸헵탄 0.318
32.80 99-87-6 파라-시멘 0.232
33.10 138-86-3 리모넨 0.133
33.34 470-82-6 유칼립톨 0.918
36.45 1195-32-0 파라-시메넨 0.035
36.88 124-19-6 노나날 0.080
40.26 65-85-0 벤조산 19.150
41.07 1490-04-6 멘톨 0.918
56.29 96-76-4 2,4-디-터트-부틸페놀 0.086
전체 85.035
페레그리나 단백질 가수분해물은 상대적으로 높은 수준의 이소프로필 이소티오시아네이트와 이소부틸 이소티오시아네이트를 함유하여, 이 종에 대한 이전 간행물을 확인한다(Kjaer, A. et al. 1979, Isothiocyanates in Myrosinase-treated seed extracts of Moringa peregrina, Phytochemistry, 18, p. 1485-1487; Afsharypuor, S. et al., 2010, Volatile Constituents of the Seed Kernel and Leaf of Moringa peregrina (Forssk.) Fiori, Agricolt. Cultivated in Chabahar (Iran), Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences 6(2): p. 141-144; Dehshahri, S. et al., 2012, Determination of volatile glucosinate degradation products in seed coat, stem and in vitro cultures of Moringa peregrina (Forssk.) Fiori, ScienceOpen, Research in Pharmaceutical Sciences 7(1): p. 51-56). 이소티오시아네이트는 십자화목(Brassicales order), 특히 십자화과(Brassicaceae), 풍접초과(Capparaceae), 파파야과(Caricaceae) 및 모링가 과(Moringaceae)에 속하는 다양한 식물에서 병원체의 공격에 대한 방어 시스템으로 생산되는 화합물이다. 모링가(Moringa) 속에서, 이들은 특히 모링가 올레이페라 램(M. oleifera Lam.) 및 모링가 스테노페탈라 큐폴드(M. stenopetala Cufold.) (Abd Rani, N.Z. et al., 2018, Moringa genus: A review of Phytochemistry and Pharmacology, Frontiers in Pharmacology, vol. 9, art. 108, p. 3-8)에서 확인되었다. 이소티오시아네이트는 식물 조직이 손상되었을 때 효소 미로시나아제(myrosinase)에 의한 글루코시놀레이트의 가수분해에서 유래한다. 이소티오시아네이트는 항진균 활성과 같은 다양한 생물학적 효과, 예를 들면, 항진균 활성(Troncoso-Rojas, R. et al., 2007, Natural compounds to control fungal diseases in fruits & vegetables, in Troncoso-Rojas, R., Tiznado-Hernandez, M. E., Gonzalez-Leon, A.　(ed) Recent advances in alternative postharvest technologies to control fungal diseases in fruits & vegetables. Transworld Research Network, Kerala, India, p. 127-156; Troncoso-Rojas, R. et al., 2005, Analysis of the isothiocyanates present in cabbage leaves extract and their potential application to control Alternaria rot in bell peppers, Food Research International 38, p. 701-708), 항미생물, 항암 및 항염증 효과(Park, E. J. et al., 2011, Inhibition of lipopolysaccharide induced cyclooxygenase-2 expression and inducible nitric oxide synthase by 4-[(2'-O-acetyl-α-L-rhamnosyloxy)benzyl]isothiocyanate from M. oleifera, Nutrition and Cancer 63(6), p. 971-982; Rajan T. S. et al., 2016, Anticancer activity of glucomoringin isothiocyanate in human malignant astrocytoma cells, Fitoterapa 110, p. 1-7; Padla, E. P. et al. 2012, Antimicrobial isothiocyanates from the seeds of Moringa oleifera Lam., Zeitschrift fur Naturforschung C, 67, p. 557-564; Waterman, C. et al., 2014, Stable, water extractable isothiocyanates from Moringa oleifera leaves attenuate inflammation in vitro. Phytochemistry 103, p. 114-122)를 갖는 것으로 보고되었다. 푸르푸랄(Furfural)은 이러한 타입의 종자 및 다수의 건조 열매에서 발견되는 매우 표준적인 농도로 존재한다. 이황화탄소, 이소부티로니트릴, 메틸 이소부티레이트, 메틸 부탄니트릴 및 헥산니트릴은 아미노산에서 수득된 휘발성 화합물이다. 그들은 단백질의 분해에 대한 마커이다. 이러한 분해 화합물이 페레그리나 단백질 가수분해물의 휘발성 화합물의 약 50%를 나타낸다. 이 결과는 가수분해물이 주로 단백질로 구성된다는 것을 암시한다. 페레그리나 단백질 가수분해물에서는 아주 적은 양의 지방이나 유리당만 검출되었다; 가수분해물은 주로 단백질과 당단백질로 구성된다. 건조 물질에서 시트르산 완충액(배당체(oside) 화합물)이 나머지의 약 50%를 나타내며, 단백질의 분해로부터 초래된 글리코실화 화합물(배당체 화합물), 단백질 가수분해(proteolysis)에 의한 올리고펩티드 및 아미노산을 포함한다. 마지막으로, 모링가 페레그리나의 종자에서 수득된 약 21 mg/리터의 폴리페놀(0.002%)의 존재에 주목해야 한다. 벤조산은 추출물에 첨가되는 안정화제이기 때문에, 특성화(characterization)에서 고려해서는 안 된다.
전술된 건조 추출물은 증발의 전 및 후에 액체 추출물에 존재하는 질량에 기초한 중량법(gravimetric method)에 의해 수득했다.
실시예 2: 푸린 전환효소(푸린으로 알려짐)에 대한 억제제로서의 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물의 효과
본 연구의 목적은 실시예 1에 따라 수득된 모링가 페레그리나 종자 케이크로부터의 단백질 가수분해물의 억제 활성을 평가하는 것이었다.
프로토콜: 이 연구는 특정한 형광 기준(reference) 기질의 절단을 촉매하는, 재조합 인간 푸린을 사용하여 수행하였다.
100nM 데카노일-Arg-Val-Lys-Arg-CMK를 푸린의 활성에 대한 기준 억제제(reference inhibitor)로 사용했다.
푸린은 기준 제품(reference product)의 부재(대조군) 또는 존재 또는 증가하는 농도의 테스트 화합물: "페레그리나 단백질 가수분해물"; 0.02; 0.2 및 2%(v/v)의 존재 하에 주위 온도에서 10분 동안 프리-인큐베이션시켰다(pre-incubated).
프리-인큐베이션 단계의 종료 시, 푸린 기질을 첨가하고, 실험 조건을 차광된 주위 온도에서 5분 동안 다시 한번 인큐베이션하였다. 모든 실험은 3배수로(in triplicates) 수행하였다.
화합물의 제조:
테스트 페레그리나 단백질 가수분해물을 직접 분석 완충액(assay buffer)에 용해시키고, 전술된 테스트 농도를 얻기 위해 희석했다.
평가 프로토콜
485 nm/535 nm에서 형광을 판독함으로써 기질 첨가 후 5분 동안 형광 푸린 기질의 절단을 모니터링하였다.
통계
결과는 RFU(relative fluorescent unit) +/- S.D.(표준 편차)로 표현된다.
"대조군(Control)" 및 "기준 제품"군 간에 관찰된 차이의 통계적 유의성은 스튜던트 t 검정(p＜0.001)에 의해 평가하였다. 　
"대조군" 또는 "기준(Reference)"과 "테스트 화합물" 간에 관찰된 차이의 통계적 유의성을 일원 분산 분석(ANOVA) 및 뒤이어 에 이어 홀름-시닥 검정(Holm-Sidak test)(p＜0.05)에 의해 평가했다.
100 nM에서 테스트한 데카노일-Arg-Val-Lys-Arg-CMK로 지칭된, 푸린에 대한 기준 억제제는 푸린의 활성을 유의하게 97.9% 억제했다(p＜0.001).
이 결과는 예상되었으며 연구를 검증했다.
얻은 기본(base) 활성 대비 푸린 효소의 활성에 대한 결과가 하기에 주어진다.
0.02%(v/v)의 "페레그리나 단백질 가수분해물" 124.9% (p＜0.001)
0.2%(v/v)의 "페레그리나 단백질 가수분해물" 73.2% (p＜0.001)
2.0%(v/v)의 "페레그리나 단백질 가수분해물" 1.2%(p＜0.001)
결론: 2% 농도에서, 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물은 푸린 전환효소 활성의 98.8%를 억제할 수 있다. 0.2% 이상의 농도에서, 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물은 푸린의 활성을 26.8% 억제할 수 있다.
실시예 3: 히스톤 데아세틸라제 ( HDAC ) 및 시르투인 I 효소를 억제하는 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물의 효과
본 연구의 목적은 DNA에 의해 운반되는 유전자에 대한 접근을 제공하거나 또는 막는, 염색질(chromatin)의 축합/탈축합 조절에 의한 유전적 부동의 제어에 관여하는 효소인 HDAC 및 시르투인(sirtuin) I 효소에 대한 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물의 억제 활성을 입증하는 것이다. HDAC 및 시르투인 I의 완충 용액을 37℃에서 20분 동안 기질과 반응시켜서, 37℃에서 10분 동안 인큐베이션한 후 현상액(developer)의 존재시 발색하는 화합물을 형성하도록 변화시킨다. 시르투인의 탈아세틸화에 대한 최대 활성은 405nm에서 흡광도를 측정하여 평가할 수 있다. 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물 또는 기준 제품 "트리코스타틴 A(STA) 억제제 1μM"을 효소의 기질과 동시에 시르투인 용액과 37℃에서 20분 동안 접촉시켰다; 상기 효소에 의해 변화된 기질을 현상액의 첨가에 의해 염색하였다. 활성 성분의 존재 하에 HDAC 및 시르투인 I의 탈아세틸화 활성을 405 nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다. 이 활성의 조절은 활성 성분의 부재시, 즉 HDAC 및 시르투인 I 효소에 대한 기질만 존재하는 경우 HDAC 및 시르투인 I의 최대 활성의 억제 또는 활성화 비율로 표현되었다.
프로토콜: 시르투인 효소의 용액을 기준 제품의 부재(대조군) 또는 존재 시 또는 테스트할 제품의 농도를 증가시키면서 기질에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물을 하기 농도에서 테스트하였다: 2%; 1%; 0.1%(V/V). 인큐베이션 기간의 종료 시, 테스트 제품 또는 기준 제품의 존재 및 부재시 시르투인 효소의 활성은 현상액 용액을 사용한 염색(37℃에서 10분)에 의해 보여주고 450 nm에서 반응 매질의 흡광도를 측정하여 평가하였다. 각각의 테스트 농도에 대해, 테스트 산물에 의한 히스톤 데아세틸라아제 및 시르투인 I 효소의 탈아세틸화 활성의 조절을 하기 식을 이용하여 계산하였다.
[Math. 1 ] 시르투인 효소 활성의 조절 백분율 = 100 x [(테스트 또는 기준에서 생성된 OD405) - (OD405 HDAC 및 시르투인 I 단독)]/OD405 시르투인 단독.
결과가 음성이면, 백분율은 효소 반응의 억제로 표현되고, 결과가 양성이면, 백분율은 효소 반응의 활성화로 표현된다. 히스톤 데아세틸라제 효소(HDAC)의 억제 결과가 하기에 주어진다.

본 발명에 따른
페레그리나 단백질 가수분해물 		백분율 대조군 대비 억제(%)
2% 15
1% NS
0.10% -18
결론: 2%에서, 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물은 HDAC의 현저한 억제를 나타내고; 이 억제는 유전적 부동에 대한 피부 세포의 자가 보호를 촉진하는 능력을 보여준다. 따라서 추출물은 피부 표면의 가장 일상적인 유전적 변이 중 하나, 즉 살의 "덩어리(lump)"의 모양(섬유성 돌기)으로 나타나는 섬유증에 대해 유용한 것으로 보인다. 상기 추출물은 피부 표면의 섬유증 현상을 유리하게 방해할 수 있다.
실시예 4: 엔도텔린 1(ET-1)의 작용을 억제하기 위한 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물의 효과
엔도텔린은 수용체를 통해 다양한 세포 및 조직에 작용할 수 있는 내피 세포에서 유래한 호르몬 펩티드이다. 예로서, 엔도텔린은 평활근 혈관 세포 및 기타 세포에서 칼슘의 세포내 농도를 증가시키는 것으로 알려져 있다(OHBA T. et al., WO 2012/081370).
최근년에 엔도텔린 타입 1(ET-1)은 직접 및 간접 작용에 의해 평활근 혈관 및 비혈관 근육 세포를 수축시키는 생활성 인자인 것으로 보고되었다. 엔도텔린의 작용 증가는 말초 부위, 신장, 뇌에서 혈관의 지속적인 혈관수축을 제공하여, 고혈압, 심근경색, 뇌혈질 장애(cerebrovascular accidents), 급성 신부전, 레이노 증후군, 죽상동맥경화증, 천식 및 전립선암과 같은 다양한 질환의 근원일 수 있다고 간주된다(Miyagawa K. & Emoto N. et al., 2014, Current state of endothelin receptor antagonism in hypertension and pulmonary hypertension, Therapeutic Advances in Cardiovascular Diseases, vol. 8(5) 202-216; Schinzari F. et al., 2018, Increased Endothelin-1-Mediated Vasoconstrictor Tone in Human Obesity: Effects of Gut Hormones, Physiological Research 67 suppl.1: S69-S81). 비슷한 구조를 가진 엔도텔린 패밀리의 세 가지 유형의 펩티드가 인간을 포함한 동물에 존재한다(Kadono, S. et al., 2001, The Role of the Epidermal Endothelin Cascade in the Hyperpigmentation Mechanism of Lentigo Senilis, Journal of Investigative Dermatology 116 4, p. 571-577; Anonymous, 2006, American Society for Biochemistry and Molecular Biology, New Cosmetics Handbook, p. 527-529). 이러한 모든 펩티드는 혈관 수축 효과와 혈관 수축 작용을 한다.
최근에, 평활근 세포 이외의 다양한 세포에서 엔도텔린의 역할이 규명되었다. 예를 들어, 과학 간행물에서는 피부가 UV 방사선에 노출될 때 각질 세포에서 ET-1 및 기타 인자들의 생성이 증가한다고 보고했으며 ET-1이 UV 방사선에 노출된 멜라닌 세포의 멜라닌 생성과 연관될 수 있다고 시사했다. 결과적으로, 엔도텔린의 발현 억제는 전술한 질병의 예방 및/또는 치료뿐만 아니라 피부의 색소 침착을 예방하거나 또는 개선하기 위해 유용한 것으로 간주된다 (Imokawa, G. et al., 1995, Endothelin-1 as a New Melanogen: Coordinated Expression of its Gene and the Tyrosinase Gene in UVB-Exposed Human Epidermis, Journal of Investigative Dermatology 1051, p. 32-37; Imokawa, G. et al., 1992, Endothelins Secreted from Keratinocytes are Intrinsic Mitogens for Human Melanocytes, Journal of Biological Chemistry, 267, p. 24675-24680; Gilchrest, B. et al., 1996, Mechanisms of Ultraviolet Light-Induced Pigmentation, Photochemistry and Photobioliogy 63, p. 1-10).
목적은 24시간 동안 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물에 노출된 후 인간 미세혈관 내피 세포에서 엔도텔린 타입 1을 분석하는 것이다.
프로토콜: 인간 미세혈관 내피 세포는 PELOBiotech에서 제공받았고 공급업체의 생산 절차에 따라 96-웰 플레이트에서 배양되었다. 이는 상기 추출물이 24시간 동안 80% 컨플루언스(confluence)에서 내피 세포에 다양한 농도로 작용하도록 허용하고, 그 후, ELISA PicoKine(EDN1) 키트의 도움으로 세포 상층액에서 엔도텔린 1을 정량화하는 것을 의미했다. 엔도텔린 1을 분석할 때 사용할 무독성 용량을 정의하기 위해 사전 생존력 테스트를 수행했다. 음성 대조군은 처리하지 않은 배양 배지 중 세포에 의해 형성되었다. 생존력 테스트에서 양성 대조군은 0.5% SDS였다. 모든 조건은 배양 배지에서 준비하고, 그 후, 세포를 36.5℃/5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다.
a) 테스트 용액의 내피 세포로의 적용:
테스트 제품을 96-웰 플레이트에서 서브-컨플루언스 (sub-confluence) 내피 세포와 접촉시켰다. 테스트는 각 농도별로 3개의 웰에서 수행하였다. 플레이트를 36.5℃/5% CO2에서 24시간 ± 1시간 동안 배양했다.
b) 생존력 테스트:
제품과 함께 인큐베이션한 후, 세포에 대해 MTT 방법을 이용하여 세포 생존력을 평가했다. 24시간의 인큐베이션 후, 상층액을 회수하고, 분석을 위해 -20℃에 보관하였다. 그런 다음, 웰을 200 ㎕의 PBS로 1회 세정하였다. 50 ㎕의 0.5 mg/mL MTT 용액을 각 웰에 첨가하였다: 인큐베이션을 36.5℃/5% CO2에서 3시간 동안 수행하였다. 100 ㎕의 이소프로판올을 각 웰에 첨가하였다. 균질화 후, 흡광도를 550 nm에서 기록하였다. 각 조건에 대해, 세포의 광학 밀도 평균 대 음성 대조군의 광학 밀도 평균의 비율이 생존력 비율(viability ratio)을 결정한다.
c) 엔도텔린 1 분석:
분석은 ELISA 키트의 도움으로 수행하였다. 엔도텔린의 작용의 억제 결과가 하기에 주어진다.

추출물 농도		 대조군 대비 세포 성장(%) 대조군 대비 엔도텔린 1 (%) 대조군 대비 엔도텔린(pg/mL)
본 발명의 단백질 가수분해물 2% +8.46 -34.90 -47.09
1% 1.54 -13.03 -17.58
0.10% -1.15 -2.44 -16.79
결론: 처리의 종료시 수행된 생존력 테스트는 테스트된 농도에 대해 어떠한 독성 효과를 보이지 않았다.
엔도텔린 1 분석은 무독성 농도에서 세포 상층액에 수행하였다. 각 조건에 대한 엔도텔린 1의 양은 ELISA 키트의 도움으로 분석하였다.
기본(base) 수준 대조군 세포의 경우, 값은 134.94 pg/mL 정도였다. 상이한 농도의 가수분해물로 처리된 세포의 경우, 기본 수준이 (본 발명에 따른 추출물 2%에 의해) 47.09 pg/mL 감소했고, (본 발명에 따른 추출물 1% 에 의해) 17.58pg/mL 감소했다. 이는 본 발명에 따른 추출물 1%로부터 엔도텔린 타입 1의 생성의 약 13% 억제 내지 본 발명에 따른 추출물 2%에 의한 최대 34.90% 억제로 매우 현저한 억제를 입증한다.
엔도텔린 및 그의 특이적 용량-의존적 억제에 대한 결과는 본 발명에 따른 단백질 가수분해물이 엔도텔린을 현저하게 감소시키는 능력 때문에 항혈관신생 및 항섬유증 효과를 갖는다는 것을 입증한다.
추출물 P1, P2, P3 및 실시예 12에 기재된 복합체 P1+P2의 평가를 위한 보완 연구가 엔도텔린 생산에 대해 하기에 기술된다: 정상 인간 내피 세포에 대한 세포 테스트 모델.
실시예 12에 기술된 바와 같이, 그들의 질량 P1(10000 Da 미만의 분자량), P2(10000 내지 17000 Da에 포함되는 분자량), 및 마지막으로 P3(약 23000 Da의 분자량)를 특징으로 하는, 3개의 밴드 또는 단백질 분획을 본 발명에 따른 가수분해물로부터 단리하였다. 이러한 분획은 이후 "추출물"로도 지칭된다.
기준 추출물 P1 (%, v/v)
0.1 0.3 1

엔도텔린-I
(pg/㎍ 단백질)		 33.8 29.0 44.0 38.3
36.7 34.2 41.5 31.7
39.7 30.1 38.1 33.9
평균 36.7 31.1* 41.2* 34.6*
표준 편차 3.0 2.7 2.9 3.3
기준 대비 % 100.0 84.6 112.1 94.2
*통계적 유의성(p＞0.05)
모든 농도에서, 표준 편차가 높았고 단백질 가수분해물의 분획 P1은 엔도텔린 타입 1에 대해 어떠한 유의한 조절도 보이지 않았다.
기준 추출물 P2 (%, v/v)
0.1 0.3 1

엔도텔린-I
(pg/㎍ 단백질)		 33.8 34.8 24.7 34.6
36.7 35.7 28.9 39.3
39.7 34.0 29.2 40.8
평균 36.7 34.9* 27.6** 38.3*
표준 편차 3.0 0.9 2.5 3.2
기준 대비 % 100.0 94.9 75.2 104.1
*통계적 유의성(p＞0.05)
**통계적 유의성(p＜0.05)
0.1%와 1%의 농도에서 표준 편차가 높았고, 단백질 가수분해물의 분획 P2는 이러한 농도에서 엔도텔린 타입 1에 대해 어떠한 유의한 조절도 보이지 않았다. 0.3%의 농도에서 P2는 엔도텔린 타입 1의 생성을 24.8% 억제한다.
기준 추출물 P1+P2 (50/50)(%, v/v)
0.1 0.3 1

엔도텔린-I
(pg/㎍ 단백질)		 33.8 39.4 42.0 34.5
36.7 29.7 34.2 34.7
39.7 42.2 38.3 37.9
평균 36.7 37.1* 38.1* 35.7*
표준 편차 3.0 6.6 3.9 1.9
기준 대비 % 100.0 100.9 103.8 97.2
*통계적 유의성(p＞0.05)
모든 농도에서, 표준편차가 높았고 분획물의 조합 P1 + P2는 엔도텔린 타입 1에 대해 어떠한 유의한 조절도 보이지 않았다.
기준 추출물 P3 (%, v/v)
0.1 0.3 1

엔도텔린-I
(pg/㎍ 단백질)		 33.8 36.2 19.5 18.8
36.7 38.9 14.8 20.4
39.7 31.5 18.2 17.6
평균 36.7 35.5* 17.5*** 18.9***
표준 편차 3.0 3.8 2.4 1.4
기준 대비 % 100.0 96.7 47.7 51.5
*통계적 유의성(p＞0.05)
***: 통계적 유의성(p＜0.001)
0.3% 및 1%의 농도에서, 단백질 가수분해물의 분획 P3은 엔도텔린 타입 1 생성의 약 50%를 매우 현저하게 억제한다.
결론: "추출물 P1" 및 "추출물 P2"로 지칭된 화합물은 엔도텔린 타입 1의 조절에 유의한 작용을 갖지 않으며, "추출물 P3"만이 본 발명에 따른 추출물의 0.3%에 의해 52.3% 억제의 점수로, 단일층 배양에서 정상 인간 내피 세포에 의해 배양 배지로 방출되는 엔도텔린-1을 유의하게 감소시켰다. P1과 P2를 병용했을 때, 상승적 효과는 관찰되지 않았다.
추출물 P3은 특히, 항암 효과를 보였다(Bagnato A. et al., 2011, Role of the endothelin axis and its antagonists in the treatment of cancer, British Journal of Pharmacology, 163: 220-233).
실시예 5: 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물의 줄기세포 보호 효과
피부 표피, 위장 상피 및 조혈계를 포함한 성체 조직은 매우 높은 수준의 세포 재생을 갖는다. 조직 항상성을 유지하는 생리학적 과정이 기관 재생에서 일정한 수의 세포를 유지하는 것에 기여한다. 배아 줄기 세포(ESC)는 피부 조직을 유지하고 재생하는 데 필수적이다.
표피는 배아 표면의 외배엽에서 발생한다. 표피는 신경형성 후 배아를 덮는 비특이적 전구 세포의 단일 층으로 출발하여 기저 표피층(basal epidermal layer)으로 발달한다. 기저 표피층은 ESC(표피 줄기 세포)가 풍부한다. 실제로, 이 층의 세포는 중층 표피(모낭간 표피(interfollicular epidermis)라고도 알려짐)와 모낭, 피지선 및 땀샘과 같은 표피 부속기관(epidermal appendices)을 포함한 모든 표피 구조를 생성한다. 바로 밑의 진피는 주로 외배엽 아래의 중배엽에서 유래한다. 중배엽은 콜라겐 생성 섬유모세포, 하부 지방세포 및 피부의 면역 세포를 생성하는, 중간엽 줄기 세포의 주요 공급원이다.
줄기 세포는 자가 재생이 가능하고 피부와 같은 기관이나 조직을 생성하기 위해 분화할 수 있는 젊은 유전자형을 가진 만능 세포로 알려진 미분화 세포이다. 이 단계에서 그들은 "다능 세포(multipotent cell)"로 식별된다. 줄기 세포 집단의 자손 중 50%가 미분화 상태로 남아 있다는 것을 고려할 때, 줄기 세포는 항상성을 유지하고 손상되거나 노화된 분화 세포의 재생을 보장하는 데 기여한다. 그러나, 이러한 표피 줄기 세포는 빈번하게 환경에 의해 영향을 받는다. Yejin Ge 등에 따르면, 오염이나 자외선과 같은 산화 스트레스가 그들의 DNA를 손상시킨다 (10 March 2020, The aging skin microenvironment dictates stem cell behavior, PNAS, Vol. 117, p. 5339-5350). 이 손상은 그들의 자가-재생 및 분화 능력을 변화시켜, 줄기 세포의 풀의 감소, 및 결국 피부의 노화로 이어진다.
본 연구의 목적은 UVB 조사에 대한 표피 줄기 세포의 보호에 대한 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물의 효과를 평가하는 것이다.
프로토콜: 인간 각질 세포는 62세 기증자로부터 얻었다. 실험을 수행하기 위해, 각질 세포를 80% 컨플루언스에 도달할 때까지 단일 층으로 배양하였다.
그 후, Goodell, M. 등에 의해 기술된 방법에 따라, 세포 배양에서 표피 줄기 세포를 농축(enrich)시켰다 (1996, Hoescht 33342 HSC staining and stem cell purification protocol, Journal of Experimental Medicine 183, p. 1797-806).
기준 제품(Reference product): 1μM 퀘르세틴을 이 연구에서 기준 제품으로 이용하였다. 퀘르세틴은 Sigma Aldrich에서 구입했다.
세포를 24시간 동안 기준 제품의 부재("대조군") 또는 존재 하에, 또는 테스트할 화합물의 농도를 증가시키면서 프리-인큐베이션했다. 프리-인큐베이션 기간의 종료 시에, 세포에 UVB (30mJ/cm2)를 조사한 다음 기준 제품의 부재(기준) 또는 존재 또는 테스트할 화합물의 농도를 증가시키면서 37℃에서 8일 동안 인큐베이션하였다.
"페레그리나 단백질 가수분해물": 0.01; 0.05 및 0.15%(v/v).
테스트 화합물의 제조:
테스트 화합물 "페레그리나 단백질 가수분해물"은 전술된 다양한 농도를 얻기 위해 인큐베이션 배지에 직접 희석시켰다.
인큐베이션 기간의 종료 시, 미토콘드리아에 의한 레자주린(rezazurin)의 환원에 기초한 비-세포독성 생존력 지표인 알라마르 블루(Alamar blue)를 사용하여 세포 생존력을 측정했다. 각 실험 조건은 3배수로 수행하였다(n=3).
결과는 "UVB 비조사 대조군" 실험 조건에 대한 생존력 비율로 하기에 제시된다(평균 +/- SD). "UVB 비조사 대조군"과 "UVB 조사 대조군" 간의 유의성의 수준을 스튜던트 검정에 의해 평가했다(p＜0.05).
가수분해물의 농도 대조군 대비 세포 성장(%) 대조군 대비 줄기 세포의 보호(%)
페레그리나 단백질 가수분해물 0.15% 약 -9.2 NS
0.05% -3.6 +30.50
0.01% 약 -6 +15.50
결론: 페레그리나 단백질 가수분해물은 세포 스트레스(UV)에 노출된 인간 피부의 줄기세포를 상당히 보호할 수 있다. 줄기 세포는 보존되고 어린 DNA 물질을 갖는 세포이다. 그들은 조직 재생, 및 젊고 건강한 상태로의 복귀의 근원이다. 줄기 세포의 보호는 DNA 물질을 보존하는 능력과 상관된다. 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물은 줄기 세포의 완전성(integrity)을 유지하고; 따라서 DNA 전환(DNA conversion)에 관련된다.
실시예 6: DNA 보존에 대한 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물의 효과
텔로미어 길이의 역학은, 특히 수명이 긴 종에서, 세포의 복제 수명을 조절하는 데 매우 중요한다. 텔로미어의 단축과 텔로머라아제의 활성은 노화와 종양 형성에 중요한 요소이다(Shay, J. W. & Wright, W. E., 2005, Senescence and Immortalization: Role of Telomeres and Telomerase, Carcinogenesis 26(5), p. 867-874). 텔로미어는 분해, 원치 않는 융합-재조합, DNA 손상에 대한 반응의 부적절한 활성화를 위한 염색체의 말단을 커버하는 복잡한 뉴클레오티드 서열이다. 그들은 또한 세포 분열과 염색체의 안정성에 필수적인 역할을 한다. 텔로미어의 안정성과 평균 길이가 스트레스, 특히 환경 스트레스나 환경 영향을 받는 질병에 의해 영향을 받을 수 있다는 점점 더 많은 증거가 존재한다(Valdes, A.L. et al., July 2005, Obesity, cigarette smoking and telomere length in women, Research Letters.366(9486), p. 662-664; Phillips A.C. et al., 2013, Do symptoms of depression predict telomere length? Evidence from the West of Scotland Twenty-07 Study, Psychosomatic Medicine, 75(3), p. 288-296; Shin, D. et al. May 2019, Effects of inflammation and depression on telomere length in young adults in the United States, Journal of Clinical Med 2019, 8(5), p. 711; Saliques, S. et al., October 2010, Telomer length and cardiovascular disease, Archives of Cardiovascular Diseases, 103(8-9), p. 454-459). 따라서 극도로 짧은 텔로미어는 신경퇴행성 질환, 심혈관 질환(CVD) 및 암 위험과 연관되었다.
텔로머라아제는 텔로미어의 말단에 텔로미어 반복 서열(telomeric repeat)의 부가를 촉매하는 리보핵단백질이다. 텔로미어는 염색체의 말단을 캡핑하는 반복된 서열의 긴 섹션이며, 염색체를 안정화시키는 것으로 알려져 있다. 인간에서, 텔로미어는 일반적으로 길이가 7 내지 10 kb이며 서열 -TTAGGG-의 여러 반복을 포함한다.
텔로머라아제는 대부분의 성인 세포에서 발현되지 않으며 텔로미어의 길이는 연속적인 복제 주기에 따라 감소한다. 일정한 수의 복제 주기 후에, 텔로미어의 점진적인 단축으로 인해 세포는 텔로미어 위기(telomeric crisis) 단계에 들어가게 되며, 이는 차례로 세포 노화로 이어진다. 일부 질병은 텔로미어의 급속한 소실과 관련되어 조기 세포 노화를 유발한다. 인간 세포에서 인간 텔로머라아제 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 아마도 세포의 자연 노화로의 경로를 역전시켜, 일정한 품질의 표현형을 생성한다는 것이 확인되었다(Blasco M., 2007, Telomere Length, Stem Cells and Aging, Nature Chemical Biology, 3(10), p. 640-649). 또한, 앞서 인용된 연구에서 짧은 텔로미어를 가진 노화 세포에서 텔로머라아제 유전자의 발현이 텔로미어의 길이를 증가시키고 일반적으로 더 젊은 세포와 연관된 표현형을 복원한다는 것이 입증되었다.
본 연구의 목적은 단층 배양에서 정상 인간 섬유모세포로 구성된 모델에서 텔로미어 단축에 대한 "페레그리나 단백질 가수분해물"로 지칭되는 화합물의 효과를 평가하는 것이다. 텔로미어가 생물학적 시계에 해당한다는 것이 잘 알려져 있다. 텔로미어의 길이는 세포 분열에 따라 점진적으로 감소하여 결국에는 복제가 불가능한 세포를 초래한다. 텔로미어의 길이의 측정은 정량적 PCR을 이용하여 수행하고, 계대(pass) 2 및 5에서 세포간 텔로미어의 길이와 비교하였다.
프로토콜: 인간 섬유모세포 세포는 44세 기증자로부터 얻었다. 실험을 수행하기 위해, 계대 2 및 5에서 세포를 이용하였다. 섬유모세포는 페레그리나 단백질 가수분해물의 부재(대조군) 또는 증가하는 테스트 농도: 0.01%; 0.1% 및 0.5%(v/v)의 존재 하에 3개의 연속 계대 동안 배양하였다.
테스트 화합물의 제조: "페레그리나 단백질 가수분해물" 테스트 화합물을 전술된 다양한 농도를 얻기 위해 배양 배지에서 직접 희석하였다.
인큐베이션 종료 시, 세포를 트립신 처리하였다. 전용 DNA 추출 키트를 사용하여 세포에서 DNA를 추출했다. DNA를 나노드랍(nanodrop)으로 정량하였다.
텔로미어 길이는 정량적 PCR(q-PCR)로 측정하였다. 각 시료에 대해, SCR(single copy reference) 유전자를 기준 유전자로 이용하여 상대적 정량화로 텔로미어 길이의 변화를 측정하였다. 각 시료에 대해, 텔로미어 서열을 인식하고 증폭하는 텔로미어 프라이머의 세트를 사용하여 q-PCR을 수행하고, 데이터의 표준화를 위한 기준으로 작용하는, 인간의 17번 염색체에 있는 100 bp 영역을 인식하고 증폭하는 SCR 프라이머의 세트를 사용하여 제2 q-PCR을 수행했다.
결과는 계대 2의 세포에 대한 텔로미어의 길이에 해당하는 상대적 단위로 표현된다(평균 ± SD). 계대 2 및 5에서 "대조군" 대비 유의성의 수준은 스튜던트 검정에 의해 평가하였다(*: p ＜0.05). "대조군"과 "테스트 화합물" 간의 유의성의 수준은 단일 인자 분산 분석(일원 ANOVA) 및 뒤이은 홀름-시닥 검정에 의해 각 산물에 대해 독립적으로 평가하였다(*: p ＜0.05).

농도
대조군 대비 세포 성장 (%)
대조군 대비 텔로미어의 길이(%)
페레그리나 단백질 가수분해물 0.5% +1.9 +16.60
0.1% ca. 0 +15.10
0.05% -0.6 +8.90
결과: 본 발명자들의 실험 조건 하에서, 0.05%, 0.1% 및 0.5%(v/v)에서 테스트된 페레그리나 단백질 가수분해물은 정상 인간 섬유모세포 텔로미어의 단축을 상당히 감소시켰다.
텔로미어의 단축은 0.05%(v/v)에서 +8.9%(p＜0.05); 0.1%(v/v)에서 +15.1%(p＜0.01); 및 0.5%(v/v)에서 +16.6%(p＜0.01)의 (대조군 대비) 억제를 보였다.
결론: 인간 세포의 정상적인 증식 또는 분열의 상황에서, 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물은 텔로미어의 길이를 상당히 증가시키는 능력을 보인다. 텔로미어는 DNA 물질 보호와 관련된 플러그(plug)이고, 텔로미어 길이의 증가는 DNA 물질을 보존하는 능력과 상관관계가 있다. 페레그리나 단백질 가수분해물은 텔로미어의 길이를 증가시킬 수 있다. 따라서, 이 가수분해물은 인간 유전 물질(DNA)의 보존에 관련된다.
추출물 P1, P2, P3 및 실시예 12에 기재된 복합체 P1+P2의 여러 세포 분열 후 텔로미어의 길이를 증가시켜 DNA를 보호하는 능력에 대한 평가의 보완적 연구.
계대 2 계대 5

기준
기준		 추출물 P1 (%; v/v)
0.01% 0.3% 1%
텔로미어 길이의 변화
(계대 1 대비 크기의 변화)		 1.08 0.56 0.57 0.65 0.74
0.86 0.58 0.61 0.64 0.77
1.07 0.54 0.62 0.71 0.70
평균 1.00 0.56 0.60* 0.67** 0.74***

표준 편차
0.12
0.02
0.03
0.04
0.04
텔로미어 길이
(기준 대비 %)
100.0
55.8
59.8
66.6
73.3
기준 대비 텔로미어의 신장 %
0
9.1
24.3
39.6
*통계적 유의성(p＞0.05)
**: 통계적 유의성(p＜0.01)
***: 통계적 유의성(p＜0.001)
0.3% 농도에서 3회 세포 분열 후, 본 발명에 따른 추출물 P1은 정상 인간 세포 배양 모델(섬유모세포)에서 텔로미어의 크기를 24.3% 증가시켰다. 1% 농도에서, 동일한 조건에서 추출물 P1은 텔로미어 크기를 39.6% 증가시켰다.
계대 2 계대 5

기준
기준		 추출물 P2 (%; v/v)
0.01% 0.3% 1%
텔로미어 길이의 변화
(계대 1 대비 크기의 변화)		 1.08 0.56 0.53 0.61 0.66
0.86 0.58 0.70 0.71 0.68
1.07 0.54 0.74 0.68 0.92
평균 1.00 0.56 0.66* 0.67* 0.75*
표준 편차 0.12 0.02 0.11 0.05 0.14
텔로미어 길이 (기준 대비 %)
100.0
55.8
65.3
66.3
75.0
기준 대비 텔로미어의 신장 %
0
21.4
23.7
43.5
*통계적 유의성(p＞0.05)
정상 인간 세포 배양 모델(섬유모세포)에서 3회 세포 분열 후, 본 발명에 따른 추출물 P2는 각 테스트 농도에 대해 텔로미어의 신장(elongation)에 대해 통계적으로 확인되지 않은 경향을 가졌다.
계대 2 계대 5

기준
기준		 추출물 P3 (%; v/v)
0.01% 0.3% 1%
텔로미어 길이의 변화
(계대 1 대비 크기의 변화)		 1.08 0.56 0.51 0.46 0.50
0.86 0.58 0.52 0.54 0.55
1.07 0.54 0.64 0.61 0.61
평균 1.00 0.56 0.56* 0.54* 0.55*
표준 편차 0.12 0.02 0.07 0.07 0.06
텔로미어 길이 (기준 대비 %)
100.0
55.8
55.4
53.6
55.2
기준 대비 텔로미어의 신장 %
0
-0.8
-5.0
-1.3
*통계적 유의성(p＞0.05)
정상 인간 세포 배양 모델(섬유모세포)에서 3번의 세포 분열 후, 본 발명에 따른 추출물 P3는 각 테스트 농도에 대해 텔로미어의 신장을 촉진하는 능력이 없었다.
계대 2 계대 5

기준
기준		 추출물 P1+P2 (%; v/v)
0.01% 0.3% 1%
텔로미어 길이의 변화
(계대 1 대비 크기의 변화)		 1.08 0.56 0.61 0.72 0.76
0.86 0.58 0.84 0.67 0.71
1.07 0.54 0.63 0.74 0.86
평균 1.00 0.56** 0.70* 0.71* 0.78**
표준 편차 0.12 0.02 0.13 0.04 0.08
텔로미어 길이 (기준 대비 %)
100.0
55.8
69.3
70.5
77.5
기준 대비 텔로미어의 신장 %
0
30.5
33.3
49.1
*통계적 유의성(p＞0.05)
**: 통계적 유의성(p＜0.01)
1% 농도(즉, 각 추출물에 대해 0.5%)에서 3회의 세포 분열 후, 본 발명에 따른 추출물 P1 및 P2의 혼합물(부피 기준 50/50)은 정상 인간 세포 배양 모델(섬유모세포)에서 텔로미어의 크기를 49.1% 증가시켰다. 이 점수는 개별 추출물에 의해 도달되지 않았고, 따라서, 추출물 P1과 P2를 혼합하여 상승적 효과가 입증되었다.
결론: "추출물 P1" 및 "추출물 P1 + P2"로 지칭된 화합물은 3회 연속 세포 계대(pass) 후에 발생하는, 텔로미어의 단축을 상당히 감소시킨다. P1과 P2의 조합에 의한 상승적 효과가 확인된다.
실시예 7: 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물의 ZAG 단백질 자극 효과
ZAG(Zinc alpha-2-glycoprotein)은 전기영동 이동성(electrophoretic mobility) 및 Zn 염에 의해 침전되는 능력에서 그 이름을 얻은 혈장 당단백질이다. ZAG는 면역글로불린 유전자의 수퍼패밀리의 일부를 형성하고 CMH 클래스 I 및 II 분자와 고도로 상동인 3차원 구조를 갖는다. ZAG는 유방, 전립선 및 간의 정상 분비 상피 세포, 타액선, 기관지, 위장 및 땀샘 및 표피를 포함한 정상 중층 상피에서 면역조직화학적으로 검출되었다. ZAG의 mRNA는 다양한 타입의 세포에 균일하게 분포되어 있다(Freije, J. P. et al., 1991, Human Zn-α2-Glycoprotein cDNA Cloning and Expression Analysis in Benign and Malignant Breast Tissues, FEBS Letters 290 (1-2), p. 247-249). ZAG는 분비 상피에서 생성되기 때문에, 대부분의 체액 분비물에 존재하며, 각각 타액 단백질의 2.5%, 정액의 30%를 구성한다. 혈장과 혈청 내 ZAG의 수준은 연령에 따라 달라지며, 보고된 값의 범위는 0.9 내지 3.5mg/dl(태아)부터 7.8 내지 12.1mg/dl(젊은 성인)까지인 것으로 보고되었다(Jirka, M. et al., 1974, The Zn-alpha 2-Glycoprotein Level in Human Serum During Ontogenesis. Clinica Chimica Acta 56, p. 31-33; Jirka, M. et al., 1978, Human Serum Zn-α2-Glycoprotein in Amniotic Fluid, Clinica Chimica Acta 85, p. 107-110). ZAG는 최대 30 내지 50배의 혈장 농도까지 유방 낭종액에 축적되고(Bundred et al., 1987, An Immunohistochemical Study of the Tissue Distribution of the Breast Cyst Fluid Protein, Zinc Alpha2-Glycoprotein, Histopathology 11, p. 603-610; Diez-Itza, I. et al., 1993, Zn-α2-Glycoprotein Levels in Breast Cancer Cytosols and Correlation with Clinical, Histological, and Biochemical Parameters, European Journal of Cancer 29A, p. 1256-1260), 유방 암종의 40% 내지 50%에서 과발현된다. 최근에 ZAG는 대부분의 전립선 암종에 의해 대량으로 생산되고, 기저세포 암종(basocellular carcinoma)에서 전립선암 환자에서 ZAG의 혈청 수준 상승을 유발한다는 것이 입증되었다(Susan, M. el al., Zinc-alpha2-glycoprotein Expression as a Predictor of Metastatic Prostate Cancer Following Radical Prostatectomy, 2006, Journal of the National Cancer Institute, Volume 98(19), p. 1420-1424). 이 연구의 목적은 페레그리나 단백질 가수분해물의 ZAG 자극 능력을 평가하는 것이다.
프로토콜: 정상 인간 각질 세포를 포피로부터 단리하고 내부 절차에 따라 24 및 96웰 플레이트에서 배양하였다.
이는 정의된 농도에서 시료가 48시간 동안 80% 컨플루언스에서 각질 세포에 작용하도록 두고, 그 후, ELISA 키트의 도움으로 세포 상층액 중 ZAG를 정량화하는 것을 포함했다.
ZAG를 분석할 때 사용할 무독성 용량을 정의하기 위해 사전 생존력 테스트를 수행했다. 음성 대조군은 처리 없이 배양된 세포를 이용하여 생성하였다. 생존력 테스트를 위한 양성 대조군은 0.5% SDS였다.
모든 조건은 배양 배지에서 준비하고, 생존력 테스트를 위해 세포를 36.5℃/5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하고, ZAG 분석을 위해 48시간 동안 인큐베이션했다.
Figure 112022137672486-pct00002
각질 세포로의 테스트 용액의 적용:
- 테스트 제품을 24 및 96 웰 플레이트에서 서브-컨플루언스 상태에 있는 각질 세포와 접촉시켰다.
- 각 농도에 대해, 3개의 웰에서 테스트를 수행했다.
- 플레이트를 36.5℃/5% CO2에서 24시간 및 48시간 동안 인큐베이션하였다.
생존력 테스트:
- 세포 생존력은 제품과 함께 인큐베이션한 후 세포에 대해 MTT 방법을 사용하여 평가하였다.
- 24시간 및 48시간 인큐베이션 후, 제공된 웰을 200㎕의 PBS로 1회 세정하였다.
- 0.5 mg/mL의 MTT 용액 50 ㎕를 각 웰에 첨가했다: 인큐베이션은 36.5℃/5% CO2에서 3시간 동안 수행했다.
- 100 ㎕의 이소프로판올을 각 웰에 첨가하였다.
- 균질화 후, 흡광도를 550 nm에서 기록하였다.
- 각 조건에 대해 세포의 광학 밀도 평균 대 음성 대조군의 광학 밀도 평균의 비율이 생존력 비율을 결정한다.
ZAG 단백질 분석:
- 48시간 인큐베이션 후, 모든 상층액을 회수하고, 분석을 위해 -20℃에 보관했다.
- 분석은 ELISA 키트를 이용하여 수행하였다. 결과가 하기에 주어진다.
농도 대조군 대비 세포 성장 (%) 대조군 대비 ZAG (%) 대조군 대비 ZAG (ng/mL)
페레그리나 단백질 가수분해물 2% -17.88 +337.80 0.390
1% -12.54 +195.73 0.157
0.10% -3.88 +151.83 0.085
결론: 페레그리나 단백질 가수분해물은 ZAG의 생산을 상당히 증가시킬 수 있으며, 우수한 용량 의존성 및 인간 세포에 대한 낮은 독성을 갖는다. 이러한 이유로, 페레그리나 단백질 가수분해물은 ZAG를 현저하게 증가시키는 능력에 기초하여, 항-섬유화 효과 및 항-염증 효과를 갖는다.
실시예 12에서 확인된 단백질 밴드로부터 출발한 ZAG의 자극에 대한 보완적 연구가 정상 인간 각질 세포에 대해 하기에 기술된다.
기준 추출물 P1 (%, v/v)
0.2 1 5

ZAG
(pg/㎍ 단백질)		 2.8 4.1 4.3 2.3
3.0 6.0 3.9 1.1
2.0 6.1 3.4 2.4
평균 2.6 5.4** 3.9* 1.9*
표준 편차 0.5 1.1 0.5 0.7
기준 대비 % 100.0 207.1 147.3 73.5
*통계적 유의성(p＞0.05)
**: 통계적 유의성(p＜0.01)
0.2%에서, 추출물 P1은 ZAG 생산을 107% 이상 크게 증가시켰다.
기준 추출물 P2 (%, v/v)
0.2 1 5

ZAG
(pg/㎍ 단백질)		 2.8 6.2 4.3 2.6
3.0 4.2 4.4 2.7
2.0 3.7 4.5 2.3
평균 2.6 4.7** 4.4** 2.5*
표준 편차 0.5 1.4 0.1 0.2
기준 대비 % 100.0 180.1 167.5 95.6
*통계적 유의성(p＞0.05)
**: 통계적 유의성(p＜0.05)
0.2%에서, 추출물 P2는 ZAG의 생산을 80% 이상 크게 증가시켰다.
기준 추출물 P3 (%, v/v)
0.2 1 5

ZAG
(pg/㎍ 단백질)		 2.8 2.1 2.3 2.3
3.0 1.9 2.7 1.8
2.0 2.2 2.1 3.3
평균 2.6 2.1* 2.4* 2.5*
표준 편차 0.5 0.2 0.3 0.8
기준 대비 % 100.0 78.5 90.0 95.2
*통계적 유의성(p＞0.05)
추출물 P3는 이 연구 모델에서 ZAG의 생산에 유의하게 영향을 미칠 수 있는 능력이 없었다.
기준 추출물 P1+P2 (50/50) (%, v/v)
0.2 1 5

ZAG
(pg/㎍ 단백질)		 2.8 3.9 4.2 1.7
3.0 3.7 3.5 2.6
2.0 3.5 2.8 2.6
평균 2.6 3.7* 3.5* 2.3*
표준 편차 0.5 0.2 0.7 0.5
기준 대비 % 100.0 140.6 132.9 87.8
*통계적 유의성(p＞0.05)
추출물 P1과 P2의 조합은 ZAG의 생산을 활성화시키는 경향을 나타냈으나, 이러한 경향은 통계적 관점에서 유의하지 않았다. 따라서, 추출물 P1과 P2의 조합에서는 상승적 효과가 없었다.
"추출물 P1" 및 "추출물 P2"로 지칭된 화합물은 단층 배양에서 정상 인간 각질 세포에 의해 배양 배지로 방출된 ZAG를 상당히 증가시켰으나, P1 및 P2를 조합할 때 상승적 효과는 관찰되지 않았다.
결론: 본 발명에 따른 가수분해 추출물에서, 추출물 P1은 ZAG를 증가시키는데 가장 적합한 추출물이다. 이러한 이유로, 이는 0.2%의 용량에서 항-섬유화 효과 및 항-염증 효과를 갖는다.
실시예 8: DKK1 및 DKK3 분석의 조절에 대한 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물의 효과
멜라닌 생성의 조절에서 멜라닌 세포와 섬유모세포 사이의 상호 작용의 영향은 잘 알려져 있으며 깊이 연구되었다. 이러한 상호작용이 아직 완전히 이해되지는 않았지만, 그들은 손발바닥 부위의 "미백(bleaching)"의 근원에 있으며 현재 피부과에서 탈색(depigmentation) 제품 개발을 위해 이용되고 있다. Yamaguchi 등(Yamaguchi Y. et al., 2004, Mesenchymal-Epithelial Interactions in the Skin: Increased Expression of Dickkopf by Palmoplantar Fibroblasts Inhibits Melanocyte Growth and Differentiation, Journal of Cell Biology 165(2), p. 275-285)은 손발바닥 영역의 섬유모세포에 의해 생성된 가용성 메신저가 이들 영역에 대한 멜라닌 세포 분화 프로그램을 변형시켜 멜라닌의 생성을 감소시킬 수 있다는 것을 입증했다. 이 메신저는 그 팀에 의해 DKK-1(Dickopf-1)으로 알려진 단백질로 확인되었다.
이러한 결과를 생성하기 위해 DKK-1에 의해 이용되는 신호전달 경로가 이제 확인되었다. Wnt 수용체에 대한 길항제 작용 때문에, DKK-1은 실제로 멜라닌 생성에 관여하는 유전자의 조절을 일반적으로 담당하는, β-카테닌에 의해 활성화되는 세포내 신호 전달 경로를 단락(short-circuit)시킬 수 있다. Yamaguchi 등(전술 참조)은 또한 DKK-1과 유사하지만 Wnt 수용체에 영향을 미치지 않는 분자인 DKK-3이 DKK-1 효과에 조절 역할을 할 수 있다는 것을 입증했다. 실제로, 이 Wnt 수용체의 부근에 있는 DKK-3의 양이 많을수록 멜라닌 생성에 대한 DKK-1과 이 수용체 사이의 상호 작용이 약해진다. Yamaguchi 등(전술 참조)에 의한 연구은 또한 비-손발바닥 기원의 정상 인간 진피 섬유모세포의 배양물에서 DKK1/DKK3 비율에 영향을 미치는 작용제의 확인이 정상적인 비-손발바닥 인간 멜라닌 세포에서 출발하는 멜라닌의 생성을 제어할 수 있다는 것을 시사한다.
이 연구의 목적은 단층 배양인 정상 인간 섬유모세포의 모델(model compound)에서 DKK-1의 합성 및 방출에 대한 페레그리나 단백질 가수분해물의 효과를 평가하는 것이다.
프로토콜: 인간 섬유모세포 세포는 68세 기증자로부터 얻었다. 실험을 수행하기 위해, 섬유모세포를 단일 층에서 컨플루언스까지 배양하였다. 100nM 덱사메타손을 DKK-1의 합성 및 방출을 위한 기준 유도제(reference inducer)로 사용했다. 피부의 디스크를 기준 제품 또는 테스트 제품: "페레그리나 단백질 가수분해물": 0.01%; 0.1% 및 0.5%(v/v)의 부재(대조군) 또는 존재 하에 48시간 동안 인큐베이션시켰다.
인큐베이션의 종료시, DKK-1 방출 방법을 수행하기 위해 인큐베이션 배지를 제거했다.
"페레그리나 단백질 가수분해물" 테스트 화합물을 전술된 다양한 농도를 얻기 위해 인큐베이션 배지에서 직접 희석하였다.
48시간의 인큐베이션 기간의 종료시, 인큐베이션 배지로 방출된 DKK-1을 민감하고 특이적인 ELISA 키트를 사용하여 정량했다.
인큐베이션 기간의 종료시, 세포 용해물에 포함된 단백질을 분광비색법(Bradford 방법)을 이용하여 정량했다.
결과는 단백질 mg당 DKK-1의 ng로 표시된다(평균 ± SD).
"대조군"과 "기준 제품" 간의 유의성의 수준 스튜던트 검정(p＜0.05)을 이용하여 평가했다.
"대조군"과 "테스트 제품" 간의 유의성의 수준은 단일인자 분산 분석 (일원 ANOVA) 및 뒤이은 홀름-시닥 검정에 의해 평가했다(p＜0.05).
본 발명자들의 실험 조건 하에서, 100 nM에서 테스트된 "덱사메타손"으로 표시된 기준 제품은 "대조군"에 비해 방출된 DKK-1을 181.8%(p＜0.01) 크게 증가시켰다. DKK1 분석의 조절(modulatoin)에 대한 결과가 하기에 주어진다.
농도 대조군 대비 세포 성장 (%) 대조군 대비 DKK1 (%)
페레그리나
단백질
가수분해물 		0.5% +1.9 +131.50
0.1% ca. 0 +32.30
0.05% -0.6 +26.10
본 연구는 본 발명에 따른 가수분해물이 0.05%의 투여량에서 DKK1의 수준을 기본 수준에 대해 26.1% 증가로 상당히 증가시켰고, 본 발명에 따른 추출물의 0.5% 농도에서, 기본 수준의 131.5% 증가가 관찰되었다.
본 연구의 목적은 단층 배양에서 정상 인간 섬유모세포의 모델 화합물에서 DKK-3의 합성 및 방출(liberation)에 대한 페레그리나 단백질 가수분해물의 효과를 평가하는 것이었다. 인간 섬유모세포 세포는 68세 기증자로부터 얻었다. 실험을 수행하기 위해, 섬유모세포를 단일 층에서 컨플루언스까지 배양하였다. 인간 섬유모세포는 68세 기증자로부터 얻었다. 실험을 수행하기 위해, 섬유모세포를 단일층에서 컨플루언스까지 배양하였다.
48시간의 인큐베이션 기간의 종료시, 인큐베이션 배지로 방출된 DKK-3을 민감하고 특이적인 ELISA 키트를 사용하여 정량했다.
인큐베이션 기간의 종료시, 세포 용해물에 포함된 단백질을 분광비색법(Bradford 방법)을 사용하여 정량했다.
결과는 단백질 mg당 DKK-3의 ng으로 표시된다(평균 ± SD). "대조군"과 "기준 제품" 간의 유의성의 수준은 스튜던트 검정을 이용하여 평가하였다(*: p ＜0.05).
"대조군"과 페레그리나 단백질 가수분해물 간의 유의성의 수준은 분산의 단일 요인 분석(일원 ANOVA)에 이어 Holm-Sidak 테스트(*: p ＜0.05)로 평가되었다. DKK3 분석의 변조에 대한 결과는 다음과 같습니다.
농도 대조군 대비 세포 성장 (%) 대조군 대비 DKK3 (%)
페레그리나
단백질
가수분해물 		0.5% 101.9 -20.7
0.1% ca. 100.0 -8
0.05% 99.4 -3.9
결론: 0.5%에서 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물은 기본 수준과 비교하여 DKK3에 대해 대략 21%의 실질적인 억제를 보였다. 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물은 DKK1을 현저하게 증가시키고 DKK3를 현저하게 감소시켜, DKK1/DKK3 비율을 증가시키는 능력에 의한 손발바닥 억제 원리(베타-카테닌 신호전달 경로)로 인해 세포 분화에 관여하는 유전자를 관리하는 능력이 크다.
P1, P2, P3 및 실시예 10에 기술된 P1+P2 복합체의 DKK1 생산에 대한 평가의 보완적 연구: 정상 인간 섬유모세포에 대한 세포 테스트 모델.
기준 추출물 P1 (%; v/v)
0.01 0.3 1

DKK-1
(ng/mg 단백질)		 306.7 334.8 399.5 372.9
294.9 293.1 347.9 392.0
298.6 367.6 392.4 385.1
평균 300.1 331.9* 379.9** 383.3**
표준 편차 6.1 37.3 28.0 9.7
기준 대비 % 100.0 110.6 126.6 127.8
*통계적 유의성(p＞0.05)
**: 통계적 유의성(p＜0.01)
추출물 P1은 DKK1의 생산을 0.3%의 용량에서 26.6%, 1%의 용량에서 27.8%로 크게 증가시켰다.
기준 추출물 P2 ( % ; v/v)
0.01 0.3 1

DKK-1
(ng/mg 단백질)		 306.7 291.5 292.6 410.8
294.9 346.5 275.4 367.0
298.6 277.4 354.9 344.4
평균 300.1 305.2* 307.6* 374.1*
표준 편차 6.1 36.5 41.8 33.8
기준 대비 % 100.0 101.7 102.5 124.7
*통계적 유의성(p＞0.05)
추출물 P2는 어떤 실험 용량에서도 DKK1의 생산을 통계적으로 유의하게 증가시키지 않았다.
기준 추출물 P3 (%; v/v)
0.01 0.3 1

DKK-1
(ng/mg 단백질)		 306.7 359.2 387.0 224.7
294.9 371.8 263.7 283.0
298.6 293.4 287.3 288.6
평균 300.1 341.5* 312.7* 265.5*
표준 편차 6.1 42.1 65.5 35.4
기준 대비 % 100.0 113.8 104.2 88.5
*통계적 유의성(p＞0.05)
추출물 P3는 어떤 실험 용량에서도 DKK1의 생산을 통계적으로 유의하게 증가시키지 않았다.
기준 추출물 P1+P2 50/50(%; v/v)
0.01 0.3 1

DKK-1
(ng/mg 단백질)		 306.7 305.9 366.6 389.8
294.9 311.1 357.1 479.5
298.6 346.8 308.1 384.2
평균 300.1 321.3* 343.9* 417.8**
표준 편차 6.1 22.2 31.4 53.5
기준 대비 % 100.0 107.1 114.6 139.2
* 통계적 유의성(p＞0.05)
**: 통계적 유의성(p＜0.01)
1%의 용량(즉, 각 추출물에 대해 0.5%)의 추출물 P1 및 P2의 조합은 DKK1의 생산을 39% 초과로 크게 증가시켰다. 이 점수는 추출물 P1 또는 P2 단독으로 수득된 점수보다 높다; 따라서 이것은 두 추출물 P1과 P2의 조합에 상승적 효과가 있다는 것을 의미한다.
결론: "추출물 P1" 및 "추출물 P1 + P2"로 지칭된 화합물은 단층 배양에서 정상 인간 섬유모세포에 의해 배양 배지로 방출된 DKK-1을 상당히 증가시켰습니다. P1과 P2를 혼합했을 때 상승적 효과를 확인하였다.
본 발명에 따른 단백질 가수분해물의 전술된 활성으로부터 도출된 결론:
인 셀룰로(in cellulo) 테스트에서 입증된 페레그리나 단백질 가수분해물의 가장 주목할 만한 활성은 세포 분열 후 텔로미어 단축 과정을 매우 현저하게 둔화시키는 능력에 의한 후생유전학적 작용이다. 상기 가수분해물은 세포 보호제, 보다 구체적으로, 줄기 세포의 보호제이며, 이는 줄기 세포를 매우 우수한 세포 및 조직 재생기(tissue regenerator)가 되게 한다. 이러한 특성은 DNA 및 그의 유전 물질에 대한 매우 높은 보호를 제공한다. 페레그리나 단백질 가수분해물은 또한, 항-섬유화 및 항-염증 효과를 갖는, ZAG 및 엔도텔린 타입 1의 생성의 강력한 조절자이다.
실시예 9: 안지오텐신 전환효소 2( ACE2 )에 대한 탈지된 페레그리나 케이크로부터의 단백질 가수분해물의 효과의 평가 - 억제제 효과의 무세포 연구.
안지오텐신 전환효소(Angiotensin convertase) 2는 특히 다른 전환효소, 특히 푸린에 의한 스파이크 단백질 활성화 후 COVID19에 의한 세포내 감염에 관여한다. Peter bradding et al. 참조 (ACE, TMPRSS2, and furin gene expression in the airways of people with asthma - implications of COVID-19, JOURNAL ALLERGY CLINICAL IMMUNOLOGY, July 2020, n°46(1), p. 206-211).
시료 평균 평균-블랭크 % 효소 활성 % 억제
블랭크(Blank) 89576.000 0.000 0.00 100%
T+ 101450.333 11874.333 100.00 0%
T- 93017.667 3441.667 28.98 71%
가수분해된 페레그리나 추출물 2.0% 98839.000 10687.333 90.00 10%
1.0% 101400.667 17466.333 147.09 NS
0.10% 104515.333 24256.333 204.28 NS
결론: 페레그리나 케이크의 가수분해 추출물은 안지오텐신 전환효소 2(ACE2)의 직접적인 억제에 크게 관련되지 않는다. 하기 실시예 11의 표 [32]를 고려하여, 또다른 전환효소, 즉 푸린에 대한 이 추출물의 작용의 크기를 평가했다. 푸린에 대한 본 발명에 따른 추출물의 억제 작용은 명확하게 입증되었으며 실시예 11의 표 32에 확립되어 있다. 단일 전환 효소에 대해 입증된 이러한 특이적 억제는 푸린 전환 효소에 대한 특이적 억제제로서 본 발명에 따른 단백질 가수분해물의 중요성을 강화한다.
실시예 10: "스파이크 SARS- CoV -2 슈도타입 코로나바이러스"의 침투를 방지하여 푸린을 억제하는 가수분해 추출물의 인 셀룰로 (in cellulo ) 항-감염 효과 평가: "SARS- CoV 슈도타입 렌티바이러스의 존재 하에 인간 HEK 세포에 대한 인 셀룰로 모델.
본 평가는 두 가지 주요 성분을 사용했다: 한편으로는, ACE2의 표면 발현을 갖는, 전장 인간 ACE2(Genbank # NM_021804.3)를 구성적으로 발현하는 안정한 재조합 클론 HEK293 세포는 유동 세포측정법에 의해 확인되었다. 다른 한편으로는, 기존에 사용하던 VSV-G 대신 스파이크 SARS-CoV-2(Genbank 수탁 번호 QHD43416.1)를 외피 당단백질로 갖는 Spike SARS-CoV-2 슈도타입(pseudotyped) 렌티바이러스를 생산하였다. 이러한 슈도비리온은 또한 CMV 프로모터에 의해 지시되는 반딧불이 루시퍼라아제(luciole luciferase) 유전자를 포함하고, 결과적으로, 피크에 의해 매개되는 세포 진입은 루시퍼라아제 리포터의 활성을 통해 실용적인 방식으로 측정될 수 있다. 스파이크 SARS-CoV-2 슈도타입 렌티바이러스는 생물안전등급(BSL) 2 시설에서 적용을 스크리닝하기 위해 이용될 수 있다.
사용된 재료는 하기와 같았다:
카탈로그 성분
79951 ACE2-HEK 재조합 세포주
60187-1 해동 배지 1
79801 증식 배지 1N
79942 스파이크(SARS-CoV-2) 슈도타입 렌티바이러스 (루시퍼라아제 리포터)
79943 Bald 렌티바이러스 슈도비리온 (루시퍼라아제 리포터)
60690-1 ONE-Step 루시퍼라아제 분석 시스템
AF933 인간/마우스/랫트/햄스터 항체 ACE-2 (R&D Systems)
단계 1: ACE2-HEK 세포의 도말(plating)
ACE2-HEK 세포를 해동 배지 1에서 해동하고, 1N 증식 배지에서 증폭시키고, 수확하여 백색의 투명 편평 바닥(transparent flat bottom) 96-웰 배양 플레이트에 50 ㎕의 해동배지 1 중 10000개 세포/웰의 양으로 넣었다. 세포를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
단계 2: 슈도타입 렌티바이러스 감염 테스트
성분명/공동-인큐베이션 모드 용해도 "웰"의 농도

성분 1
페레그리나/ACE2-HEK		 H2O/배양 배지 3%(C1), 0.5%(C2), 0.1%(C3)
제1 단계에서, 페레그리나 단백질 가수분해물을 해동 배지 1에서 중간 농도까지 11x 희석하고, 뒤이어, 5 ㎕를 테스트 플레이트로 옮기고 ACE2-HEK 세포와의 공동-인큐베이션을 수행했다. 37℃에서 30분의 인큐베이션 기간 후에, 5 ㎕의 희석되지 않은 슈도타입 렌티바이러스 (Bald 또는 S1-스파이크)를 분석을 위해 해당하는 웰에 첨가했다.
ACE2를 차단하는 mAb를 분석을 위해 웰에 0.5 μM의 최종 농도로 양성 대조군으로 사용하였다.
단계 3:
48시간의 인큐베이션 기간 후, 분석을 위해 루시퍼라제 시약 50㎕ 부피를 웰에 첨가하고 PolarStar Omega 루미노미터를 사용하여 발광 신호를 측정했다.
SARS COV2의 슈도비리온에 대한 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물의 항-감염 효과에 대한 결과가 도 1에 주어진다.
결론: 페레그리나 단백질 가수분해물은 연구 모델에서 3%(C1) 용량부터 시작하여 SARS COV2의 슈도비리온에 대해 확실한 항-감염 효과를 보인다. 농도 C1(3%)에서 60%의 현저한 억제가 입증되었다.
실시예 12에서 확인된 밴드 P1, P2, P3 및 복합체 P1+P2의 푸린 전환효소에 대한 평가: 무세포 테스트 모델.
확인된 밴드에 대해 수행된 연구는 P1, P2, P3 및 P1+P2로 테스트한 모든 농도에서 푸린 전환효소에 대한 어떠한 억제 작용도 입증하지 못했다.
결론: 따라서 푸린 전환효소의 억제 활성은 이러한 단백질 밴드 중 하나에 의해 전달되지 않는다. 이는 푸린 전환효소의 억제 활성이 기술된 방법에 의해 수득된 전체 단백질 가수분해물에 기인한다는 것을 입증한다.
단백질 가수분해물은 그 전체로서 특히 푸린 전환효소의 불활성화에 의해 SARS-CoV2 스파이크 타입 단백질을 억제한다. 이러한 억제는 항-감염 및 항바이러스 특성을 제공한다.
실시예 11: 모링가 페레그리나 종자로부터 수득된 상이한 제제에 의한 푸린 전환효소의 억제에 대한 비교 시험
본 연구의 목적은 껍질이 있는 종자를 저온 압착하여 수득된 페레그리나 오일, 약 1.1%의 건조 물질에 의해 구성되고, 이 건조물질 자체는 약 55 중량% 2,5-디포르밀푸란, 2.5% 푸르푸랄, 1.2% 이소프로필 미리스테이트, 4.7% 팔미트산, 11.1% 올레산 및 25.8% 트리글리세리드로 구성되는 것인, 에탄올 (96%)에 의한 페그리나 추출물, 및 마지막으로 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물의 푸린의 활성에 대한 억제 효과를 평가하는 것이었다.
프로토콜: 에탄올 (96%) 중 페레그리나 추출물과 페레그리나 단백질 가수분해물은 사용할 때까지 차광된, +4℃에서 보관하였다. 페레그리나 오일은 암소에서 주위 온도에서 보관하였다.
기준 제품: 100nM 데카노일-Arg-Val-Lys-Arg-CMK를 푸린의 활성에 대한 기준 억제제로 사용했다.
인큐베이션 프로토콜: 푸린을 기준 제품 또는 테스트 화합물의 증가하는 농도의 부재(대조군) 또는 존재 하에 주위 온도에서 10분 동안 프리-인큐베이션시켰다:
- 0.3%, 1% 및 3%(v/v)의 페레그리나 오일.
- 0.02%, 0.2% 및 2%(v/v)의 에탄올(96%) 중 페레그리나 추출물.
- 0.02%, 0.2% 및 2%(v/v)의 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물. 프리-인큐베이션 단계의 종료시, 푸린 기질을 첨가하고 실험 조건을 다시 5분 동안 차광된 상태에서, 주위 온도에서 인큐베이션시켰다. 모든 실험은 3배수로 수행하였다.
화합물의 제조: 96% 에탄올 중 페레그리나 추출물 및 페레그리나 단백질 가수분해물을 분석 완충액에 직접 용해시킨 다음, 전술된 바와 같은 테스트 농도에 도달하도록 희석하였다. 페레그리나 오일은 분석 완충액 중 0.05% Tween20 용액에 3%까지 용해시켰다. 그 후, 수득된 용액을 희석하여 전술된 농도를 수득했다.
평가 프로토콜: 485 nm/535 nm에서 형광을 기록하여, 기질 첨가 후 5분 동안 형광 푸린 기질의 절단을 모니터링하였다.
g. 통계: 결과는 RFU(Relative Fluorescent Units) +/- S.D.(표준 편차)로 표시된다. "대조군"과 "기준 제품" 그룹 간에 관찰된 차이의 통계적 유의성을 스튜던트 검정으로 평가했다(p＜0.001). "대조군"과 "테스트 화합물" 그룹 간에 관찰된 차이의 통계적 유의성은 일원 분산 분석 및 뒤이은 홀름-시닥 검정에 의해 평가했다(p＜0.05). 페레그리나 오일에 대한 결과가 도 2에 제시되고; 도 3의 96°에탄올 페레그리나 추출물에 대한 결과와 마지막으로 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물에 대한 결과가 도 4에 제시된다.
결과:
페레그리나 오일 농도 푸린 전환효소의 활성
0.3%(v:v) 91.2%**
1%(v:v) 90.6%**
3%(v:v) 92.8%**
96° 에탄올 페레그리나 추출물의 농도 푸린 전환효소의 활성
0.02%(v:v) 97.3%*
0.2%(v:v) 102.0%*
2.0%(v:v) 112.8%*
페레그리나 단백질 가수분해물의 농도 푸린 전환효소의 활성
0.02%(v:v) 124.9%***
0.2%(v:v) 73.2%***
2.0%(v:v) 1.2%***
* 통계적 유의성(p＞0.05)
**: 통계적 유의성(p＜0.01)
***: 통계적 유의성(p＜0.001)
결론: 본 연구는 본 발명자들이 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물만이 2%의 농도에서 푸린의 활성을 98.8%까지 유의하게 억제할 수 있다는 것을 입증할 수 있게 했다.
실시예 12: 페레그리나 단백질 가수분해물의 분리 전기영동 겔 크로마토그래피 - 단백질 밴드
SDS(sodium dodesyl sulfate)를 포함하는 폴리아크릴아미드 겔에서의 겔 전기영동은 SDS-PAGE 전기영동으로 알려져 있다. 이는 전기장의 영향 하에 SDS를 통한 음전하의 포화에 의해 변성된 단백질을 폴리아크릴아마이드 겔에서 이동시켜, 그에 의해 분리하는 것으로 이루어진 기술이다. 음으로 하전된 이온성 디터전트(SDS)를 사용하여 비공유 단백질 복합체를 해리시키는 변성(denaturing) 기술이다. 이 디터전트는 두 개의 아미노산에 소수성 결합을 통해 무차별적으로 결합한다. 따라서, 이 기술은 단백질을 분석하고 분자 질량의 함수로 분리하기 위해 사용할 수 있다.
전기영동 방법에 의한 분리 크로마토그래피:
로딩(deposit):
- MW = 크기 마커
- 웰 1: 가수분해된 페레그리나 케이크 추출물
- 웰 2: 가수분해된 페레그리나 케이크 추출물의 상층액
- 웰 3: 가수분해된 페레그리나 케이크 추출물의 펠렛
웰 1의 가수분해된 추출물은 예상된 모든 단백질 밴드를 명확히 보였다.
웰 2(상층액)는 예상된 밴드, 특히 중간 및 최고 분자량에 대해 예상된 밴드를 보였고; 웰 2는 특히 휘발성 물질에 의한, 가장 낮은 분자량을 농축시킨 것으로 보인다.
웰 3(펠렛)은 가장 높은 분자량 밴드(＞ 75000 Da)를 보였고, 그 다음 약 23000 Da의 P3로 알려진 밴드, 10000 및 17000 Da에 포함되는 P2로 알려진 밴드, 및, 마지막으로 10000 Da 미만에서, 4000 내지 6000 Da으로 추정되는, P1으로 알려진 밴드를 명확하게 보였다.
회전식 증발기 준비:
- 휘발성 물질은 필연적으로 "가장 가벼운" 화합물과 함께 상층액에 있었다; 10mL의 상층액을 회수하고 10 mL의 96°에탄올을 보충했다.
- 혼합물을 진공 하에 45℃에서 추출하였다; 휘발성 화합물을 진공 플라스크에서 응축시켰다.
- 휘발성 물질에 농축된 응축물을 SPME 미세 추출 후 GC/FID를 통과시켰다.
FID 검출을 통한 SPME 추출 방법 후 가스 크로마토그래피 연구
휘발성 화합물이 검출되지 않았다.
결론: 단백질 밴드의 단리는 휘발성 화합물이 단백질에 결합되어 있지 않다는 것을 보여준다. 휘발성 화합물은 가장 작은 단백질 밴드의 분자 대열(cavalcade)에 참여하지 않는다.
3개의 단백질 밴드의 결정: 밴드 P1(10000 Da 미만) 및 P2(10000 내지 17000 Da) 및 P3(약 23000Da)을 준비하여 질량 분석과 결합된 액체 크로마토그래피 분석(LC MS/MS)을 수행했다.
식물에서 단백질 인식을 위한 2개의 전문 소프트웨어 프로그램(Mascot 및 Peaks)을 이용하여 결과를 수득했다.
확인의 결과는 이러한 단백질을 정확하게 식별할 수 없었다; 전술된 데이터베이스에 기재되지 않았던 단백질이 존재했다.
실시예 13: 피부과용 항-섬유화 제품(액체 세정제)을 위한 제형
성분 %
물 80.7000
코코-황산나트륨 5.0000
소디움 코코일 이세티오네이트 4.0000
벤토나이트 3.7800
카프릴산/카프르산 트리글리세리드 2.0000
본 발명에 따른
페레그리나 단백질 가수분해물 		2.0000
글루코노락톤 0.7500
벤조산 나트륨 0.5450
향기 0.5000
잔탄검 0.2700
소디움 스테아로일 글루타메이트 0.2250
시트르산 0.2250
글루콘산 칼슘 0.0050
실시예 14: 국소 섬유증을 치료하는 피부과용 제품(린스-불포함 케어 제품)을 위한 제형
성분 %
물 71.5000
카프릴산/카프르산 트리글리세리드 18.0000
벤토나이트 4.2000
세테아릴 알코올 1.5000
본 발명에 따른
페레그리나 단백질 가수분해물 		2.0000
글루코노락톤 0.7500
벤조산 나트륨 0.5450
잔탄검 0.5000
향기 0.5000
소디움 스테아로일 글루타메이트 0.2500
시트르산 0.2500
글루콘산 칼슘 0.0050
실시예 15: 피하로 주사될 수 있는 조성물의 제형
피하 투여를 위한 제품의 제형: 불활성 기체 하에 단일 용량 플라스크에 포장된, 생리학적 매질에 의해 용해될 준비가 된, 본 발명에 따른 건조 추출물(이눌린 지지체 상에 60%의 단백질 가수분해물을 함유함.
실시예 16: 피하로 주사될 수 있는 조성물의 제형
주사가능한 액체 제품의 제형: 멸균 조건 하에, 특히 0.45 ㎛의 컷오프 임계값으로 진공 여과에 의해 포장된 생리학적 매질 중 5% 용량의 본 발명에 따른 액체 추출물.
실시예 17: 패치 형태의 제형(활성 성분의 느린 확산 효과를 제공하기 위해 천천히 방출되는 활성 성분이 함침된(impregnated), 피부에 부착되는 드레싱 또는 외부 의료 장치).
실시예 18: 캡슐 내 약물 제형
100 mg의 피페린, 300 mg의 본 발명에 따른 건조 추출물(이눌린 지지체 상에 60%의 단백질 가수분해물 함유), 100 mg의 보스웰산, 250 mg의 탄산칼슘을 함유하는 750mg 캡슐의 항섬유화 약물.
실시예 19: 정제로서의 약물을 위한 제형
1g 정제 중 항섬유화제: 본 발명에 따른 건조 추출물 300 mg(이눌린 지지체 상에 단백질 가수분해물 60% 함유), 비타민 D 200 IU를 함유하는 탄산칼슘 400 mg, 글루콘산 마그네슘 150 mg, 이눌린 80 mg, 및 마그네슘 스테아레이트 70mg.
실시예 20: 비강 스프레이로서의 약물을 위한 제형 (비강 내로 활성 용액을 분무함으로써 활성 성분을 추진시키는 의료 장치 중 활성 성분을 함유하는 용액)
실시예 21: 본 발명에 따른 단백질 가수분해물의 독성 시험
실시예 1에 따른 단백질 가수분해물의 제조: 열매가 익었을 때 수확된 모링가 페레그리나(Forssk.) 피오리의 껍질을 벗기지 않은(unshelled) 종자를 내부 수분 함량이 8% 미만, 바람직하게는 약 6%가 되도록 건조시키고, 오일을 종자의 나머지로부터 분류하기 위한 방식으로 무한 스크류 기계식 프레스로 압착하여 버진 오일(virgin oil)과 케이크를 수득하였다. 그 후, 상기 케이크를 1 내지 2 cm 조각으로 절단된 압출물(extrudate)의 형태로 단리했다. 실시예 1에 기술된 프로토콜에 따라, 얻어진 액체 추출물을 희석하지 않고 하기 테스트에 사용하였다.
1. 박테리아 균주 살모넬라 티피뮤리움(TA 100)에 대한 돌연변이유발 활성 결정 - 박테리아 복귀 돌연변이 테스트(reverse bacterial mutation test)
테스트는 3개의 주요 단계로 수행되었다:
- 테스트되는 요소(element)의 세포독성을 평가하고 후속 실험을 위한 용량(dose) 범위를 선택하기 위하여 예비 실험을 수행하였다.
- 예비 연구에서 정의된 용량 범위에 걸쳐, 테스트 시스템 및 테스트(또는 대조군)를 최소 겔(minumum gel)에 직접 통합하여 대사 활성화의 존재 및 부재 하에, 제1 유전독성(genotoxicity) 실험(테스트 1),
- 제1 실험으로부터의 결과의 분석 후 연구 책임자가 정의한 용량 수준에서, 대사 활성화의 존재 및 부재 하에, 테스트 시스템 및 테스트(또는 컨트롤)의 프리-인큐베이션에 의한 제2 실험 (테스트 2). 이 제2 실험은 제1 실험의 결과를 확인하거나 보완하기 위해, 특히, 동등하거나 부정적인 결과를 수득한 경우에 수행하였다.
세포독성 시험을 수행하기 위해 물 중 실시예 1에 따른 추출물의 희석액을 제조하였다.
S9-Mix의 존재 및 부재 하에, 5000, 1600, 500, 160 및 50 ㎍/플레이트의 농도에서 살모넬라 티피뮤리움 TA100 균주에 대해 세포독성 테스트를 수행했다.
S9-Mix의 제조를 위해 사용된 시약은 하기 설명서에 따라 제조하였다.
최종 농도
MgCl2(0.4M) + KCl(1.65M) 8mM + 33mM
글루코오스 6 포스페이트(0.2M) 5mM
NADP(0.1M) 4mM
S9-Mix용 인산염 완충액(pH 7.4 - 0.2M) 0.1M
S9 분획(fraction) 10%
물 최종 농도에 맞게 조정
박테리아를 대사 활성화 시스템의 존재 및 부재 하에 본 발명의 테스트 추출물에 노출시켰다. 사용된 대사 시스템은 보조 인자(S9)로 개선된 포스트-미토콘드리아 분획(post-mitochondrial fraction)이었다. 효소 유도제로 처리된 Sprague Dawley 랫트 간 균질물의 마이크로솜 분획인 이 분획 S9는 Maron, D.M. et al., 1983, Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, 113, p.173-215)에 따라 제조했고, MOLTOX TM에서 제공했다. 이 분획은 -70℃ 이하의 온도에서 보관되었다. 마이크로솜 분획 S9는 S9-Mix 중 10%의 농도로 사용되었다. 적용된 프로토콜은 하기와 같았다:
Figure 112022137672486-pct00005
하기를 3개의 용혈 튜브에 도입했다:
o 대사 활성화 부재 하의 분석:
- 0.1 mL의 다양한 농도의 테스트 요소,
- 0.5 mL의 멸균 인산염 완충액, 0.2M, pH 7.4,
- 2 mL의 살모넬라 티피뮤리움을 위한 상층 아가(top agar),
- 0.1 mL의 박테리아 접종물(TA100).
o 대사 활성화 존재 하의 분석:
- 0.1 mL의 다양한 농도의 테스트 요소,
- 2 mL의 살모넬라 티피뮤리움을 위한 상층 아가,
- 0.1 mL의 박테리아 접종물(TA100),
- 0.5 mL의 S9-Mix.
혼합하고 이미 페트리 디쉬에 배치된 하층 아가(bottom agar)의 표면에 붓는다.
37℃ ± 2℃에서 48 내지 72시간 동안 인큐베이션한다.
이러한 분석은 각 테스트를 위해 수행했다: 예비 세포독성 테스트, 테스트 1, 및 테스트 2. 상층 아가를 붓기 전에, 미처리 대조군, 음성 대조군 및 프리-인큐베이션 방법 동안 생성된 양성 대조군을 37℃ ± 2℃에서 20 내지 30분 동안 인큐베이션시켰다.
적용된 프로토콜은 하기와 같았다.
살모넬라 티피뮤리움의 경우, 하기를 2 mL의 상층 아가의 4개의 분획에 도입한다.
o 0.1 mL의 인산염 완충액, 0.2 M, pH 7.4,
o 0.1 mL의 용매,
o 0.1 mL의 S9-Mix,
o 0.1 mL의 가장 높은 농도의 테스트 요소 제제(test element preparation).
2 mL의 상층 아가의 분획을 이용하여 살모넬라 티피뮤리움의 무균성(sterility)을 제어한다.
혼합하고 이미 페트리 디쉬에 배치된 하층 아가의 표면에 붓는다.
37℃ ± 2℃에서 48 내지 72시간 동안 인큐베이션한다.
테스트는 3배수로 수행했다.
박테리아 성장이 관찰되지 않을 수 있다.
테스트 추출물의 적어도 5개 농도에 대해 대사 활성화가 없는 테스트와 대사 활성화가 있는 테스트를 수행하였다.
결과의 표현 및 해석
대사 활성화의 존재 또는 부재 하에, 결과가 양성인지, 특히 테스트할 항목의 용량과 상관 관계가 있는 복귀 돌연변이체(revertant)의 개수의 증가, 또는 하나 이상의 농도에서 복귀 돌연변이체의 개수의 재현가능한 증가를 결정하기 위해 다수의 판단기준(criteria)을 이용할 수 있다. 여러 가지 기준을 사용할 수 있다.
- 검증(verification) 단계의 종료시, 대사 활성화의 존재 및/또는 부재 하에, 5개의 균주 중 하나 이상에 대해 재현가능한 방식으로 용량-효과 관계(dose-effect relationship)가 얻어지면, 테스트 요소는 돌연변이 유발성으로 간주된다. 복귀 돌연변이체의 개수가 균주 TA98, TA100 및 TA102에 대한 자발적 복귀 비율(spontaneous reversion ratio)의 2배 이상이고(R≥2), 균주 TA1535 및 TA1537에 대한 자발적 복귀 비율의 3배 이상일 때(R≥3),주어진 농도에 대해서 돌연변이 유발성이 단지 간주된다.
- 테스트 1 및 테스트 2의 종료시, 대사 활성화의 존재 및/또는 부재 하에, 복귀 돌연변이체의 개수가 균주 TA98, TA100 및 TA102에 대해 테스트되었던 테스트 요소의 모든 농도에서 자발적 복귀 비율의 2배 미만이고, 균주 TA1535 및 TA1537에 대한 자발적 복귀 비율의 3배 미만이며, 돌연변이 유발 효과의 부재가 테스트 농도의 독성과 연관되지 않는 것으로 확인된 경우, 테스트 요소는 비-돌연변이 유발성(non-mutagenic)인 것으로 간주된다.
예비 연구는 테스트 요소에 대한 어떠한 세포독성도 입증하지 않았고, 결과적으로 이 농도 범위를 유전독성 테스트 1을 위해 이용하였다.
테스트 1에서 수득된 결과로 인해, 테스트 2에 동일한 희석 범위를 사용하기로 결정했다. 복귀 돌연변이체의 물질의 분석은 하기를 보여준다:
- 세포 독성 효과는 관찰되지 않았으며,
- 시험 추출물의 어떤 농도도 대사 활성화의 존재 및 부재 하에, TA98, TA100 및 TA102에 대해 자발적 복귀 비율의 2배 이상, TA1535 및 TA1537에 대해, 자발적 복귀 비율의 3배 이상인 비율 R을 보이지 않았고,
- 테스트 시스템이나 테스트 조건에 관계없이, 용량에 대한 반응이 관찰되지 않았다.
본 연구 동안 수득된 결과로 볼 때, 실시예 1에 따른 단백질 가수분해물은 돌연변이 유발 활성이나 돌연변이 유발 촉진(pro-mutagenic) 활성을 갖지 않는 것으로 간주될 수 있다.
2. 인 비트로 3T3 NRU 광독성 테스트
테스트의 원리는 배양 중인 세포에서 UVA의 비-세포독성(non-cytotoxic) 용량의 존재 및 부재에서 실시예 1에 따른 단백질 가수분해물의 세포독성을 비교하는 것이다. UVA를 조사하거나 조사하지 않고, 기준 요소(reference element) 및 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물로 처리한 후 24시간차에, 생체 염색(vital stain): 뉴트럴 레드(neutral red)를 사용하여 세포 생존력을 측정하는 것에 의해 세포독성을 평가했다. 사용된 세포는 Balb/c 3T3 클론 31(ATCC - CCL163) 계열의 마우스 배아 섬유모세포였다. 양성 대조군은 클로르프로마진(CAS 번호: 69-09-0)의 용액이었다. 음성 대조군은 테스트 및 기준 추출물에 대한 희석제였다 (완충 염수(buffered saline solution) +/- 1% 용매). 페레그리나 단백질 가수분해물을 UVA의 존재 또는 부재 하에 연구되는 농도당 적어도 4개의 배양 웰에서 8개 농도로 테스트하였다. 섬유모세포를 트립신 처리하고, 2개의 96-웰 배양 플레이트에 100 ㎕의 2 x 105개 세포/mL 완전 배양 배지(complete culture medium) 중 세포 현탁액 (즉, 웰당 2 x 106개 세포)을 접종했다.
접종된 플레이트를 오븐에서 24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 배양 종료 시 세포 매트(cell mat)의 세미-컨플루언스(semi-confluence)를 확인하였다. 희석액은 세포에 적용(deposit)하기 직전에 준비하였다. 가장 높은 농도의 pH를 측정했다; pH는 6.5 내지 7.8에 포함되었다. 배양 배지를 제거하였다; 각 웰을 150㎕의 PBS로 조심스럽게 세정하고, 100㎕의 각 추출물 희석액 또는 기준 희석액으로 처리하기 전에 주위 온도에서 유지시켰다. 배양 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 1시간 ± 5분 동안 암소에서 인큐베이션시켰다. BIO SUN 태양광 조사 시스템(Vilber Lourmat RMX3W)을 이용하여 광조사(irradiation)를 수행하였다. BIO SUN은 프로그래밍가능한 마이크로프로세서를 이용하여 UV 조사를 제어하는 시스템이다. 이 시스템은 UV광의 방출을 연속적으로 모니터링한다. 전달된 에너지가 프로그래밍된 에너지와 동일해지면 조사가 자동으로 중지된다. 테스트 장치의 스펙트럼 조사는 보정된 분광복사계(spectroradiometer)로 250 내지 700 나노미터의 파장 범위에서 측정하였다.
2개의 플레이트 중 하나는 주위 온도에서 커버를 덮고 조사되었고, 다른 플레이트는 UVA로부터 보호되고 조사 기간 동안 주위 온도에서 보관되었다. 조사 후, 처리 배지를 흡인하여 제거하고, 세포를 세정했다. 다음으로, 100 ㎕의 완전 배양 배지를 조심스럽게 첨가하고 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 18 내지 22시간 동안 인큐베이션시켰다. 다음날, 위상차 현미경을 사용한 관찰에 의해 세포 생존력(성장, 형태, 단일층의 완전성(integrity))을 평가했다. 배양 배지를 제거하고, 각 웰을 세정하고, 100 ㎕의 염색 용액으로 처리하기 전에 주위 온도에서 유지시켰다. 동일한 조건에서 플레이트를 3시간 동안 인큐베이터에 재배치했다(replaced). 염색 용액을 제거하고, 세포를 세정하고, 세정 용액을 제거하고 각 웰에 150 ㎕의 탈착(desorption) 용액을 첨가하였다. 결정이 완전히 용해될 때까지 플레이트를 교반하였다. 흡광도는 450nm에서 측정되었다.
테스트의 검증:
증가하는 조사량에 노출된 후 세포의 생존력을 평가하는 것에 의해 약 10회의 계대(pass)에 걸쳐 UVA에 대한 세포의 민감도를 모니터링하였다. 세포를 테스트에서 사용된 밀도까지 배양하였다. 다음날 그들을 2.5 내지 9 J/cm2의 선량으로 조사하고, 1일 뒤에, NRU 테스트를 이용하여 세포 생존력을 결정하였다. 5 J/cm2 UVA 조사 후 생존력이 암소에서 보관된 기준의 생존력의 80% 이상인 경우, 세포는 품질 기준을 충족했다. 9 J/cm2 UVA보다 높은 선량에서, 생존력은 암소에서 보관된 기준의 생존력의 50% 이상이어야 했다.
결과:
음성 대조군은 0.4 이상의 흡광도를 가졌다. 양성 대조군인 클로르프로마진(Chlorpromazine)은 UVA 존재 시 0.1 내지 2 ㎍/mL에 속하는 CI50, UVA 부재 시 7 내지 90 ㎍/mL에 속하는 CI50을 가졌다. 이러한 결과를 통해 테스트를 검증할 수 있었다. UVA의 존재 또는 부재 하에 50% 세포 사멸을 제공하는 실시예 1에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물의 농도는 추정할 수 없었다. 사망률이 50%에 도달하지 못했다. UVA 존재 또는 부재 하에서 50% 세포 생존력을 제공하는 페레그리나 단백질 가수분해물의 농도는 추정할 수 없었다. 생존력은 항상 50% 이상이었다.
결론: 사용된 실험 조건 하에서, 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물은 비-광독성(non-phototoxic)인 것으로 간주될 수 있다.
3. SIRC 세포주에 대한 뉴트럴 레드 침출법(neutral red leaching method)에 따른 인 비트로 세포독성 연구에 의한 눈 자극 가능성(ocular irritant potential) 평가
이 인 비트로 연구는 NR(neutral red) 침출 기술을 이용하여 세포 단일층에서 50% 세포 사멸을 유발하는 농도(IC50)를 결정하는 것에 의해 페레그리나 단백질 가수분해물의 세포독성을 평가하는 것에 기반했다. 사용된 세포는 마이코플라스마(mycoplasma)가 없는 토끼 각막 섬유모세포(ATCC - CCL60)인 SIRC였다.
페레그리나 단백질 가수분해물을 생리학적 혈청으로 25% 및 50%로 희석하였다. 섬유모세포를 트립신 처리하고 2개의 24-웰 배양 플레이트에 완전 배양 배지 중 2 x 105개 세포/mL 세포 현탁액 1 mL의 양으로 접종하였다. 접종된 플레이트를 오븐에서 밤새 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션했다. 인큐베이션의 종료 시 세포 매트의 컨플루언스를 확인하였다. 완전 배양 배지 중 0.5 mg/mL의 농도로 염색 용액을 제조하였다. 배양 배지를 제거하였다; 1 mL의 염색 용액을 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이터에 3h +/- 15분 동안 복귀시켰다. 이 접촉 기간 후, 염색 용액을 제거하고 웰 당 1 mL의 완전 배양 배지로 교체했다. 추출물 또는 기준과 접촉하기 전에 시스템을 안정화하기 위해 플레이트를 주위 온도에서 적어도 30분 동안 유지했다. 각 웰을 2 mL의 PBS로 세정하고, 주위 온도에서 유지한 다음 페레그리나 단백질 가수분해물 또는 기준의 각 희석액 500 ㎕를 첨가하여 세포 매트와 접촉시켰다. 접촉 시간은 60초였다(양성 대조군의 경우 30초). 페레그리나 단백질 가수분해물 또는 기준을 첨가하는 순간 시간 측정을 시작하여, 처리를 웰별로 수행했다. 플레이트를 처리 기간 동안 수동으로 교반시켰다. 55초 (또는 양성 대조군의 경우 25초) 후에, 희석액을 흡인에 의해 제거했다(suck off). 정확히 60초 또는 30초에 5회의 연속 세정을 수행하였다(5 x 주위 온도에서 유지된 PBS 2 mL). 각 세정 후 상층액을 흡인하여 제거하고, 마지막 세정 후, 발현(revealing) 단계를 기다리면서, 웰에 배지가 없도록 유지했다. 배양 플레이트의 처리가 완료된 후, 1 mL의 탈착 용액을 각 웰에 첨가했다. 균일한 염색이 얻어질 때까지 플레이트를 약 15분 동안 교반하였다. 각 배양 웰에 대해 수득된 용액을 채취하고, 96-웰 플레이트의 2개의 웰, 즉 150 ㎕/웰로 나누었다.
결과:
50% 세포 사멸을 제공하는 페레그리나 단백질 가수분해물의 농도를 >50%에서 평가하였다. 50% 페레그리나 단백질 가수분해물에서 세포 사멸률은 17%로 평가되었다.
결론: 사용된 실험 조건 하에서, 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물의 세포독성은 무시할 수 있는 세포독성으로 분류될 수 있다.
4. 피부학적 조절 하에 48시간 동안 폐색 드레싱 하에서 단일 적용 후 본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물의 피부 적합성 평가.
본 연구의 목적은 48시간 동안 팔의 전면 외측 표면에서 수행된 경피 테스트(epicutaneous test)에 의해 페레그리나 단백질 가수분해물의 피부 적합성(skin compatibility)의 정도를 평가하고; 및 일반적으로 피부를 양호한 상태로 유지하는 단백질 가수분해물의 능력을 평가하는 것이었다. 건성 피부도 민감성 피부도 아니고 처리 영역에 피부 병변이 없는 18세에서 65세 사이의 건강한 남성 또는 여성 지원자 10명이 연구에 포함될 수 있었다. 실시예 1에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물 5%와 프로판디올/소르비톨 혼합물 95%를 포함하는 로션 형태로 제조한 페레그리나 단백질 가수분해물의 피부 적합성을 최초 도포 후 48시간, 드레싱의 제거 후 30 내지 40분에 평가하였다. 피부의 반응(홍반 및 부종)에 하기 척도에 따라 0 내지 3의 점수를 부여했다.
점수 홍반(E) 부종(오에)
0 홍반 없음 부종 없음

0.5		 거의 인지할 수 없는 홍반, 패취 영역의 일부에 매우 희미한 분홍색 착색 감지할 수 있는 부종, 거의 인지할 수 없음
1 약간의 홍반, 패치의 전체 표면에 분홍색 착색 감지할 수 있고, 뚜렷한 부종
2 중간 정도의 홍반, 전체 패치 표면에 걸쳐 선명한 색상 구진 또는 소수포(vesicle)가 있거나 없는 명확한 부종

3		 큰 홍반, 전체 패치 영역에 걸쳐 강렬한 착색 구진 또는 소수포가 있거나 없는 패치 영역 너머로 확산되는 큰 부종
피부의 모든 반응(수포(blister), 구진, 소수포, 건조, 낙설, 거칠음, 비누효과 등)을 하기 촉도에 따라 기술적으로 보고했다.
- 0: 반응 없음
- 0.5: 매우 약함(very slight)
- 1: 약함 (slight)
- 2: 중간 (moderate)
- 3: 강함 (major).
연구 종료 시 평균 자극 지수(M.I.I.)를 하기 식을 이용하여 계산하였다.
[Math. 4]
M.I.I. = 피부 반응의 합(E + Oe+ 수포 + 구진 + 소수포)/분석된 지원자의 수
수득된 M.I.I.는 테스트된 페레그리나 단백질 가수분해물을 하기 척도를 이용하여 분류할 수 있게 했다:
M.I.I ≤ 0.20 자극적이지 않음
0.20 ＜ M.I.I ≤ 0.50 약간 자극적임
0.50 ＜ M.I.I ≤ 2 평균적으로 자극적임
2 ＜ M.I.I ≤ 3 매우 자극적임
결과: 페레그리나 단백질 가수분해물의 평균 자극 지수(M.I.I.)는 0이다.
결론: 페레그리나 단백질 가수분해물은 12명의 지원자에게 48시간 연속 적용 후 자극적이지 않은 것으로 간주될 수 있다.
테스트의 일반적인 결론:
위에서 수행된 테스트의 결과는 결정적이고, 실시예 1에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물에 대해 하기를 입증한다:
1) 안구 및 피부 자극 테스트는 모두 음성이다.
2) 광독성 테스트는 음성이다.
3) 돌연변이 유발성(mutagenicity) 테스트는 음성이다.
본 발명에 따른 페레그리나 단백질 가수분해물의 안전성이 입증되었고, 표적 집단에 대한 제한 없이 대규모 피부과 용도에 이상적이다.

Claims (22)

  1. 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 모링가 페레그리나(Moringa peregrina) 종자 케이크로부터 단백질 가수분해물을 수득하는 방법:
    a) 익은 모링가 페레그리나 열매로부터 껍질을 벗기지 않은 성숙한 종자를 수집하고 내부 수분 함량이 8% 미만이 되도록 건조시키는 단계,
    b) 오일을 종자의 나머지로부터 분리하는 방식으로 건조된 종자를 압착하여 6 중량% 미만의 잔류 오일을 포함하는 케이크를 수득하는 단계,
    c) 단계 b)에서 수득된 케이크를 분쇄하는 단계,
    d) 단계 c)에서 수득된 분쇄된 케이크를 수성 상에 각각 90.9/9.1 (질량/질량)의 비율로 분산시키는 단계,
    e) 단계 d)에서 수득된 수성 분산액에 2시간 동안 13 초과의 pH 및 16℃ 내지 25℃에 포함되는 온도에서 화학적 단백질 가수분해를 수행하는 단계,
    f) 상기 단백질 가수분해를 중화시켜, 수득된 단백질 가수분해물을 안정화시키는 단계,
    g) 고체/액체 분리에 의해 상기 단백질 가수분해물을 회수하는 단계, 및
    h) 상기 단백질 가수분해물을 100 내지 25000 Da에 포함되는 컷오프 임계값으로 수행되는 한외여과 및/또는 나노여과에 의해 정제하는 단계.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 나노여과는 10,000 Da 미만의 분자량을 갖는 P1 밴드, 10,000 내지 17,000 Da의 분자량을 갖는 P2 밴드, 및 23,000 Da의 분자량을 갖는 P3 밴드를 포함하는 단백질 가수분해물로부터 3개의 밴드를 분리하는 방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 나노여과 단계 h)는 1,500 Da 내지 5,000 Da에 포함되는 컷오프 임계값으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 나노여과 단계 h)는 10,000 Da 내지 17,000 Da에 포함되는 컷오프 임계값으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 나노여과 단계 h)는 17,000 Da 내지 25,000 Da에 포함되는 컷오프 임계값으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 익은 모링가 페레그리나 열매로부터 수확되고, 껍질을 벗기지 않은 종자 케이크로부터의 단백질 가수분해물로서, 상기 단백질 가수분해물은 분자량이 1,500 Da 내지 5,000 Da에 포함되는 것인 아미노산 유도체, 아미노산, 펩티드, 및 글리코펩티드의 주요 분획 P1 (질량/질량), 분자량이 10,000 내지 17,000 Da에 포함되는 것인 20% (질량/질량)의 분획 P2, 및 분자량이 23000 Da인 것인 20% (질량/질량)의 분획 P3을 포함하고, 상기 단백질 가수분해물은 2시간 동안, 13 초과의 pH, 및 16℃ 내지 25℃에 포함되는 온도에서 화학적 단백질 가수분해에 의해 수득되며, 상기 단백질 가수분해물은 액체이고 1 초과의 밀도를 갖는 것을 특징으로 하는 단백질 가수분해물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 단백질 가수분해물은 1% 내지 6%의 질소 함유 화합물을 포함하는, 12.5% (질량/질량)의 건조 물질 함량(dry matter content)을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 가수분해물.
  8. 익은 모링가 페레그리나 열매로부터 수확되고, 껍질을 벗기지 않은 종자 케이크로부터의 단백질 가수분해물로서, 상기 단백질 가수분해물은 분자량이 1,500 Da 내지 5,000 Da에 포함되는 것인 아미노산 유도체, 아미노산, 펩티드, 및 글리코펩티드의 주요 분획 P1 (질량/질량)을 포함하고, 상기 단백질 가수분해물은 2시간 동안, 13 초과의 pH 및 16℃ 내지 25℃에 포함되는 온도에서 화학적 단백질 가수분해, 및 뒤이은 1,500 Da 내지 5,000 Da에 포함되는 컷오프 임계값으로 수행되는 나노여과에 의해 수득되며, 상기 단백질 가수분해물은 액체이고 1 초과의 밀도를 갖는 것을 특징으로 하는 단백질 가수분해물.
  9. 익은 모링가 페레그리나 열매로부터 수확되고, 껍질을 벗기지 않은 종자 케이크로부터의 단백질 가수분해물로서, 상기 단백질 가수분해물은 분자량이 10,000 내지 17,000 Da에 포함되는 것인 아미노산 유도체, 아미노산, 펩티드, 및 글리코펩티드의 20% (질량/질량)의 P2 분획을 포함하고, 상기 단백질 가수분해물은 2시간 동안, 13 초과의 pH 및 16℃ 내지 25℃에 포함되는 온도에서 화학적 단백질 가수분해, 및 뒤이은 10,000 내지 17,000 Da에 포함되는 컷오프 임계값으로 수행되는 나노여과에 의해 수득되며, 상기 단백질 가수분해물은 액체이고 1 초과의 밀도를 갖는 것을 특징으로 하는 단백질 가수분해물.
  10. 익은 모링가 페레그리나 열매로부터 수확되고, 껍질을 벗기지 않은 종자 케이크로부터의 단백질 가수분해물로서, 상기 단백질 가수분해물은 분자량이 23,000 Da인 것인 아미노산 유도체, 아미노산, 펩티드, 및 글리코펩티드의 20% (질량/질량)의 P3 분획을 포함하고, 상기 단백질 가수분해물은 2시간 동안, 13 초과의 pH 및 16℃ 내지 25℃에 포함되는 온도에서 화학적 단백질 가수분해, 및 뒤이은 17,000 내지 25,000 Da에 포함되는 컷오프 임계값으로 수행되는 나노여과에 의해 수득되며, 상기 단백질 가수분해물은 액체이고 1 초과의 밀도를 갖는 것을 특징으로 하는 단백질 가수분해물.
  11. 익은 모링가 페레그리나 열매로부터 수확되고, 껍질을 벗기지 않은 종자 케이크로부터의 단백질 가수분해물로서, 상기 단백질 가수분해물은 분자량이 1,500 Da 내지 5,000 Da에 포함되는 것인 아미노산 유도체, 아미노산, 펩티드, 및 글리코펩티드의 주요 분획 P1 (질량/질량) 및 분자량이 10,000 내지 17,000 Da에 포함되는 것인 아미노산 유도체, 아미노산, 펩티드, 및 글리코펩티드의 20% (질량/질량)의 P2 분획을 포함하고, 상기 단백질 가수분해물은 2시간 동안, 13 초과의 pH 및 16℃ 내지 25℃에 포함되는 온도에서 화학적 단백질 가수분해, 및 뒤이은 상기 P1 분획을 위한 1,500 Da 내지 5,000 Da, 및 상기 P2 분획을 위한 10,000 내지 17,000 Da에 포함되는 컷오프 임계값으로 수행되는 나노여과에 의해 수득되며, 상기 단백질 가수분해물은 액체이고 1 초과의 밀도를 갖는 것을 특징으로 하는 단백질 가수분해물.
  12. 청구항 6 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 것인 단백질 가수분해물.
  13. 청구항 6 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 섬유화 질환, 염증, 암, 감염성 박테리아 또는 바이러스 타입의 질환, 또는 피부 색소 침착의 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 것인 단백질 가수분해물.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 약학적 조성물은 복용을 위해 제형화된 것을 특징으로 하는 단백질 가수분해물.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 약학적 조성물은 피부 및 점막으로의 국소 적용을 위해 제형화된 것을 특징으로 하는 단백질 가수분해물.
  16. 청구항 13에 있어서, 상기 단백질 가수분해물이 상기 조성물의 총 중량에 대하여 중량 기준 0.0001% 내지 40%의 농도로 상기 조성물에 존재하는 것을 특징으로 하는 단백질 가수분해물.
  17. 활성제로서 유효량의 청구항 8 또는 9의 단백질 가수분해물을 포함하는, 섬유화 질환 또는 염증의 치료용 약학적 조성물.
  18. 활성제로서 유효량의 청구항 10의 단백질 가수분해물을 포함하는, 암의 치료용 약학적 조성물.
  19. 활성제로서 유효량의 청구항 6 또는 7의 단백질 가수분해물을 포함하는, SARS-COV2의 스파이크 COV2 단백질을 억제하는 바이러스 타입의 감염성 질병의 치료용 약학적 조성물.
  20. 활성제로서 유효량의 청구항 11의 단백질 가수분해물을 포함하는, 피부 섬유증 및 흑색점의 치료용 약학적 조성물.
  21. 삭제
  22. 삭제
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