KR20150085991A

KR20150085991A - 한방 약재성분의 복합추출물이 함유된 피부미백용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20150085991A
Application number: KR1020140006044A
Authority: KR
Inventors: 유제영; 김보윤; 박병준; 김진준
Original assignee: 한국콜마주식회사
Priority date: 2014-01-17
Filing date: 2014-01-17
Publication date: 2015-07-27

Abstract

본 발명은 귤피, 도화 및 동과자로 이루어진 한방 약제성분의 복합추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 임상적으로 안전성이 증명된 한방 약재 중에서 귤피, 도화 및 동과자의 한방 약재성분의 복합추출물로 선정하고, 상기 복합추출물이 멜라닌 생성 억제 효과 및 티로시나제 발현 억제 효과 있음을 확인하고, 농도별 복합추출물로부터 최적의 멜라닌 생성 억제 효과 및 티로시나제 발현 억제 효과를 구현하는 한방 약재 복합추출물을 탐색하여, 그를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공함으로써, 우수한 피부 미백효과를 구현하는 다양한 제형의 피부 미백효능의 기능성 화장품에 제공할 수 있다.

Description

한방 약재성분의 복합추출물이 함유된 피부미백용 화장료 조성물{SKIN WHITENING COMPOSITIONS CONTAINING ORIENTAL MEDICINE NATURAL HERB}

본 발명은 한방 약재성분의 복합추출물이 함유된 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 임상적으로 안전성이 증명된 한방 약재 중에서 귤피, 도화 및 동과자로 이루어진 한방 약제성분을 함유한 복합추출물을 선정하고, 상기 복합추출물이 피부 안전성과 우수한 미백 효과가 구현되는 최적조건으로 함유된 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

동서고금을 막론하고 아름답고 하얀 피부를 갖고자 하는 것은 모든 사람들의 소망이다. 대부분의 생물체에서 발견되는 멜라닌(melanin)은 사람에게 있어서는 피부색을 결정하는 가장 중요한 역할을 한다. 멜라닌은 인체내의 분포도와 농도에 따라 유전적으로 결정되지만, 외부환경, 특히 현대의 환경오염, 지구온난화, 이산화탄소 배출량 증가에 따른 태양 자외선의 피부 침투량 증가, 피로누적 및 인체 내외적 스트레스 등 여러 가지 환경적 혹은 생리적인 요건에 따라 자외선이 피부에 노출되어 피부가 검게 된다.

피부가 자외선에 노출되면 멜라닌이 합성되는데, 멜라닌이 합성되는 과정은 피부 세포 내의 타이로신(tyrosine)을 기질로 타이로신을 산화시키는 티로시나제(tyrosinase)효소가 작용하여 도파퀴논(dopaquinone)을 형성, 산화되는 과정을 거치며 생성되는 메커니즘을 갖고 있다.

멜라닌이 합성, 방출되면 색소침착이 일어나 피부가 검게 되는데, 이러한 색소침착을 저해하기 위하여 멜라닌 생성과정 중 특정 메커니즘을 방해하여 멜라닌이 합성되는 과정 자체를 감소시키는 방법이 제안되고 있다.

그러나 티로시나제 효소가 작용하는 이전단계의 멜라닌 합성 유도 사이클은 아직까지 밝혀지지 않았으며, 피부색은 이외에도 카로틴, 혈액 등 여러 요인에 의해 결정된다.

또 다른 방법으로 상기의 색소침착 저해를 위한 미백제로서 하이드로퀴논(hydroquinone) 및 코지산(kojic acid) 등을 비롯한 화학적 화합물을 화장료 제형에 추가적으로 배합하여 미백이나 기미, 주근깨 등을 개선하고자 시도되고 있다.

그러나 종래 화학적 화합물을 이용한 미백제들로 배합한 화장품의 경우, 변색/변취, 피부 자극성과 빠른 산화로 인해 화장료 제형 적용에 어려움이 있고 이로 인해 사용에 많은 제한이 수반된다.

특히, 단순히 티로시나제를 저해시키기 위한 종래의 많은 화장료 미백원료는 독성과 안정성에 문제가 있어 사용에 제한적이며, 통용되는 미백원료가 충분히 우수한 미백효과를 제공하는 데에도 미흡하다.

이에, 미백 효능이 우수하면서도 화장료 배합 성분으로서의 안전성을 가지는 천연유래 한방 약재들에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

대한민국 공개특허 제2007-41927호는 복숭아 나무(Prunus persica(L.) BATSCH)의 꽃, 즉 도화 (Persicae flos)의 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물의 우수한 전자공여능, SOD 유사활성, 크산틴 산화효소 저해활성, 티로시나제 저해활성, 다양한 암세포주에 대한 증식 억제 효과를 통해 항산화, 항암, 미백활성을 보고하고 있다.

대한민국특허 제891986호에는 포공영, 산사, 삼릉, 청피 및 진피(귤껍질)를 혼합한 생약 추출물과 포공영, 대산(마늘), 생강(건강), 강황, 후박피 및 용뇌의 생약 분말을 함유하는 보습, 보온, 탄력 및 미백효과가 우수한 한방 화장료 조성물을 개시하고 있다.

또한, 대한민국특허 제519154호에는 동과자, 행인 및 도인 중 1종 이상의 추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하고 미백효과 및 콜라겐 생합성 촉진효과, 주름개선효과, 세포재생효과에 의한 우수한 피부 노화방지용 화장료 조성물을 개시하고 있다.

이에, 본 발명자들은 천연유래 한방 약재들의 유효물질 중에서 미백효과가 우수하고 화장품 배합성분으로서 안전성이 높으며 예부터 사용되어 임상적으로도 안전성이 증명된 한방 약재들 중에서 선별한 결과, 귤피, 도화 및 동과자로 이루어진 한방 약제성분을 함유한 복합추출물을 선정하고, 상기 복합추출물이 피부에 안전하면서도 우수한 미백 효과가 구현되는 최적조건을 안출함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 귤피, 도화, 동과자로 이루어진 한방 약재성분의 복합추출물이 유효성분으로 함유된 피부미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 귤피, 도화 및 동과자로 이루어진 한방 약재성분이 C₁∼C₄의 알코올류, C₁∼C₄의 글리콜류 및 정제수 중에서 선택되는 어느 하나의 추출용매에 의해 추출된 복합추출물이 유효성분으로 함유된 피부미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 복합추출물은 한약 약재성분과 추출용매가 1: 10 내지 1:200 혼합비율로 추출되며, 상기 복합추출물을 구성하는 귤피, 도화 및 동과자로 이루어진 한방 약재성분이 1∼5: 1∼5: 1∼5의 중량비율로 혼합되어 추출된 것이다.

본 발명의 피부미백용 화장료 조성물은 복합추출물의 농도가 1 내지 25중량%로 함유될 때, 세포독성이 없고, 우수한 멜라닌 억제효과를 구현한다.

이상의 복합추출물이 유효성분으로 함유된 피부미백용 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 영양크림 및 팩으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형으로 제공된다.

본 발명에 의한 피부미백용 화장료 조성물은 임상적으로 안전성이 증명된 한방 약재를 주성분으로 함유함으로써, 재료구입의 용이성과 피부에 안전한 화장료 조성물을 제공할 수 있다

특히, 본 발명의 귤피, 도화 및 동과자로 이루어진 한방 약제성분을 함유한 복합추출물을 유효성분으로 함유함으로써, 미백 효과가 뛰어나면서도 더욱이 멜라닌 세포 형성을 억제하여 피부의 색소 침착 현상을 예방하거나 개선효과를 얻을 수 있다.

도 1 은 본 발명의 한방 약재 복합추출물을 이용한 웨스턴블랏 실험을 통한 미백실험결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

본 발명은 귤피, 도화 및 동과자로 이루어진 한방 약재성분이 C₁∼C₄의 알코올류, C₁∼C₄의 글리콜류 및 정제수 중에서 선택되는 어느 하나의 추출용매에 의해 추출된 복합추출물이 유효성분으로 함유된 피부미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 한방 약재는 식품의약품안전청 공고 제2012-110 호 「생약 등의 잔류ㆍ오염물질 기준 및 시험방법」(식품의약품안전청 고시 2011-42호, 2011. 8. 22)에 준하는 시험을 진행하여 통과한 약재만을 사용한다.

구체적으로는, 본 발명에서 사용되는 한방 약재성분으로서, 귤피, 도화 및 동과자로 이루어진 한방 약제성분이 선정된다.

상기 귤피(橘皮)의 학명은 Citrus unshiu이고 운향과의 귤 또는 동속 근연식물의 성숙한 과피이다. 특이한 냄새가 있으며 약간 자극성을 띠고 맛은 맵고 쓰며 성질은 약간 따뜻하다. 경락에서 간장, 담, 위에 작용한다.

동의보감에는 "귤피의 성은 온이며 맛은 쓰고 맵다. 비장이 곡식을 잘 소화시키지 못하는 것을 치료한다. 달여 먹거나 가루내어 먹거나 다 좋다. 위기를 잘 통하게 하고 또 장위를 편안하게 한다. 국을 끓여서 늘 먹으면 좋다. 갑자기 못이 쉬어 목소리가 나오지 않는 것을 치료한다. 진하게 달여 즙을 짜서 자주 먹는다"고 기록되어 있다. 주요성분으로는 정유와 헤스페리딘(hesperidin) 등을 포함하고 있으며, 항산화 및 항균 효과가 알려져 있다.

특히, 귤피는 과육보다 비타민 C가 4배 가량 더 많다는 점에 착안하여 선정된 성분으로 바이오 플라보노이드 성분이 많다고 알려져 있다. 또한, 최근 미백 피부과학에 의하면, 대표적인 염증 물질인 IL-8(Interleukin-8)이 멜라노사이트를 자극하는 물질을 중화시킴으로써 멜라닌 생성을 억제시켜 근본적으로 건강하고 깨끗한 피부를 만드는데 도움을 준다고 알려져 있다.

도화(桃花)의 학명은 Prunus persica(L.) Batsch이고 쌍떡잎식물강 장미목 장미과에 속하는 복사나무의 꽃이다.

우리나라 북부 고원지를 제외한 전국에 분포하며 개화는 4~5월경이고 꽃의 색깔은 연홍색이다. 꽃잎은 5개의 원형이며 받침잎은 난형이다. 맛은 쓰고 평하며 심장, 간장, 대장의 경락에 작용한다.

동의보감에는 "대소변을 잘 나오게 한다. 꽃이 떨어질 때 주워서 그늘에 말려 가루낸 다음 물에 타서 먹는데 대소변이 나오지 않는 것을 치료하는 데는 바로 효과가 있다"고 기록되어 있다. 또한 본초에는 "얼굴빛이 고와지게 하고, 화색이 돌게 한다. 술에 담가 두고 그 술을 마셔도 된다. 얼굴에 생긴 부스럼에서 누런 진물이 나오는 데는 복숭아꽃을 가루로 내어 한번에 4g씩 하루 3번 물에 나서 먹는다"고 기록되어 있다. 주요성분으로는 켐페롤(kaempferol)과 그 배당체, 3염기산과 디옥시1염기산 등을 포함하고 있으며, 항산화 및 항염증 효과가 있다고 알려져 있다(중국경 제식물지 1751, 1961년; 일본의학중앙잡지 178권, pp782, 1962년).

동과자(冬瓜子)의 학명은 Benincasa cerifera Savi.이고 박과의 동과의 씨를 말한다. 특이한 냄새가 있고 맛은 달고 차가운 성질을 가지며 간장의 경락에 귀속한다.

본초강목에는 "환자의 안색을 좋게 하고 기운을 북돋으며 배가 고프지 않게 한다. 오랫동안 복용하면 몸이 가벼워지고 잘 늙지 않는다"고 기록되어 있다. 별록에서는 "가슴이 답답하고 우울한 증상을 치료한다. 화장품을 만들 수도 있다"고 기록되어 있다. 동과자에는 펙틴(pectin)과 리놀산(linolic acid), 약 1%의 사포닌 등이 포함되어 있다.

이상의 한약 약재성분은 C₁∼C₄의 알코올류, C₁∼C₄의 글리콜류 및 정제수 중에서 선택되는 어느 하나의 추출용매에 의해 추출되고, 이때, 한약 약재성분과 추출용매가 1: 10 내지 1:200 혼합비율로 추출된다.

추출용매의 바람직한 일례로는 정제수, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜 및 글리세린으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나가 사용될 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 추출용매로서 70% 에탄올, 부탄올, 부틸렌글리콜 또는 정제수를 사용하여 설명하고 있으나, 이에 한정되지 아니할 것이고, 단일 추출용매하에서 추출공정이 수행된다.

또한, 귤피, 도화 및 동과자로 이루어진 한방 약제성분에 대하여, 상기 추출용매를 이용하여 상온에서 추출하고 상기 추출물을 여과포, 여과지 및 감압여과장치 중에서 선택된 하나 이상의 장치로 여과하고, 동결건조하는 공정을 통해, 귤피, 도화 및 동과자로 이루어진 복합추출물을 수득할 수 있다. 이때, 추출공정은 추출용매에 따라 다르나, C₁∼C₄의 알코올류 추출용매를 사용할 경우, 상온에서 3일 내지 5일 주기로 적어도 3회 이상 수행한다.

또한, C₁∼C₄의 글리콜류 추출용매를 사용할 경우에는 상온에서 5일 내지 10일 이내로 방치하여 추출하는 것이 바람직하다.

정제수를 추출용매로 사용할 경우는 80 내지 100℃ 온도에서 5시간 이내로 추출한다.

이상의 추출공정이후 여과하여 고형분을 제거하고 얻어진 추출액을 동결건조하여 한방 약재성분의 복합추출물을 얻을 수 있다.

상기 귤피, 도화 및 동과자는 적당한 중량비(wt / wt / wt)로 혼합될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 복합추출물을 구성하는 귤피, 도화 및 동과자로 이루어진 한방 약재성분은 각각 1∼5: 1∼5: 1∼5의 중량비율로 혼합되어 추출될 수 있다.

상기와 같이 제조된 한방 약재성분의 복합추출물은 선정된 한방 약재성분을 혼합하여 단일 추출용매조건에서 추출한 것으로서, 상기 얻어진 복합추출물을 10중량%, 7.5중량%, 5중량% 및 2.5중량%의 농도별 세포독성실험결과, 5% 이하의 농도조건에서 세포독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있다[표 1].

또한, 상기 얻어진 복합추출물을 5중량%, 2.5중량% 및 1.25중량%의 농도별 멜라닌 생성 억제 효과를 측정한 결과, 5%이하, 더욱 바람직하게는 2.5 내지 5% 농도조건에서 멜라닌 생합성을 억제하는 효과를 확인함으로써, 우수한 미백효과를 제공할 수 있다[표 2].

이상으로부터, 본 발명의 피부미백용 화장료 조성물에는 귤피, 도화 및 동과자로 이루어진 한방 약제성분의 복합추출물이 5 중량% 이하의 농도로 함유될 때, 피부 안전성과 우수한 미백 효과가 최적화됨을 구체적으로 설명하고 있으나, 우수한 미백 효과를 구현하는 복합추출물의 농도는 1 내지 25중량% 농도범위까지 함유될 수 있다.

또한, 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 한방 약재 복합추출물을 이용한 멜라닌 에세이를 통한 미백실험(melanin assay, western blotting)을 통하여 미백 효과를 확인할 수 있다.

본 발명은 이상의 한방 약재 복합추출물을 유효성분으로 함유한 피부미백용 화장료 조성물은 그 제형에 첨가하는데 있어 특별히 한정되지 않으나, 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 영양크림 및 팩으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형의 실시형태를 제공한다.

이외에도, 스틱형, 분무형, 패취형 화장료의 제형으로 제공될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.

본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 한방 약재 복합추출물 제조 1

건조된 귤피, 도화 및 동과자를 적당량으로 혼합한 혼합물 12g에 70% 에탄올 240g (1:20 비율 wt/wt)를 넣고 상온에서 5일 주기 3번 추출하였다.

추출이 끝난 후 380메시(mesh) 여과포로 약재를 거르고, 11㎛ 페이퍼 필터(Whatman paper No.1)로 여과한 후, 전체 여과물을 0.45㎛ 멤브레인 필터(TF-450, 60173, PALL Life Sciences)를 이용하여 감압 여과장치에서 여과하고 최종 추출물을 획득하였다.

< 실시예 2> 한방 약재 복합추출물 제조 2

건조된 귤피, 도화 및 동과자를 적당량으로 혼합한 혼합물 12g에 부틸렌글리콜 240g (1:20 비율 wt/wt)을 넣고 상온에서 10일 방치하여 추출하였다.

< 실시예 3> 한방 약재 복합추출물 제조 3

건조된 귤피, 도화 및 동과자를 적당량으로 혼합한 혼합물 12g에 정제수 240g(1:20 비율 wt/wt)를 넣고 80℃에서 5시간 열수추출하였다.

< 실시예 4> 한방 약재 복합추출물 제조 4

건조된 귤피, 도화 및 동과자를 적당량으로 혼합한 혼합물 12g에 부탄올 240g(1:20 비율 wt/wt)를 넣고 상온에서 3일 주기 3번 추출하였다.

< 실시예 5> 한방 약재 복합추출물 제조 5

건조된 귤피, 도화 및 동과자를 적당량으로 혼합한 혼합물 12g에 70% 에탄올 480g(1:40 비율 wt/wt)을 넣고 상온에서 3일 주기 3번 추출하였다.

< 실시예 6> 한방 약재 복합추출물 제조 6

건조된 귤피, 도화 및 동과자를 적당량으로 혼합한 혼합물 12g에 부틸렌글리콜 480g(1:40 비율 wt/wt)을 넣고 상온에서 10일 방치하여 추출하였다.

<실시예 7> 한방 약재 복합추출물 제조 7

건조된 귤피, 도화 및 동과자를 적당량으로 혼합한 혼합물 12g에 정제수 480g(1:40 비율 wt/wt)를 넣고 80℃에서 5시간 열수추출하였다.

< 실시예 8> 한방 약재 복합추출물 제조 8

건조된 귤피, 도화 및 동과자를 적당량으로 혼합한 혼합물 12g에 부탄올 480g(1:40 비율 wt/wt)을 넣고 상온에서 5일 주기 3번 추출하였다.

< 실시예 9> 한방 약재 복합추출물 제조 9

건조된 귤피, 도화 및 동과자를 적당량으로 혼합한 혼합물 12g에 70% 에탄올 240g(1:20 비율 wt/wt)을 넣고 상온에서 3일 주기 3번 추출하였다.

< 실시예 10> 한방 약재 복합추출물 제조 10

건조된 귤피, 도화 및 동과자를 적당량으로 혼합한 혼합물 12g에 부틸렌글리콜 240g(1:20 비율 wt/wt)을 넣고 상온에서 5일 방치하여 추출하였다.

< 실시예 11> 한방 약재 복합추출물 제조 11

건조된 귤피, 도화 및 동과자를 적당량으로 혼합한 혼합물 12g에 정제수 1200g(1:100 비율 wt/wt)를 넣고 80℃에서 5시간 열수추출하였다.

< 실시예 12> 한방 약재 복합추출물 제조 12

건조된 귤피, 도화 및 동과자를 적당량으로 혼합한 혼합물 12g에 부탄올 240g(1:20 비율 wt/wt)을 넣고 상온에서 3일 주기 3번 추출하였다.

< 실험예 1> 세포독성 측정

상기 실시예 1 내지 12의 방법으로 수득한 추출물의 세포독성을 측정하기 위하여, B16F1(mouse melanoma cell)을 적정 농도로 소혈청 10%와 항생제 1%가 포함된 DMEM/high glucose(Dubeco's Modified Eagle Medium, Hyclone)를 이용한 배지를 이용하여 96-웰 플레이트에 200㎕씩 나누어 넣고 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후 시료를 처리하였다. 이때, 시료는 상기 실시예의 한방 약재 복합 추출물을 DMSO(Dimethyl sulfoxide, Wako)에 용해시킨 후, 농도별로 희석하여 사용하였다. 배양이 완료되면, 배양액 제거 후 플레이트에 중성의 적색시약을 넣은 배양액을 첨가해 37℃에서 2시간 배양하고, 완료 후에 배양액을 제거하고 1% CaCl₂및 1% 포름알데히드 0.1㎖로 1분간 수세 처리하고 용액을 제거한 후 1% 아세트산과 1% 포름알데히드 0.1㎖을 넣고 5분간 반응시킨 후 계수기(Micro plate reader)를 사용하여 570㎚/655㎚의 흡광도를 측정하여 결과값을 산출하였다.

하기 표 1에 결과를 표기하였으며, 표 1에서 대조구는 본 발명의 추출물을 넣지 않은 블랭크를 의미한다.

상기 표 1의 세포독성실험 결과, 실시예 1 내지 12의 추출물은 5%이하의 농도에서 세포독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.

< 실험예 2> 멜라닌 생성 억제 효과 측정

상기 실시예 1 내지 12의 방법으로 수득한 추출물에 대한 멜라닌 생성 억제 효과를 측정하였다.

구체적으로는 B16F1 멜라노마 셀(melanoma cell)을 소혈청 10%와 항생제 1%가 첨가된 DMEM/high glucose(Dulbeco's Modified Eagle Medium Hyclone)에서 배양하고, 96-웰 플레이트에 적정 농도로 분주 후 37℃에서 5% CO₂조건으로 24시간 배양한 후 실시예 4와 알부틴을 하기 표기된 농도의 시료로 B16F1 멜라노마 셀의 배양액에 넣어 3일 배양하였다. 동시에, 멜라닌 합성을 유도하기 위하여 a-MSH(melanicyte stimulating hormone) 처리 후, 상기 시료를 처리하지 않은 경우와 알부틴(arbutin)을 양성 대조군으로 실험하였다.

알부틴은 멜라닌 합성을 억제하는 효과를 나타내는 것으로 알려져 있어 대조군으로 사용하였다. 72시간 배양 후 플레이트 내 배양액을 제거하고 1×PBS(phosphate buffered saline)로 2회 세척 후 트립신(trypsin) 처리하였다. 37℃ CO₂배양기에서 5분간 배양한 후 세포를 회수하고 각각의 웰에 배양액을 처리한 후, 2㎖ 마이크로튜브(microtube)에 옮겼다. 그리고 10분간 원심분리 후 배양액을 제거, 1×PBS 1㎖ 처리 후 다시 원심분리를 통해 세척하였다. 세척 후에, 1×PBS를 제거하고 건조기에서 건조 후 튜브에 1N NaOH와 10% DMSO용액으로 400㎕씩 처리하였다. 이를 건조 후에 1,000rpm으로 약 10분간 흔들어주어 96-웰 플레이트에 옮겨 마이크로플레이트 계수기를 이용 490㎚/655㎚ 에서의 흡광도를 측정하여 결과값을 얻었고 값은 아래의 표 2와 같다.

상기 표 2에서 확인된 바와 같이, 실시예 1 내지 12의 추출물의 농도 5%와 2.5%의 경우 B16F1 멜라노마 세포 내 멜라닌 생합성을 억제하는 효과를 확인함으로써, 미백 효과가 우수함을 알 수 있었다.

< 실험예 3> 웨스턴 블럿 실험

상기 실험예 2의 추출물을 이용하여, 멜라닌 생합성을 매개하는 티로시나이제의 단백 발현에 미치는 효과를 알아보기 위하여 웨스턴 블럿 분석을 실시하였다. 구체적으로는 실험예 2에서 수득한 멜라노마 세포를 계대 배양하였다. 즉, B16F1 멜라노마를 10% FBS-DMEM에 배양하고 이를 취하여 적정 농도 세포액을 조제하였다. 이를 6-웰 플레이트에 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양시켰다.

24시간 배양 후, 배지 제거 후 배지 1.8㎖과 농도별 시료 200㎕을 혼합한 뒤, 다시 동일 조건에서 72시간 배양시켰다. 블랭크의 경우, 배지만을 넣었다. 72시간 배양 후, 각 플레이트 내의 세포를 회수하기 위하여 트립신(trypsine-EDTA) 용액 200㎕씩 넣고 세포를 분리하여 마이크로튜브에 획득한 뒤 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 분리된 펠렛을 1×PBS(-)로 1회 세척하고 원심분리 한 후, 펠렛에 PRO-PREP^TM Protein Extract Solution(Intron, Inc.)을 400㎕씩 처리하여 -20℃에서 15분 반응시킨다. 원심분리 진행 후, 상등액을 튜브로 옮겨 -20℃에 보관하였다. 상기 방법으로 정제한 단백질을 8% SDS-PAGE를 이용 전기영동을 실행하고 이를 PVDF 막으로 이전하였다.

5% 스킴 밀크(skim milk)가 함유된 트리스 완충용액에서 1시간 블록킹(blocking) 과정을 거친 후에 티로시나아제, TRP-1, TRP-2, B-액틴(actin) 항체와 각각 반응시켰다. 반응 후, 효소(Horseradish peroxidase, HRP)가 결합된 항체를 가하고, Immobilon^TMWestern Chemiluminescent HRP Substrate(Millipore)를 사용하여 일정 시간 동안 반응시켜 X-ray 필름을 이용하여 현상하였다. 그 결과를 도 1에 기재하였다.

도 1의 결과로부터, 실험예 2의 추출물을 2.5% 및 1.25% 농도로 처리한 그룹에서 대조군에 비해 티로시나제와 TRP-1, TRP-2의 단백질 발현이 억제됨을 확인하였다.

< 처방예 1> 유연화장수의 제조

상기 실시예 2의 추출물을 유효성분으로 함유하는 유연화장수 제형의 처방예는 하기 표 3과 같다.

실시예 2의 추출물 함량은 상기 표 1에서 나타난 바와 같이 세포 독성을 나타내지 않는 최대 농도를 기준으로 한다. 더욱 구체적으로, 소듐히알루로네이트는 정제수에 프로펠러믹서 3000rpm으로 분산시켜 1중량% 농도로 준비하였다. 수상 용해조에 원료 1 내지 8을 프로펠러믹서 500rpm으로 균일화한 후, 75℃까지 가온하여 완전 용해 시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 별도의 용해조에 원료 9 내지 11을 완전 용해하여 상기 수상 용해조에 투입한 후, 교반과 동시에 혼합하였다. 여기에 실시예 2의 추출물을 투입하여 충분하게 교반 혼합하여 미백 화장용 유연화장수를 제조하였다.

< 처방예 2> 영양화장수의 제조

상기 실시예 2의 추출물을 유효성분으로 함유하는 영양화장수 제형의 처방예는 하기 표 4과 같다.

실시예 2의 추출물 함량은 상기 표 1에서 나타난 바와 같이 세포 독성을 나타내지 않는 최대 농도를 기준으로 한다. 하기 표 4에서 카보머는 정제수에 프로펠러믹서 4000rpm으로 분산하여 2중량% 용액으로 준비하였다. 수상 용해조에 원료 1 내지 6을 투입하여 호모 2000rpm으로 교반 분산 후, 75℃까지 가온하였다. 유상 용해조에 원료 7 내지 13을 투입한 후, 75℃까지 가온하며 용해하였다. 수상 용해조에 용해된 유상을 투입하고 유화(3000 rpm/5분)시킨 후에 실온으로 냉각하였다. 여기에 실시예 2를 투입하여 충분하게 교반 혼합하여 미백 화장용 영양화장수를 제조하였다.

< 처방예 3> 에센스의 제조

상기 실시예 2의 추출물을 유효성분으로 함유하는 에센스 제형의 처방예는 하기 표 5과 같다. 실시예 2의 추출물 함량은 상기 표 1에서 나타난 바와 같이 세포 독성을 나타내지 않는 최대 농도를 기준으로 한다.

구체적으로 하기 표 5에서 소듐히아루로네이트, 히드록시에칠셀룰로이즈는 정제수에 프로펠러믹서 2000rpm으로 용해 분산하여 1중량%로 준비하였다. 카보머는 정제수에 프로펠러믹서 4000rpm으로 분산하여 2중량%로 준비하였다. 수상 용해조에 원료 1 내지 12를 투입, 호모를 2000rpm으로 교반하여 분산한 후, 75℃까지 가온하고 가온된 수상을 실온으로 냉각하였다. 별도의 용해조에 원료 13 내지 15를 완전 용해시킨 후에 상기 수상 용해조에 서서히 투입하여 교반 혼합하였다. 여기에 실시예 2를 투입하여 충분하게 교반 혼합하여 미백 화장용 에센스를 제조하였다.

< 처방예 4> 영양크림의 제조

상기 실시예 2의 추출물을 유효성분으로 함유하는 영양크림 제형을 제조하였다. 구체적으로 표 6과 같이 수상 용해조에 원료 1 내지 8을 투입하여 호모 2000rpm으로 분산한 후, 75℃까지 가온하였다. 유상 용해조에 원료 9 내지 16을 투입하여 80℃까지 가온 용해한 후, 수상 용해조에 용해된 유상조를 서서히 투입하여 유화(3000rpm/10분)시킨 후, 실온으로 냉각하였다. 여기에 실시예 2의 추출물을 투입하여 충분하게 교반 혼합하여 미백 화장용 영양크림을 제조하였다.

< 실험예 4> 피부 미백 효과 시험

상기 in vitro 실험에서 나타난 미백 효과가 실제적으로 사람의 피부 미백에 도움을 주는지 확인하기 위하여, 실시예 2의 추출물이 함유된 영양크림(처방예 4)에 대하여 인체 적용시험을 실시하였다.

로보스킨 분석기(Roboskin analyser) 장비를 이용한 피부 미백 시험은 피시험자의 얼굴 부위에 시료 또는 제품을 적용하면서 주기적으로 색소 침착 및 피부톤(밝기)의 개선 효과를 평가하였다. 시험은 역시 피부 미백 개선 시험과 동일하게 수행되었으며 따라서, 피시험자 10명(대조구 5명, 시험구 5명)으로 진행되고 모두 여성으로, 연령은 평균 34세로 구성되었다. 역시 사용 전, 사용 후 1주, 2주, 4주, 6주의 총 5회 측정하여 평균값을 구하였으며 모든 시험은 20∼24℃, 습도 45∼55%인 항온항습실에서 진행되었고 세안 후 항온항습실에서 최소 1시간 이상 적응시킨 후 측정하였다.

상기 실시예 2의 추출물이 함유된 영양크림인 처방예 4에 대한 피부 미백 효과를 측정한 결과, 1주차부터 색소침착(대, 소)이 감소되는 경향을 나타내었으며 피부 밝기 또한 밝아지는 것을 알 수 있어 피부 미백에 도움을 주는 것을 확인하였다.

이상 실험예에서 확인된 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 2의 추출물은 미백 효과를 지니고 있으며, 이를 포함하여 제조한 화장료 조성물 역시 미백 효과를 기대할 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 임상적으로 안전성이 증명된 한방 약재 중에서 귤피, 도화 및 동과자의 한방 약재성분의 복합추출물을 선정하고, 상기 한방 약재성분의 농도별 복합추출물로부터 멜라닌 생성 억제 효과 및 티로시나제 발현 억제 효과를 최적으로 구현한 피부미백용 화장료 조성물을 제공하였다.

또한, 본 발명은 상기 한방 약재성분의 복합추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공함으로써, 우수한 피부 미백효과를 구현하는 다양한 제형의 피부 미백효능의 기능성 화장품에 제공할 수 있다.

이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims

귤피, 도화 및 동과자로 이루어진 한방 약재성분이 C₁∼C₄의 알코올류, C₁∼C₄의 글리콜류 및 정제수 중에서 선택되는 어느 하나의 추출용매에 의해 추출된 복합추출물이 유효성분으로 함유된 피부미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 한약 약재성분과 추출용매가 1: 10 내지 1:200 혼합비율로 추출된 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 귤피, 도화 및 동과자로 이루어진 한방 약재성분이 1∼5: 1∼5: 1∼5의 중량비율로 혼합된 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 복합추출물이 1 내지 25중량%의 농도로 함유된 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 복합추출물이 유연화장수, 영양화장수, 에센스, 영양크림 및 팩으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형에 유효성분으로 함유된 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.