JP7412811B2 - 2,5-ジホルミルフランに富むモリンガ・ペレグリナ種子抽出物、それを得るための方法、及び美容用品組成物におけるその使用 - Google Patents
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Description
a)モリンガ・ペレグリナの殻付き種子を収集し、乾燥させて、内部水分含量を8%未満とする工程と、
b)乾燥させた種子をプレスして、油を種子の残りの部分から分離させて固形物を得る工程と、
c)工程b)で得られた固形物を粉砕する工程と、
d)工程c)で得られた粉砕された物質を、主にアルコールを含む溶媒中に、使用される総重量に対して固体物が約25重量%となる割合で分散させる工程であって、ここで、アルコールは、ポリオール又は亜臨界水などの共溶媒をオプションで含むエタノール又はメタノールから選択され、溶媒の総重量に対してアルコールが80重量%から100重量%の割合である、工程と、
e)16℃から30℃の温度で約2時間、撹拌しながら固液抽出を行う工程と、
f)固相を除去して液体モリンガ・ペレグリナ固形物抽出物を回収するように、液相と固相を分離させる工程と、
g)オプションで、得られた液体モリンガ・ペレグリナ抽出物を、固体モリンガ・ペレグリナ抽出物が得られるように乾燥させる工程と、を含む。
・MTT:3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT試験は生細胞をカウントするための迅速な方法である)
・SDS:ドデシル硫酸ナトリウム
・PBS:リン酸緩衝生理食塩水
・ELISA:酵素免疫測定法
・PCR:ポリメラーゼ連鎖反応
・ANOVA:分散分析
・MSH:メラノサイト刺激ホルモン
・「化合物2,5-ジホルミルフランに富む抽出物」:化合物2,5-ジホルミルフランの量が、他の同定された成分の量よりも多い、すなわち、全抽出物の乾燥物に関して50%を超える量である抽出物。
・「有効量」:所望の結果を得るため、すなわち、特に皮膚の細胞外マトリックスの保護を可能にするために必要な活性分子の量。
・「局所適用」:本発明による活性成分又はこれを含有する組成物を、皮膚、粘膜又は外皮の表面上に適用する又は広げること。
・「生理学的に許容される」:毒性、不適合性、不安定性又はアレルギー反応のリスクなしに、ヒトの皮膚と接触させる局所的使用、又は他の投与経路を介する使用、例えば経口又は皮膚への注入に適している。
・「固形物(tourteau)」:プレス後の種子の脱油部分。これは、種子から油を抽出した際の固体残留物である。これは、油を生産する工程である粉砕作業の副産物である。これは通常は種子の質量の50%から75%である。
・「殻付き種子」:採取した種子の殻又は果皮が実の周囲に維持されていることを意味する。
・「果実が熟したとき」:果実が熟していることを意味し、優先的には、鞘が裂開の開始時にあって暗いベージュ色から茶色に変わり、鞘の下側4分の1が180°ねじれることで弁が開こうとするときを意味する。
・「主にアルコールを含む溶媒」:96°純粋エタノールが最も適したアルコール溶媒であるとみられることを考慮し、アルコールタイプの溶媒が、活性成分を抽出するのに十分な特性を有する共溶媒を含んでもよいことを意味する。
・「約」:所与の情報(持続時間、パーセンテージなど)に対するプラス又はマイナス10%から20%のマージン。
・「活性分子」(「活性成分」とも呼ばれる):モリンガ・ペレグリナ種子から本発明の方法にしたがって抽出された2,5-ジホルミルフラン分子。この分子は、本発明に記載される生理活性の原因となる。
・「活性剤」:記載される生理活性を得るのに十分な量の本発明による抽出物。抽出物が液体であるか又は乾燥されたものであるか、濃縮されたものであるか又はその他であるかに応じて、活性剤の量は、組成物の総重量に対して0.002重量%から20重量%の割合で変わり得る。
・「皮膚の老化のサイン」:老化による皮膚及び外皮の外観のあらゆる変化、例えば、しわや細かい線、しなびた皮膚、たるんだ皮膚、薄くなった皮膚、皮膚の弾力性及び/若しくはトーンの欠如、鈍くつやのない皮膚、皮膚の色素沈着斑、毛髪の変色、又は爪のステイン、並びに変化した外観によって組織的に反映されない皮膚のあらゆる内部変化、例えば、紫外線(UV)照射への暴露後の皮膚のあらゆる内部劣化。
a)モリンガ・ペレグリナの殻付き種子を収集し、乾燥させて、内部水分含量を8%未満とする工程と、
b)乾燥させた種子をプレスして、油を種子の残りの部分から分離させて固形物を得る工程と、
c)工程b)で得られた固形物を粉砕する工程と、
d)工程c)で得られた粉砕された物質を、主にアルコールを含む溶媒中に、使用される総重量に対して固体材物質が約25重量%となる割合で分散させる工程であって、アルコールは、ポリオール又は亜臨界水などの共溶媒をオプションで含むエタノール又はメタノールから選択され、溶媒の総重量に対してアルコールが70重量%から100重量%となる割合である、工程と、
e)16℃から30℃の温度で約2時間、撹拌しながら固液抽出を行う工程と、
f)固相を除去して液体モリンガ・ペレグリナ固形物抽出物を回収するように、液相と固相を分離させる工程と、
g)オプションで、アルコールがエタノールである場合、得られた液体モリンガ・ペレグリナ抽出物を、固体モリンガ・ペレグリナ抽出物が得られるように乾燥させる工程と、を含む。
DPPH溶液を、本発明によるペレグリナ抽出物(T+)の非存在下(対照)又は存在下で、そして試験サンプルの濃度を減少させて、40℃で30分間インキュベートする。インキュベーション期間の終わりにおいて、参照製品の存在下と、ペレグリナ抽出物の存在下若しくは非存在下とでの抗酸化活性が、40℃で30分後に染色することによって明らかにされた。したがってそれは、540nmでの反応媒体の吸光度を測定することによって評価された。試験された各濃度について、試験製品による抗酸化活性の調節が、以下の式にしたがって計算された。
抗酸化活性のパーセンテージ調節=100×[(OD540対照-OD540試験製品)/OD540参照製品]
本発明によるペレグリナ抽出物は、フリーラジカルからの保護が可能であり、1%以上の濃度で有意な抗酸化特性を有する。
試験される本発明によるペレグリナ抽出物の非存在下又は存在下で、I型コラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼ酵素の溶液をその基質中で5分間インキュベートする。次いで、溶液を色原体ニンヒドリンと接触させ、続いて、80℃で15分間インキュベートする。インキュベーション期間の終わりにおいて、試験又は参照製品を含む及び含まないコラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼ酵素の活性が、565nmでの反応媒体の吸光度を測定することによって評価された。試験された各濃度について、コラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼ酵素活性の試験製品による調節が、以下の式にしたがって計算された。
コラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼ酵素活性のパーセンテージ調節=100×[(OD試験又は参照製品-ODコラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼのみ)/ODコラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼのみ]
本発明によるペレグリナ抽出物は、0.01%という非常に低いレベルで、62%という強力なメタロプロテアーゼ(コラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼ)阻害を引き起こす。本発明によるペレグリナ抽出物は、これらのメタロプロテアーゼを強力に阻害することができ、皮膚の細胞外マトリックスを大効率で保護するための良好な潜在能力を有し、そして、この阻害を介してアンチエイジング効果を示す。
参照製品の非存在下(対照)若しくは存在下で、又は濃度を増加させた試験製品の非存在下若しくは存在下で、サーチュイン酵素の溶液をその基質中で20分間インキュベートする。本発明によるペレグリナ抽出物を、2%、1%、0.1%(V/V)の濃度で試験する。インキュベーション期間の終わりにおいて、試験又は参照製品を含む及び含まないサーチュイン酵素の活性が、現像剤溶液を用いて染色する(37℃で10分間)ことによって明らかにされ、405nmでの反応媒体の吸光度を測定することによって評価された。試験された各濃度について、ヒストン脱アセチル化酵素及びサーチュインI酵素の脱アセチル化活性の試験製品による調節が、以下の式にしたがって計算された。
サーチュイン酵素活性のパーセンテージ調節=100×[(OD405試験又は参照製品)-(OD405HDAC及びサーチュインIのみ)]/OD405サーチュインのみ
本発明によるペレグリナ抽出物は、2%において有意なHDAC阻害を示し、この阻害は、特に老化プロセスに関連する遺伝的浮動に対する皮膚細胞の自己保護を促進する能力を反映する。このように、抽出物は皮膚表面の共通遺伝的浮動の1つ、すなわち「スキンタッグ」(線維性突起)の出現によって現れる線維症に対して有用であるとみられる。抽出物は、有利には、皮膚表面上の線維症を防ぎ、したがって、皮膚老化を防止することができる。
酵素ホスホリパーゼA2の溶液を、その基質であるジヘプタノイルチオ-PC中で、参照阻害剤の存在下若しくは非存在下で、及び2%、1%、0.1%(V/V)の条件下で試験される本発明によるペレグリナ抽出物の存在下若しくは非存在下でインキュベートし、次いで、色原体DTNBを取り込み、その後25℃で15分間インキュベートし、インキュベーション期間の終わりにおいて、試験製品又は参照製品の存在下及び非存在下での酵素ホスホリパーゼA2の活性を、413nmで反応媒体の吸光度を測定することによって評価する。試験された各濃度について、試験製品によるホスホリパーゼA2酵素活性の調節が、以下の式にしたがって計算された。
ホスホリパーゼA2酵素活性のパーセンテージ調節=100×[(OD405試験製品又は参照製品-OD405sPLA2のみ)/OD405sPLA2のみ]
本発明によるペレグリナ抽出物は、0.1%以上、より好ましくは1%又は2%の投与量でPLA2のわずかな、安定した阻害を生じる。これは、本発明によるペレグリナ抽出物がアラキドン酸カスケード/炎症カスケードを非常に早期に減少させる能力を有することを意味し、したがって、この抽出物は、皮膚に対する良好な鎮静又はリラクゼーションの可能性を有する。
ヒト微小血管内皮細胞はPELOBiotech社から提供され、サプライヤーの生成手順にしたがって96ウェルプレート中で培養される。抽出物は、80%コンフルエンス状態で24時間、種々の濃度で内皮細胞に作用させたままにし、次いで、細胞上清中のエンドセリン-1が、PicoKine ELISAキット(EDN1)を使用して定量化される。エンドセリン-1測定で使用する非毒性投与量を決めるために事前に生存率試験が行われる。陰性対照は培地中の細胞を処理せず用いて行われる。生存率試験における陽性対照は0.5%SDSである。全条件が培地中で準備され、続いて細胞が36.5℃、5%CO2で24時間インキュベートされる。
試験製品を、96ウェルプレート内でサブコンフルエント状態の内皮細胞に接触させる。各濃度について、試験は3つのウェルで行う。プレートを36.5℃、5%CO2で24時間±1時間インキュベートする。
b)生存率試験
細胞生存性を、製品とともにインキュベートさせた後の細胞についてMTT法を用いて評価する。24時間のインキュベーション後、上清を回収し、測定用に-20℃で保存する。次いで、ウェルを200μLのPBSで1回洗浄する。0.5mg/mLのMTT溶液を各50μLウェルに加え、36.5℃、5%CO2で3時間インキュベートする。100μLのイソプロパノールを各ウェルに加える。均等化後、550nmでの吸光度読み取り値を取得する。各条件について、陰性対照の平均光学濃度値に対する細胞の平均光学濃度値の比によって、生存率が決定される。
c)エンドセリン-1測定
測定は、ELISAキットを用いて行う。
処理の終わりにおいて行われる生存率試験は、試験された濃度について、いかなる毒性効果も示さなかった。エンドセリン-1測定は細胞上清中において非毒性濃度で行う。各条件についてのエンドセリン-1の量はELISAキットを使用して測定される。陰性対照細胞については、値は134.94pg/mLのオーダーである。様々な濃度の抽出物で処理された細胞について、値は、63.14pg/mL(本発明による抽出物は5%)から101.06pg/mL(本発明による抽出物は0.1%)であり、これは、本発明による抽出物が0.1%以上のとき1型エンドセリン生成が約25%阻害されるという非常に有意な阻害を示し、本発明による抽出物が5%のときには最大53%阻害されることを示す。
49歳のドナーからヒトケラチノサイトを得た。実験を行うために、ケラチノサイトを低い継代レベル(すなわち、細胞単離継代数2回)にて使用した。細胞は、実験に使用される前に、約75%コンフルエント状態に達するまで単層として増殖させた。
100ng/mLのFK228をテロメラーゼ1活性の参照誘導物質として使用した。
細胞は、参照製品の非存在下(対照)若しくは存在下で、又は、0.5%、1%及び5%(v/v)の増加させた濃度の本発明によるペレグリナ抽出物のような試験化合物の非存在下若しくは存在下で、24時間、インキュベートした。本発明によるペレグリナ抽出物をインキュベーション培地中で直接希釈して、上記の種々の濃度を達成する。
- 蛋白質測定
インキュベーション期間の終わりにおいて、細胞の総タンパク質を細胞から抽出し、分光比色法(Bradford法)によって測定した。この測定値を用いて、テロメラーゼ活性測定に用いる抽出物の正確な量を決定し、これにより、PCR工程で試験するすべての条件について同量のタンパク質(テロメラーゼを含む)を維持する。
- テロメラーゼ活性の測定
インキュベーション期間の終わりにおいて、細胞からテロメラーゼを抽出し、その活性を特定感受性キットによって決定した。テロメラーゼキットの原理は、テロメラーゼ伸長生産物の量を半定量的に測定するために、PCR工程(この工程においてテロメラーゼがその伸長作用に関して機能する)をELISA工程と結合することによってテロメラーゼ活性を測定するというものである。
- 統計
結果は、テロメラーゼ活性レベル(平均値±S.D)について任意の単位で表す。「賦形剤」と「参照製品」の間の有意水準はスチューデントt検定(*:p<0.05)によって評価した。なお、「対照」と「試験化合物」の間の有意水準は製品ごとに一元配置分散分析(一元配置ANOVA)の後、Holm-Sidak検定(*:p<0.05)を行って、それぞれ独立して評価した。
0.5%及び1%(v/v)で試験した本発明によるペレグリナ抽出物は、「対照」と比較して、テロメラーゼ活性を有意に調節しなかった。5%(v/v)で試験した場合、本発明によるペレグリナ抽出物は、「対照」と比較して、テロメラーゼ活性を18.9%有意に増加させた(p<0.001)。
100ng/mLで試験した「FK228」と称される参照製品は、テロメラーゼ活性を28.0%有意に増加させた(p<0.01)。この結果は予測されたものであり、実験を有効性のあるものとする。テロメラーゼ活性の活性化についての結果を以下に示す。
0.5%及び1%(v/v)で試験した本発明によるペレグリナ抽出物は、「対照」と比較して、テロメラーゼ活性を有意に調節しなかった。5%(v/v)で試験した場合、本発明によるペレグリナ抽出物は、「対照」と比較して、テロメラーゼ活性を18.9%有意に増加させた(p<0.001)。本発明による抽出物は、染色体の末端に保護テロメアを蓄積するこの酵素経路に直接作用し、遺伝物質の自然な老化を遅らせる。したがって、本発明による抽出物は染色体に対してアンチエイジング効果をもたらすことができる。
チロシナーゼ酵素の溶液を、その基材L-チロシン中で、参照製品の非存在下(対照)若しくは存在下で、又は増加する濃度(2%、1%、0.1%(V/V))の本発明によるペレグリナ抽出物の非存在下若しくは存在下で、60分間インキュベートする。インキュベーション期間の終わりにおいて、試験又は参照製品を含む及び含まないチロシナーゼ酵素の活性を475nmでの反応媒体の吸光度を測定することによって評価した。試験された各濃度について、試験製品によるチロシナーゼ酵素活性の調節が、以下の式にしたがって計算された。
チロシナーゼ酵素活性のパーセンテージ調節=100×[(OD475試験製品又は参照製品)-(OD475チロシナーゼのみ)]/OD475チロシナーゼのみ
本発明によるペレグリナ抽出物は、基礎チロシナーゼ活性を低下させることができ、これにより、この抽出物が、自然な形態の皮膚保護の1つ、つまり紫外線に対する保護を向上させる能力を有することを示すことができる。
ヒトメラニン細胞を96ウェルプレート及び24ウェルプレートで培養する。
試験濃度を、96ウェルプレート(細胞毒性試験)及び24ウェルプレート(メラニン測定)中のコンフルエント状態のメラニン細胞と接触させる。各濃度について、試験は3つのウェルで行う。プレートを、36.5℃、5%CO2で24時間±1時間、5日間インキュベートする。
細胞生存性を、製品を用いて24時間インキュベートした後の細胞についてMTT法で評価する。24時間のインキュベーション後、対象のウェルを200μLのPBSで1回洗浄する。0.5mg/mLのMTT溶液50μLを各ウェルに加え、36.5℃、5%CO2で3時間インキュベートする。150μLのイソプロパノールを各ウェルに加える。均等化後、550nmでの吸光度読み取り値を取得する。各条件について、陰性対照の平均光学濃度値に対する細胞の平均光学濃度値の比により、生存率が決定される。
本発明によるペレグリナ抽出物によってセルロース中のメラニン生成が阻害され、このことは、本発明によるペレグリナ抽出物に皮膚保護特性を与える。この阻害はまた、基礎レート(basal rate)が対照よりも低い(培地中に本発明による抽出物が存在しない)ので、メラニン細胞に対するリラクゼーション効果を示し、ここで、メラニンの生成は細胞ストレスに対する応答であることが想起される。したがって、本発明によるペレグリナ抽出物は、これが老化斑を防止することができることを示す。
試験される本発明によるペレグリナ抽出物の非存在下又は存在下で、I型コラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼ酵素の溶液をその基質中で5分間インキュベートする。次いで、溶液を色原体ニンヒドリンと接触させ、続いて、80℃で15分間インキュベートする。インキュベーション期間の終わりにおいて、試験又は参照製品を含む及び含まないコラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼ酵素の活性が、565nmでの反応媒体の吸光度を測定することによって評価された。試験された各濃度について、コラゲナーゼ及びヒアルロニダーゼ酵素活性の試験製品による調節が、以下の式にしたがって計算された。
コラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼ酵素活性のパーセンテージ調節=100×[(OD試験又は参照製品-ODコラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼのみ)/ODコラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼのみ]
本発明によるペレグリナ抽出物はメタロプロテアーゼ(コラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼ)の強力な阻害を引き起こす。本発明によるペレグリナ抽出物は、0.1%以上の濃度でこれらのメタロプロテアーゼに対して88%阻害を発揮することができ、皮膚の細胞外マトリックスを大効率で保護するための良好な潜在能力を有し、この阻害を介してアンチエイジング効果を示す。
Pierre Fabre特許による抽出物は、コラゲナーゼ活性に対して42%のピーク阻害(全ての濃度を一緒にしたとき)という、僅かな、逆投与量依存阻害活性を示し、これは、本発明によるペレグリナ抽出物についての100%のピーク阻害とは対照的である。
ホスホリパーゼA2酵素活性のパーセンテージ調節=100×[(OD405試験製品又は参照製品-OD405sPLA2のみ)/OD405sPLA2のみ]
本発明によるペレグリナ抽出物のみが酵素PLA2に対して有意な阻害活性を示す。
果実が熟したときに採取されたモリンガ・ペレグリナ(Forssk.)Fioriの種子を乾燥させて内部水分含量を約6%とし、その後、機械的エンドレススクリュープレスでプレスし、これにより、一方でバージン油を、他方で固形物を得るために、油を種子の残りの部分から分離させる。次いで、固形物を、1cmから2cmの断片の事前にカットされた筒状片の形に分離させる。固形物に対し、55℃で10分間予熱した96℃エタノールを用いてマセレーション及び抽出を25%/75%(m/m)の比で行う。混合物をブレンダーで15分間剪断し、次いで、20℃で2時間、インペラーによって撹拌したままにする。次いで、生成物を、真空下でブフナー漏斗によりろ過して、乾燥物を1.15%含有する淡黄色のろ液を得る。このろ液は以下の試験に使用される。
- 予備実験は、試験する要素の細胞毒性を評価し、次の実験のための投与量範囲を選択するために行う。
- 第1の遺伝毒性実験(試験1)は、代謝活性化の存在下及び非存在下で、試験系及び試験要素(又は対照物)を予備実験で定められた投与量範囲で最小限のアガー上に直接組み込む。
- 第2の実験(試験2)は、代謝活性化の存在下及び非存在下で、第1の実験の結果の分析後に試験責任者によって定められた投与量レベルを用いて、試験系及び試験要素(又は対照物)をプレインキュベーションする。この第2の実験は、特に、あいまいな結果又は陰性結果が得られた場合に、第1の実験の結果を確認する又は完成させるために行われた。
試験要素の希釈物は分析グレードの水中で準備された。
- 代謝活性化非存在下での測定:
0.1mLの種々の濃度の試験要素
0.5mLの0.2MのpH7.4の滅菌リン酸緩衝液
2mLのネズミチフス菌用トップアガー
0.1mLの細菌種菌(TA100)
- 代謝活性化存在下での測定:
0.1mLの種々の濃度の試験要素
2mLのネズミチフス菌用トップアガー
0.1mLの細菌種菌(TA100)
0.5mLのS9混合物
0.1mLの0.2MのpH7.4のリン酸緩衝液
0.1mLの溶媒
0.1mLのS9混合物
0.1mLの最高濃度の試験要素調製物
- 検証工程の結論として、試験要素が変異原性であると考えられるのは以下の場合であり、すなわち、代謝活性化の存在下及び非存在下で、5つの菌株のうち1つ以上で投与量と効果の間の関係が再現性よく得られた場合である。変異原性は、復帰突然変異株の数がTA98株、TA100株及びTA102株で自然復帰率の2倍以上(R≧2)である場合、並びにTA1535株及びTA1537株で自然復帰率の3倍以上(R≧3)である場合にのみ、所定の濃度について考慮される。
- 試験1及び試験2の結論として、試験要素が非変異原性であると考えられるのは以下の場合であり、すなわち、代謝活性化の存在下及び非存在下で、試験要素の全濃度について、復帰突然変異株の頻度が常に、TA98株、TA100株及びTA102株については自然復帰率の2倍未満(R<2)である場合、TA1535株及びTA1537株については自然復帰率の3倍未満(R<3)である場合であるが、但し、試験された濃度の毒性に変異原性作用の欠如が関係していないことを確認したことを条件とする。
- 細胞毒性作用は認められない
- 試験抽出物のいずれの濃度も、代謝活性化の存在下及び非存在下で、TA98株、TA100株及びTA102株について自然復帰率の少なくとも2倍以上、又はTA1535株及びTA1537株について自然復帰率の3倍以上の比率Rを示さなかった
- 試験系又は試験条件に関係なく投与量応答は観察されなかった
細胞のUVA感受性は、増加する照射線量に細胞を曝露した後の細胞の生存性を評価することによって、約10回継代毎に確認される。細胞を試験に用いた密度で培養する。それらを2.5J/cm2及び9J/cm2の照射量で翌日に照射し、細胞生存性を1日後にNRU試験によって決定する。細胞は、5J/cm2のUVA照射後の生存性が暗所に維持された対照の生存性の80%以上である場合、品質基準を満たし、9J/cm2のUVAの最高照射量では、生存性は、暗所に維持された対照の生存性の少なくとも50%に等しくなければならない。
陰性対照は0.4以上の吸光度を有する。陽性対照であるクロルプロマジンは、IC50値が、UVAの存在下で0.1μg/mLから2μg/mL、UVAの非存在下で7μg/mLから90μg/mLである。これらの結果により試験を有効性のあるものとすることができる。UVAの照射下又は非照射下で50%細胞死をもたらすペレグリナ固形物抽出物の濃度は推定できない。死亡率が50%に達することはなかった。UVAの照射下又は非照射下で50%細胞生存率をもたらすペレグリナ固形物抽出物の濃度は推定できない。生存率は常に50%を超える。
適用された実験条件の下において、ペレグリナ固形物抽出物は非光毒性と考えることができる。
50%細胞死をもたらすペレグリナ抽出物の濃度は50%超えと評価された。ペレグリナ抽出物50%での細胞死のパーセンテージは17%であると評価された。
適用された実験条件下において、ペレグリナ固形物抽出物の細胞毒性は無視できる細胞毒性であると考えることができる。
0:反応なし
0.5:非常に軽度
1:軽度
2:中程度
3:顕著
M.I.S.=皮膚反応の和(紅斑+浮腫+水疱+丘疹+小水疱)/分析したボランティアの数
M.I.S.≦0.20 非刺激性
0.20<M.I.S.≦0.50 わずかに刺激性
0.50<M.I.S.≦2 中程度の刺激性
2<M.I.S.≦3 高度の刺激性
ペレグリナ固形物抽出物の平均刺激スコア(M.I.S.)は0に等しい。
ペレグリナ固形物抽出物は、12名のボランティアに48時間連続適用した後、非刺激性と考えられる。
上で行った試験の結果は疑う余地のないものであり、例1によるペレグリナ抽出物について、以下の点を実証するものである。
1)眼及び皮膚刺激性試験は陰性
2)光毒性試験は陰性
3)変異原性試験は陰性
本発明によるペレグリナ抽出物の安全性が実証され、ターゲット集団に関する制限なく大規模局所美容用品使用に理想的である。
皮膚バリアに対する効果の評価:製品の適用前(D1)、そして適用21日後(D21)のTEWL値の比較
不快感に関するD21でのフィードバック
美容用品の許容性:D21にボランティアによって記入される質問表
全皮膚タイプを有する平均50歳(20歳から70歳)の女性ボランティア22名を試験した。皮膚バリアについて評価した製品により以下の結果が得られた(*はD1に対するD21の%変化、**は対応するデータについてのWilcoxon試験、Sは有意(p≦0.05)、NSは非有意(p>0.05))。
試験の条件下において、上記クリームはTEWL測定によって明らかにされた「皮膚保護」効果を示し、86%が好ましい意見であり良好な美容用品許容性を示した。
Claims (17)
- モリンガ・ペレグリナ種子抽出物であって、
前記モリンガ・ペレグリナ種子抽出物は、
殻付き種子固形物の固液抽出を、アルコール溶媒中で、使用される総重量に対して固体物が25重量%±2.5重量%~5重量%となる割合で、16℃から30℃の温度で2時間±12~24分間撹拌しながら行い、ただし前記アルコール溶媒は、エタノール又はメタノールから選択されたアルコールを、当該アルコール溶媒の総重量に対して70重量%~100重量%の割合で含むものであり、
固相を除去して、化合物2,5-ジホルミルフランの含有量が他の全ての成分の含有量より多いモリンガ・ペレグリナ種子固形物の液体抽出物であるモリンガ・ペレグリナ種子の前記抽出物を回収するように、液相と固相の分離を行うことによって、得られるものである、
モリンガ・ペレグリナ種子抽出物。 - 請求項1に記載の液体のモリンガ・ペレグリナ種子抽出物を乾燥させて、乾燥物の総重量に対して50重量%を超える量の2,5-ジホルミルフランを含有する前記モリンガ・ペレグリナ種子固形物の乾燥抽出物であるモリンガ・ペレグリナ種子の前記抽出物が得られる、モリンガ・ペレグリナ種子抽出物。
- 前記アルコール溶媒は、ポリオール及び亜臨界水から選択された共溶媒を含む、
請求項1又は2に記載のモリンガ・ペレグリナ種子抽出物。 - モリンガ・ペレグリナ種子抽出物を得るための方法であって、
殻付き種子固形物を得る工程と、
殻付き種子固形物の固液抽出を、アルコール溶媒中で、使用される総重量に対して固体物が25重量%±2.5重量%~5重量%となる割合で、16℃から30℃の温度で2時間±12~24分間撹拌しながら行う工程と、ただし前記アルコール溶媒は、エタノール又はメタノールから選択されたアルコールを、当該アルコール溶媒の総重量に対して70重量%~100重量%の割合で含むものであり、
固相を除去して、化合物2,5-ジホルミルフランの含有量が他の全ての成分の含有量より多いモリンガ・ペレグリナ種子の液体抽出物を回収するように、液相と固相の分離を行う工程と、
を有することを特徴とする方法。 - 得られた液体の前記モリンガ・ペレグリナ種子抽出物を乾燥させて、乾燥物の総重量に対して50重量%を超える量の2,5-ジホルミルフランを含有する前記モリンガ・ペレグリナ種子固形物の乾燥抽出物を得る、
請求項4に記載の方法。 - a)モリンガ・ペレグリナの殻付き種子を収集し、乾燥させて、内部水分含量を8%未満とする工程と、
b)乾燥させた前記種子をプレスして、油を前記種子の残りの部分から分離させて固形物を得る工程と、
c)前記工程b)で得られた前記固形物を粉砕する工程と、
d)前記工程c)で得られた粉砕された物質を、前記アルコール溶媒中に、使用される総重量に対して固体物が25重量%±2.5重量%~5重量%となる割合で分散させる工程と、
e)16℃から30℃の温度で2時間±12~24分間、撹拌しながら前記固液抽出を行う工程と、
f)固相を除去して液体モリンガ・ペレグリナ固形物抽出物を回収するように、液相と固相を分離させる工程と、
を含む、請求項4又は5に記載の方法。 - 前記アルコールはエタノールであり、
前記方法は、
g)前記液体モリンガ・ペレグリナ抽出物を、固体モリンガ・ペレグリナ抽出物が得られるように乾燥させる工程
を含む、請求項6に記載の方法。 - 前記アルコール溶媒は、ポリオール及び亜臨界水から選択された共溶媒を含む、
請求項4~7のいずれか1項に記載の方法。 - 前記主にアルコールを含む溶媒は、96°純粋エタノール溶媒である、請求項6に記載の方法。
- 前記液体モリンガ・ペレグリナ抽出物を、蒸留、マイクロろ過、限外ろ過及び/又はナノろ過によって精製して、前記抽出物の前記2,5-ジホルミルフランを、同様に抽出された有機物質に対して濃縮する、請求項6に記載の方法。
- 活性剤として有効量の請求項1又は2に記載のモリンガ・ペレグリナ種子抽出物と、生理学的に許容される添加剤と、を含有する、美容用品組成物又はニュートリコスメティクス組成物。
- 前記組成物は、皮膚への局所適用のために製剤化された美容用品組成物であり、
前記モリンガ・ペレグリナ種子抽出物は、前記美容用品組成物の総重量に対して0.002重量%から20重量%、優先的には0.01重量%から10重量%の濃度で前記美容用品組成物中に存在する、請求項11に記載の組成物。 - 前記組成物が、経口摂取用に製剤化されたニュートリコスメティクス組成物であり、
前記モリンガ・ペレグリナ種子抽出物が、前記ニュートリコスメティクス組成物の総重量に対して0.01重量%から100重量%の濃度で前記ニュートリコスメティクス組成物中に存在する、請求項11に記載の組成物。 - 請求項11~13のいずれか1項に記載の組成物の美容用品又はニュートリコスメティクスにおける使用であって、当該使用は、皮膚、粘膜又は外皮の外観の改善、皮膚のリラクゼーション、鎮静及びストレス除去、並びに皮膚の老化及び/又は光老化のサインの予防及び/又は対処、並びに老化斑の予防のための、使用。
- 組成物を得るための方法であって、
活性剤として有効量の請求項1又は2に記載のモリンガ・ペレグリナ種子抽出物を設けることと、
生理学的に許容される添加剤を設けることと、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記組成物を、皮膚への局所適用のために製剤化する工程を含み、
前記モリンガ・ペレグリナ種子抽出物は、前記美容用品組成物の総重量に対して0.002重量%から20重量%、優先的には0.01重量%から10重量%の濃度で前記美容用品組成物中に存在する、
請求項15に記載の方法。 - 前記組成物を、経口摂取用に製剤化する工程を含み、
前記モリンガ・ペレグリナ種子抽出物が、前記ニュートリコスメティクス組成物の総重量に対して0.01重量%から100重量%の濃度で前記ニュートリコスメティクス組成物中に存在する、
請求項15に記載の方法。
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