WO2012117170A2 - Extrait de rameaux d'hiver d'hippophae et son utilisation dans une composition cosmétique. - Google Patents

Abstract

La présente invention est relative à un extrait de rameaux, notamment d'hiver, d'Hippophae, en particulier, d'Hippophae rhamnoides, ainsi qu'à l'utilisation d'un tel extrait dans une composition cosmétique.

Description

Extrait de rameaux d'hiver d'Hippophae et son utilisation dans une composition cosmétique.

La présente invention est relative à l'utilisation d'un extrait de rameaux d'Hippophae, en particulier de rameaux d'hiver d'Hippophae rhamnoides dans une composition cosmétique pour atténuer la pigmentation de la peau, des poils et des cheveux.

La coloration de la peau ainsi que des poils et des cheveux, est due à des pigments bruns appelés mélanines et sécrétés par des cellules spécialisées appelées mélanocytes suivant un processus biochimique complexe faisant intervenir plus de 90 gènes (Tadokoro T., dans Mechanisms of Suntanning, édité par J-P Ortonne et R Ballotti, Martin Dunitz, 2002, p .67) .

Dans beaucoup de cultures, et notamment en Asie, on préfère avoir la peau la plus claire possible, en tout cas sans taches pigmentaires.

C'est pourquoi l'industrie cosmétique commercialise un grand nombre de produits destinés à empêcher la peau de bronzer, ou à l'éclaircir, ou à en atténuer les taches. En outre, il existe aussi des préparations dermatologiques destinées à atténuer les taches de pigmentation telles que les éphélides (taches de rousseur) et les chloasmas (masques de grossesse), ou à éclaircir la peau autour des taches blanches de vitiligo pour qu'elles se voient moins.

Ainsi, on connaît des substances qui permettent de diminuer la synthèse de mélanine par les mélanocytes, et donc d'atténuer la pigmentation cutanée telles que : l'hydroquinone et ses dérivés comme l'arbutine, l'acide kojique, l'acide azélaique, l'acide octadécènedioïque, certains extraits de plantes comme Morus alba ou Glycyrrhiza glabra, l'acide ascorbique (vitamine C) et ses dérivés comme le phosphate d'ascorbyle ou le phosphate double de vitamine C et de vitamine E, certains dérivés de cystéine.

Un exemple d'agent de dépigmentation et/ou blanchissant de la peau et/ou des phanères est décrit dans le document FR-2.848.846-A: il s'agit en l'occurrence de dérivés de l'acide ascorbique.

Un autre exemple est décrit dans le document FR-2.841.550-A : il s'agit là de molécules dérivées de la tyramine.

Un autre exemple est décrit dans le document FR-2.886.843-A : il s'agit là d'extraits de Griffonia.

Mais les substances ci-dessus sont quelquefois cytotoxiques pour les mélanocytes, et/ou insuffisamment efficaces, et/ou trop coûteuses et/ou difficiles à utiliser : par exemple, les compositions à base d'hydroquinone sont actuellement interdites à la vente libre.

Aussi un des buts de la présente invention est-il relatif à l'utilisation d'une composition cosmétique ou dermatologique dont le principe actif ne présente pas les inconvénients exposés ci-dessus.

Un autre but de l'invention est de fournir une telle composition présentant une meilleure efficacité et à un coût compétitif.

Ces buts, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, sont atteints par l'utilisation d'un extrait de Hippophae dans une composition cosmétique ou dermatologique pour atténuer la pigmentation de la peau, des poils ou des cheveux.

Les extraits végétaux sont souvent utilisés dans des compositions cosmétiques ou dermatologiques.

En dehors des molécules nécessaires au métabolisme des végétaux tels que les sucres qui stockent l'énergie, les alpha-aminoacides nécessaires à l'élaboration des protéines, le glucose qui sert à la synthèse de la cellulose constitutive des parois cellulaires ... il y a dans les plantes des métabolites secondaires de nature très variable selon les familles et les genres.

Les métabolites secondaires jouent souvent un rôle protecteur dans les plantes contre les agressions bactériennes et fongiques, ou contre les prédateurs tels que les insectes ou les mammifères herbivores. Ce sont des molécules complexes qui présentent des activités biologiques recherchées en pharmacie ou dans le domaine phytosanitaire.

Par ailleurs les métabolites secondaires peuvent avoir des effets intéressants sur les cellules de la peau recherchés pour l'élaboration de formulations cosmétiques plus performantes.

La composition en métabolites secondaires varie selon les saisons, et selon les parties de la plante, racine, feuille, branche, fleur, fruit, graine...

Ces molécules actives sont extraites des plantes en fonction de leurs propriétés de solubilité dans les solvants de nature plus ou moins polaire. Ainsi la polarité du solvant conditionne le type de molécules extraites et donc l'activité des extraits.

D'une façon générale un extrait méthanolique ou hydro-éthanolique contient la plupart des métabolites secondaires polaires.

De plus, les extraits bruts peuvent être fractionnés en utilisant des solvants de polarité différente. Ainsi, un butanol pourra extraire les molécules les moins polaires d'un extrait brut aqueux ou méthanolique ou hydro-éthanolique.

Les extraits bruts ou les fractions d'extraits peuvent être caractérisés par chromatographie liquide sous haute pression (HPLC). Chaque molécule est caractérisée par un pic d'élution à un temps spécifique pour une colonne donnée, dans des conditions données d'élution (solvants et gradient).

On peut également caractériser un extrait ou une fraction d'extrait par chromatographie sur couche mince (TLC). Cette technique permet de caractériser des molécules de structure complète encore inconnue, par la distance d'élution de chacune d'elle sur la plaque (Rf) et par leur révélation par des réactifs plus ou moins spécifiques d'une famille chimique donnée.

Le genre Hippophae de la famille des Elaéagnacées, comprend notamment les espèces H.goniocarpa, H.gyantsensis, H. litangensis, H.neurocarpa, H.rhamnoides, H.salicifolia, H.tibetana (www.NCBI.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser).

Hippophae rhamnoides est un arbuste buissonnant épineux à feuilles caduques très commun dans le nord de l'Asie et en Europe. Dans les régions désertiques, il sert de nourriture aux animaux domestiques. Les anciens grecs l'ont baptisé « Hippos phaos » ce qui veut dire « cheval luisant », parce que les chevaux nourris de ses feuilles ou rameaux avaient le poil brillant (Production et utilization de l'argousier Hippophae rhamnoides L., T. Li et T. Beveridge, Les Presses scientifiques du CNRC, Ottawa 2004). On l'appelle en français Argousier. Il pousse en France à l'état naturel dans les Alpes du Sud et dans le Nord-Ouest sur les rivages sablonneux de la Manche en Picardie et en Flandre (Pierre Lieuthaghi, Le livre des arbres arbustes et arbrisseaux. Robert Morel ed. 1969). Il est aussi commun sur le littoral en Belgique et en Hollande. Il se cultive facilement pour la production des baies ou comme buisson ornemental. En anglais il se nomme « Sea Buckthorn », en allemand « Sanddorn », en chinois « Sha Ji » et en russe « Oblepika ».

La Chine, la Mongolie et la Russie comptent au total plus de 800 000 ha de peuplements naturels d'Hippophae rhamnoides et plus de 300 000 à 500 000 ha de cultures de cet arbuste (T. Li et T. Beveridge déjà cités).

Les racines d'H. rhamnoides (H. r.) présentent des nodosités dues à une bactérie Actynomycete du genre Frankia symbiotique et fixatrice de l'azote atmosphérique (E. Small et al, Biodiversity, 2002, 3, 25-27).

Les fruits ou baies d'H. rhamnoides sont consommés tels quels ou en jus, en confitures, comme condiment, ou sous d'autres formes, en Russie, en Mongolie, en Chine aussi bien qu'en Europe, et au Canada où l'espèce a été introduite pour fixer les sols et comme culture agro-alimentaire. La teneur des baies d' H. r. en Vitamine C est extrêmement élevée. Une autre particularité de ces fruits est que leur pulpe, comme celle de l'olive, renferme une huile. Une autre huile de composition en acides gras différente peut être extraite des graines. Les deux huiles contiennent du tocophérol et des caroténoïdes qui donnent aux baies leur couleur jaune, orange ou rouge (L'Argousier - Une culture polyvalente et prometteuse pour le Saskatchewan. Agriculture et Agroalimentaire Canada. 2007. http//www4.agr.gc.ca).

Lorsque H.rhamnoides est cultivé pour la production de fruits, il est conseillé pour optimiser leur nombre et leur qualité, de tailler les branches en hiver. Il est déconseillé de couper les branches en été ou à la fin de l'automne pour éviter l'introduction de maladies par les plaies de taille (Production et utilisation de l'argousier. Hippophae rhamnoides. Li T. et Beveridge T., 2004, Conseil national de recherches Canada).

En Chine du nord, H. rhamnoides a été semé par avion ou hélicoptère sur de vastes étendues du plateau de loess (Mongolie Intérieure, Shanxi) pour enrichir et fixer les sols ainsi que pour développer une activité économique autour de la valorisation des fruits. Mais il sert aussi de bois de chauffe et de fourrage pour les animaux domestiques (moutons, bovins... ) dont la santé s'en trouve améliorée (prise de poids, meilleurs aspect du poil, meilleure résistance aux maladies) (Ruan Chengjiang et Li Daiqiong, Function and benefit of Hippophae rhamnoides L. Improving eco-environment of loess plateau of China.12th ISCO Conférence, Beijing, 2002).

Dans la région aride et froide du Ladakh en Inde, les chameaux, yaks, moutons, chèvres... survivent à l'hiver grâce aux Hippophae qui constituent alors le seul fourrage disponible (Tsering Stobdan, DRDO Science Spectrum, mai 2008, 255-

Dans les pâturages du Mustang au Népal, les bergers conduisent leur bétail au début de l'hiver pour qu'ils broutent les feuilles d'Hippophae tibetana. Les bergers de Lomanthang ont remarqué que leurs chevaux malades retrouvent leur poids et un poil brillant si on leur donne à manger des feuilles et des branches tendres de Hippophae tibetana ( Khilendra Gurung and Vimal Gupta, Traditional uses and commercial utilization of seabuckthorn ,Hippophae L , in Mustang district, Népal. 2008). Hippophae rhamnoides L. pousse à l'état sauvage en Russie dans les républiques sibériennes de l'Altai, de Bouriatie ainsi que de Tuva, et des cultures ont été développées dans de nombreuses autres régions pour l'exploitation du fruit en agro-alimentaire, médecine et cosmétique (Terekhina NV, Interactive Agricultural Ecological Atlas of Russia and Neighboring Countries, 2003-2009. http://www.agroatlas.ru).

Les utilisations des fruits et des feuilles d' Hippophae rhamnoides sont multiples en alimentaire, en médecine, et en cosmétique (E . Small déjà cité).

En alimentaire, les fruits qui sont extrêmement riches en Vitamine C mais un peu trop acides pour être consommés tels quels, servent à faire des jus (purs ou en mélange), des gelées, des marmelades, des sauces et des liqueurs.

En médecine traditionnelle, Hippophae est connue depuis fort longtemps. Cette plante est citée dans le livre Tibétain rGyud bzi datant de 618-907 A.D. (Lu Rongsen, Seabuckthorn, ICIMOD Paper N°20, Kathmandu, Népal, 1992) et une représentation très fidèle en est donnée dans le « Tibetan Médicinal Paintings. Illustrations to the Blue Berry treatise of Sangye Gyamtso (1653-1705)" de Gyurne Dorje et Fernand Meyer (Serindia Publications, 1992). Elle était utilisée notamment comme expectorant et fluidifiant du sang.

En médecine moderne, depuis 1966, l'huile d' Hippophae (nom vernaculaire Russe Oblipika) est la base de nombreux médicaments dans les pays de l'ancienne URSS destinés notamment à soigner la peau et les muqueuses (Lu Rongsen déjà cité). C'est surtout l'huile du fruit qui est utilisée. En Chine la production d'huile d'Hippophae a commencé en 1988, et des_. comprimés de Flavones des fruits d'Hippophae ont été lancés en 1986 pour le traitement de maladies coronariennes (Lu Rongsen déjà cité).

Les principaux produits industriels tirés des Hippophae sont le jus du fruit obtenu par pressurage, la crème d'huile de pulpe obtenue par centrifugation du jus, l'huile de graine obtenue par extraction à l'hexane, les flavones extraites à l'alcool des peaux de fruits résultant de la séparation du jus et des graines (Li et Beveridge déjà cités). Les feuilles sont séchées en Chine pour faire des tisanes.

En Cosmétique on utilise principalement les huiles de pulpe ou de graine pour protéger la peau, notamment contre le vieillissement (Li et Beveridge déjà cités). Ces huiles sont coûteuses car la cueillette des fruits d'Hippophae pose des problèmes en raison de leur petite taille et de leur fragilité (Li et Beveridge déjà cités). Ainsi le document JP-123851 1 -A décrit un cosmétique contenant l'huile extraite du péricarpe de Hippophae rhamnoides.

Le document FR-2840808-A1 décrit une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique contenant une fraction hydrophile de fruit de Hippophae rhamnoides.

Le document FR-2840809-A1 décrit également une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique contenant une fraction hydrophile de fruit de Hippophae rhamnoides, plus particulièrement pour la prévention ou le traitement du derme.

Mais aucun document antérieur ne mentionne l'obtention d'extraits de rameaux d'hiver de Hippophae pour la réalisation de compositions cosmétiques destinées à atténuer la pigmentation de la peau, des poils ou des cheveux.

Or il a été découvert de façon surprenante comme le montre la description des exemples qui vont suivre, que des extraits par un solvant polaire de rameaux d'hiver de Hippophae rhamnoides (H.r.) inhibent la biosynthèse des pigments mélanine par les cellules spécialisées de la peau (mélanocytes).

Par rameaux d'hiver, on entend des branches ou extrémités de branches prélevées sur des Hippophae ayant perdu leurs feuilles, ou n'ayant pas encore de feuilles. La période de récolte adéquate dépend évidemment de la latitude et de l'altitude du lieu de collecte ainsi que des conditions climatiques.

Exemple 1 . Extraction de branches d' Hippophae rhamnoides H.r.

Des jeunes branches de Hippophae rhamnoides ont été collectées en février dans les dunes côtières aux Pays Bas. Ces rameaux (rameaux d'hiver) n'avaient pas de feuilles, portaient des bourgeons, et étaient pauvres en bois.

Une portion de 300g de ce matériel végétal a été séché par lyophilisation, ce qui a donné 147g de produit sec qui a été broyé en une poudre de environ 100 mesh.

140g de cette poudre ont été extraits pendant une nuit par 700ml de méthanol.

Après filtration, l'extrait brut méthanolique a été évaporé à sec à l'évaporateur rotatif, puis repris par 500ml d'eau. La suspension obtenue a alors été extraite successivement par 3 portions de 200ml de 2-butanol.

Ces extraits butanoliques ont été rassemblés, puis évaporés à l'évaporateur rotatif. Le résidu a été gelé, puis lyophilisé pour donner la fraction butanolique. La phase aqueuse restante a également été passée à l'évaporateur rotatif, et le résidu obtenu a été également lyophilisé pour donner la fraction aqueuse.

On a ainsi obtenu 13,7g de fraction butanolique et 19,2g de fraction aqueuse.

L'extrait brut ainsi que les fractions butanolique et aqueuse ont été soumis à des analyses par chromatographie liquide HPLC sur colonne Phenomex Luna C18 avec un gradient linéaire d'acétonitrile dans une solution aqueuse de TFA à 0,01 %, ainsi qu'à des analyses par chromatographie sur couche mince (TLC) éluée avec le mélange acétate d'éthyle-acide acétique-acide formique-eau (70-8-8-18 en volumes).

Les plaques de TLC révélées avec les UV à 254 et 366 nm ainsi que par le réactif anisaldéhyde-acide sulfurique, montrent que les fractions butanolique et aqueuse sont assez similaires, mais que le composé principal de Rf voisin de 0,50 (révélé à l'anisaldéhyde) est plus important dans la fraction aqueuse.

Exemple 2 . Etude de l'activité des extraits de H.r. sur la synthèse de pigments mélanine par les cellules cutanées.

On étudie l'action des fractions butanolique et aqueuse de l'extrait de H.r. obtenues à l'exemple 1 sur la biosynthèse de la mélanine par les cellules de la peau.

La concentration maximum testée pour chaque fraction a été choisie en fonction des résultats d'un essai préalable de cytotoxicité.

On cultive des mélanocytes épidermiques humains normaux pendant 10 jours en absence et en présence de quantités non cytotoxiques de ces fractions. On évalue la quantité de pigments mélaniniques par extraction à la soude 0,5 N suivie d'une mesure de densité optique.

a) - Effet de la fraction butanol.

La fraction butanol aux concentrations de 0,0004 ; 0,002 ; et 0,01 mg/ml n'a pas entraîné de diminution significative de la quantité de mélanine produite par les mélanocytes.

b) - Effet de la fraction aqueuse.

La fraction aqueuse aux concentrations de 0,0002 ; 0,001 ; et 0,005 mg/ml, a entraîné une diminution significative et dose-dépendante de la quantité de mélanine produite par les mélanocytes qui passe respectivement à 99% du témoin, 94% du témoin (p inférieur à 0,01 ) et 87% du témoin (p inférieur à 0,01 ).

De cet exemple, il apparaît qu'un extrait de branches de Hippophae rhamnoides a une action significative sur la production de pigments mélanine par les cellules cutanées. En conséquence, on peut réaliser des compositions cosmétiques ou dermatologiques ayant pour but d'atténuer la pigmentation de la peau, des poils et des cheveux. Quelques exemples, n'ayant aucun caractère limitatif, de telles compositions seront donnés ci-après.

Exemple 3. Extraction de branches ô'Hippophae rhamnoides.

De jeunes branches d'H.r. ont été collectées en avril (rameaux d'hiver) dans les dunes côtières aux Pays Bas. On a choisi des rameaux n'ayant pas encore de feuilles, portant des bourgeons, et pauvres en bois.

Une portion de 327g de ce matériel végétal a été séchée par lyophilisation, ce qui a donné 127g de produit sec qui a été broyé en une poudre de environ 100 mesh.

126g de cette poudre ont été extraits sous ultrasonication, pendant 30 mn, par 630ml d'éthanol à 70%. Après filtration, une nouvelle portion de 000ml d'éthanol à 70% a été rajoutée sur la poudre et laissée pendant la nuit.

Après filtration, ces extraits bruts éthanoliques ont été rassemblés, et évaporés à sec à l'évaporateur rotatif, puis repris par 400ml d'eau. La suspension obtenue a alors été extraite successivement par 3 portions de 160ml de 2-butanol.

Ces extraits butanoliques ont été rassemblés, puis évaporés à l'évaporateur rotatif. Le résidu a été gelé, puis lyophilisé pour donner la fraction butanolique.

La phase aqueuse restante a également été passée à l'évaporateur rotatif, et le résidu obtenu a été également lyophilisé pour donner la fraction aqueuse.

On a ainsi obtenu 1 1 ,6 g de fraction butanolique et 16,6 g de fraction aqueuse.

L'extrait brut ainsi que les fractions butanolique et aqueuse ont été soumis à des analyses par chromatographie liquide HPLC sur colonne Phenomex Luna C18 avec un gradient linéaire d'acétonitrile dans une solution aqueuse de TFA à 0,01%, ainsi que des analyses par chromatographie sur couche mince TLC éluée avec le mélange acétate d'éthyle-acide acétique-acide formique-eau (70-8-8-18 en volumes).

Les plaques de TLC révélées avec les UV à 254 et 366 nm ainsi que par les réactifs anisaldéhyde-acide sulfurique, chlorure ferrique-acide perchlorique (Salkowski), ninhydrine, et p-diméthylaminobenzaldéhyde (Ehrlich), montrent que les fractions butanolique et aqueuse présentent des différences dans la zone des faibles Rf. Le composé principal de Rf 0,47 ainsi que d'autres bandes de Rf 0,58 ; 0,55 ; 0,41 ; révélées au FeCI3 (qui réagit avec les groupements indole), et à la ninhydrine (qui réagit avec les groupements aminé) pourrait être un composé de type indole- amine.

Exemple 4 . Etude de l'activité des extraits de Hippophae r. sur la synthèse de pigments mélanine par les mélanocytes.

Pour cet essai on a choisi des mélanocytes de la lignée B16 stimulés par un analogue de l'a MSH, la NDP-MSH.

On a ensemencé des plaques à puits et laissé les mélanocytes croître à confluence.

Puis on a changé le milieu de culture pour le remplacer suivant les puits par du milieu supplémenté ou non en NDP-MSH, ainsi qu'en différentes concentrations des fractions butanolique et aqueuse de l'extrait de Hippophae r. de l'Exemple 3.

Après incubation pendant 72h, on a dosé la quantité de mélanine dans les cultures, en mesurant leur absorption à 405 nm.

On a ainsi pu évaluer l'inhibition par les produits de la biosynthèse de mélanine par les mélanocytes stimulés par la NDP-MSH.

La concentration maximum testée pour chaque fraction a été choisie en fonction des résultats d'un essai préalable de cytotoxicité.

Les résultats sont résumés dans le Tableau suivant :

Réf. AMP-C Saison Solvant Fraction Concentration % mg/ml Mélanine

Contrôle stimulé 100 (+NDP-MSH)

Contrôle non 96 stimulé

35 hiver 70% éthanol H20 0,004 105

0,020 71

0,100 54

36 hiver 70% éthanol BuOH 0,0008 104

0,004 97

0,020 72 On a ainsi trouvé que la fraction butanolique de l'Exemple 3 réduit de 100 à 72% de façon significative la mélanogénèse des cellules B16, à la concentration de 0,02 mg/ml.

De plus, on a trouvé que la fraction aqueuse de l'extrait hydro-éthanolique de l'Exemple 3 réduit la mélanogénèse de 100 à 71 % de façon significative à la concentration de 0,02 mg/ml, et de 100 à 54% de façon hautement significative à la concentration de 0, 1 mg/ml.

De cet exemple, il apparaît qu'un extrait de Hippophae rhamnoides a une action significative d'inhibition de la production de pigments mélanine par les cellules cutanées.

En conséquence, il paraît intéressant de réaliser des compositions cosmétiques ou dermatologiques ayant pour but d'atténuer la pigmentation de la peau, des poils et des cheveux. Quelques exemples, n'ayant aucun caractère limitatif, de telles compositions seront données ci-après.

Exemple 5 . Extraction de branches de Hippophae rhamnoides (H.r.).

De jeunes branches de H.r. ont été récoltées le 8 septembre (rameaux d'été) au même endroit que pour les exemples 1 et 3. Ces rameaux d'été étaient porteurs de feuilles et de bourgeons. Seules les extrémités ont été prélevées de façon à ce que le matériel végétal ne comporte pas trop de bois.

Le matériel collecté a été immédiatement gelé à -80°C et séché par lyophilisation.

Puis on l'a broyé en poudre de 100 mesh.

On a procédé de même avec des rameaux d'hiver de l'exemple 3 stockés à - 80°C.

On a alors réalisé sous traitement aux ultra-sons pendant 30 mn, les 3 extractions suivantes :

- 75 g de rameaux d'hiver par 875 ml d'éthanol à 70% dans l'eau,

- 75 g de rameaux d'hiver par 875 ml d'eau,

- 144 g de rameaux d'été par 2050 ml d'éthanol à 70% dans l'eau.

Après filtration, les extraits ont été évaporés à l'évàporateur rotatif, puis repris par 200 ml d'eau (400 pour l'extrait de rameaux d'été). Ces suspensions ou solutions ont été extraites par 3 fois 80 ml de n-butanol (3 fois 160 ml pour l'extrait de rameaux d'été) et les extraits butanoliques ont été évaporés à l'évàporateur rotatif puis séchés par lyophilisation. Les rendements d'extraction ont été les suivants :

Exemple 6. Caractérisation des extraits et fractions.

Les trois extraits bruts de l'Exemple 5 ainsi que leurs fractions butanolique et aqueuse ont été caractérisés par chromatographie.

Chromatographie Liquide Haute Pression (HPLC).

On a utilisé une colonne Luna C18 3 microns et un gradient d'acétonitrile dans l'eau contenant 0,01 % d'acide trifluoroacétique passé à 0.75 ml/mn, et réalisé de la façon suivante :

La détection a été effectuée par une alignée de photodiodes à 220, 280, et

340 nm.

Les extraits de rameaux d'hiver comportent un double pic caractéristique élué autour de 5 - 5,5 mn.

L'extrait de rameaux d'été est plus riche en composés, mais contient très nettement moins des composés formant le double pic à 5 - 5,5 mn.

Chromatographie en couche mince (TLC).

Les trois extraits bruts et leurs fractions butanolique et aqueuse ont été chromatographiés sur quatre plaques avec le solvant : acétate d'éthyle/ acide acétique/ acide formique/ eau (70 :8 :8 : 18 en volumes).

Les plaques éluées ont été photographiées sous lumière visible, et UV à 254 et 366 nm.

De plus, les 4 plaques ont été révélées chacune avec l'un des réactifs suivants :

- anisaldéhyde/ acide sulfurique, un réactif non spécifique,

- chlorure ferrique dans l'acide perchlorique (réactif de Salkowski) qui révèle en particulier les indoles,

- ninhydrine, qui révèle les aminés,

- p-diméthylaminobenzaldéhyde (réactif d'Ehrlich), qui révèle les indoles.

Ces révélations mettent en évidence deux bandes intenses de Rf voisin de 0,5 dans les extraits de rameaux d'hiver, dont la plus importante est plus marquée dans les fractions aqueuses.

Ces bandes qui sont les plus importantes dans les extraits de rameaux d'hiver, sont nettement moins marquées dans l'extrait de rameaux d'été, même dans sa fraction aqueuse.

De plus, étant donné que ces bandes sont révélées en particulier par le chlorure ferrique et le réactif d'Ehrlich qui réagissent avec les indoles, ainsi que par la ninhydrine qui réagit avec les aminés, il pourrait s'agir de molécules de type indole- amine. Exemple 7 . Etude de l'activité des extraits de rameaux d'Hippophae r. sur la synthèse de pigments mélanine par les mélanocytes, en fonction de la saison de collecte.

Quatre des fractions d'extraits obtenues à l'Exemple 5 ont été évaluées en ce qui concerne leur aptitude à inhiber la synthèse de pigments mélanine des mélanocytes B16 stimulés par la NDP-MSH, suivant le même protocole que pour l'Exemple 4.

La concentration maximum testée pour chaque fraction a été choisie en fonction des résultats d'un essai préalable de cytotoxicité.

Les résultats sont résumés dans le tableau I suivant :

Tableau I

Réf. AMP-C Saison Solvant Fraction Indoles Conc. % Mélanine mg/ml (contrôle 100%)

44 (3) hiver 70% EtOH H20 +++++ 0,008 83

0,04 52

0,2 23

46 (6) hiver H20 H20 ++++ 0,008 87

0,04 51

0,2 26

47 (8) été 70% EtOH BuOH + 0,0016 106 0,008 100

0,04 95

48 (9) été 70% EtOH H20 ++ 0,008 105

0,04 97

0,02 79

- L'analyse des résultats permet les conclusions suivantes :

- les résultats confirment que des extraits de rameaux d'Hippophae rhamnoides inhibent la biosynthèse de mélanine par les mélanocytes, - les extraits de rameaux récoltés en hiver sont beaucoup plus actifs comme inhibiteurs de la mélanogénèse,

- les extraits les plus actifs sur l'inhibition de la mélanogénèse sont également ceux qui contiennent le plus de composés indoliques.

Il apparaît donc intéressant de réaliser de nouvelles formulations cosmétiques contenant des extraits de rameaux d'Hippophae rhamnoides.

Composition N°1. Crème cosmétique pour atténuer la pigmentation cutanée.

Pour réaliser une émulsion huile dans eau classique, on mélange sous agitation à 85°C une phase lipidique hydrophobe et une phase aqueuse contenant chacune des ingrédients destinés à conférer les propriétés d'usage habituelles d'une formulation cosmétique telles que la stabilité, la consistance, un étalement agréable, un pouvoir hydratant, une bonne stabilité microbiologique.

On refroidit sous agitation, et lorsque la température est descendue à 45°C, on ajoute 2% en poids d'une fraction aqueuse d'extrait hydro-éthanolique de rameaux d'hiver d'Hippophae rhamnoides tel qu'à l'Exemple 3.

Composition N°2. Crème cosmétique pour prévenir la pigmentation cutanée.

On réalise une émulsion huile dans eau comme ci-dessus avec une phase lipidique hydrophobe contenant des filtres anti-UV A et B. Au cours du refroidissement sous agitation, lorsque la température est descendue à 45°C, on ajoute 1 ,5% en poids d'un extrait aqueux brut sec de rameaux d'hiver d'Hippophae rhamnoides tel qu'à l'Exemple 5. Composition N°3. Gel cosmétique pour éclaircir le teint.

On prépare une suspension de liposomes contenant un extrait hydro- éthanolique de rameaux d'hiver d'Hippophae rhamnoides (H.r.) de composition suivante :

Fraction aqueuse sèche d'extrait hydro-éthanolique telle qu'à l'Exemple 5 1 Phospholipides pro-liposomes 2 Eau avec conservateurs 50 Gel aqueux qsp 100 On dissout l'extrait sec d'H.r. dans l'eau, puis on disperse les phospholipides, et on homogénéise cette phase avant de rajouter le gel aqueux sous agitation modérée pour ajuster la consistance et stabiliser les liposomes.

Composition N°4. Crème cosmétique pour améliorer l'éclat du teint. On réalise comme pour la composition N°1 une crème cosmétique pour améliorer l'éclat du teint associanf un extrait d'Hippophae rhamnoides (H.r.) à d'autres ingrédients actifs suivant la formule :

Fraction aqueuse d'extrait aqueux de rameaux d'hiver

de H.r. tel qu'à l'Exemple 5 2 5-hydroxy-tryptophane extrait de Griffonia simplicifolia 0,5 Ecdystérone 0,2 Arbutine 1 Acide lactique 0,5 Excipient émulsionné de type H/E avec filtres UVB+A et conservateurs qsp 100

Composition N°5. Lotion pour éclaircir les poils ou les cheveux.

On prépare suivant le même mode opératoire que pour la composition N° 3, une suspension de liposomes contenant un extrait aqueux brut sec de rameaux d'hiver d'H.r. de composition suivante :

Extrait brut sec de H.r. tel qu'à l'exemple 5 1 Phospholipides pro-liposomes 1 Eau avec conservateurs 90 Gel aqueux qsp 100

Bien évidemment, une composition selon la présente invention peut aussi contenir l'un ou l'autre des produits suivants:

- au moins un autre produit actif dépigmentant tel que l'arbutine, l'acide kojique, l'acide azélaïque, l'acide octadécènedioïque, un extrait de Morus alba, un extrait de Glycyrrhiza glabra, un extrait de Griffonia simplicifolia, l'acide ascorbique et ses dérivés comme le glucoside d'ascorbyle, le phosphate d'ascorbyle ou le phosphate double de vitamine C et de vitamine E, l'ecdystérone, un dérivé de cystéine, l'acide ellagique, le 5-hydroxytryptophane.

- au moins une substance pour filtrer ou bloquer les rayonnements ultra-violets B et/ou A telle que des pigments à base d'oxyde de titane, des pigments nacrés, des molécules de type benzophénone, anthranilate, cinnamique, dibenzoyl méthane, salicylique, dérivés du camphre, ou tout autre produit cité à l'annexe VII de la Directive « cosmétique » N°76/7688/CEE modifiée.

- au moins un produit anti-inflammatoire tel qu'un extrait de Glycyrrhiza glabra, l'acide glycyrrhétinique, un extrait de Scutellaria baicalensis, un extrait d'Aloe vera, le bisabolol.

- au moins un agent favorisant la desquamation tel que l'acide salicylique, l'acide lactique ou un autre alpha-hydroxyacide, l'urée.

- au moins un agent humectant tel que le glycérol, le sorbitol, la sérine, les sels de l'acide pyroglutamique (acide pyrrolidone carboxylique), l'acide hyaluronique.

Cette composition peut être sous l'une des formes suivantes :

- sous forme de lotion aqueuse ou hydro-alcoolique, d'un gel aqueux ou hydro alcoolique, d'une micro-émulsion, d'une émulsion liquide ou épaisse, d'une poudre libre ou compactée.

- sous forme d'un patch, la composition étant disposée sur un support solide.

Par ailleurs, dans une composition selon la présente invention, l'extrait de rameaux d'hiver de Hippophae rhamnoides peut être incorporé dans des particules telles que des liposomes (comme décrit pour la composition N°3), des vésicules de molécules amphiphiles non-ioniques, des phases lamellaires dispersées, des capsules, des éponges, ou disposé à la surface de particules telles que des particules de polymères synthétiques, des particules de cellulose, ou des particules minérales.

Ainsi la présente composition comporte de 0,05 à 20%, et de préférence de 0,5 à 5%, en poids d'extrait sec de rameaux d'Hippophae rhamnoides. Cette composition peut également contenir au moins un autre produit actif dépigmentant et/ou un agent pour favoriser la desquamation. Par ailleurs, la présente invention concerne non seulement les extraits aqueux ou hydroalcooliques de branches ou de rameaux d'Hippophae mais également les fractions plus ou moins purifiées de ces extraits.

Claims

REVENDICATIONS

1 - Extrait de rameaux d'Hippophae caractérisé par le fait qu'il s'agit d'extrait de rameaux d'hiver et qu'on utilise comme solvant l'eau, le méthanol, l'éthanol, le propylène glycol, le glycérol ou leurs mélanges.

2 - Extrait selon la revendication 1 caractérisé par le fait qu'il renferme au moins une molécule présentant un groupe indole.

3 - Utilisation d'un extrait selon l'une des revendications 1 à 2 dans une composition cosmétique pour atténuer la pigmentation de la peau, des poils ou des cheveux.

4 - Utilisation d'un extrait selon la revendication 3 caractérisée par le fait que ladite composition contient de 0,05 à 20% en poids d'extrait sec de rameaux d' Hippophae rhamnoides.

5 - Utilisation d'un extrait selon la revendication 4 caractérisée par le fait que ladite composition contient de 0,5 à 5% en poids d'extrait sec de rameaux d' Hippophae rhamnoides.

6 - Utilisation d'un extrait selon la revendication 3 caractérisée par le fait que ladite composition contient également au moins un autre produit actif dépigmentant. 7 - Utilisation d'un extrait selon la revendication 3 caractérisée par le fait que ladite composition contient également une substance pour filtrer les rayonnements UVB et/ou A.

8 - Utilisation d'un extrait selon la revendication 3 caractérisée par le fait que ladite composition contient également un agent pour favoriser la desquamation.