KR101582971B1 - 딱총나무 및 으아리 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 딱총나무(Sambucus williamsii var. coreana) 추출물 및 으아리 추출물(Clematis mandshurica Rupr)을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화장료 조성물은 보다 상세하게는 딱총나무와 으아리 추출물을 혼합추출물로 하여 주름개선 효과에 있어서 크게 향상된 시너지 효과를 나타내므로, 피부 내 콜라겐생성 촉진효과, MMP-1 생성 억제 효과 및 엘라스타제 저해활성효과가 우수한 주름개선용 화장료 조성물로 이용될 수 있다.

Description

딱총나무 및 으아리 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition containing extract of Sambucus williamsii var. coreana and Clematis mandshurica Rupr for improving skin wrinkle}

본 발명은 딱총나무(Sambucus williamsii var. coreana) 및 으아리(Clematis mandshurica Rupr) 추출물을 함유하는 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 딱총나무 및 으아리 혼합추출물을 유효성분으로 함유하여 콜라겐생성 촉진효과, MMP-1 생성 억제 효과 및 엘라스타제 저해활성효과가 우수한 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

현대에는 웰빙(well being) 시대를 거쳐 그린(green) 시대로 변하면서 천연물에 대한 연구가 활발히 진행됨에 따라 천연물 신약과 화장품에 대한 관심 또한 높아지고 있다. 현재 천연물로부터 얻어진 추출물 및 성분이 관절염 치료제, 항암제 등으로 개발되었고, 미백 및 주름개선 화장품으로도 사용되고 있다. 그리고 바쁜 시대를 살아가는 현대인들이 겪는 과도한 스트레스와 환경오염 등에 의해 생성된 프리라디칼(free radical)의 제거를 위한 항산화 물질을 천연물로부터 얻으려는 노력이 현재에도 계속되고 있고, 그 중에서도 주름개선 및 억제용 화장품은 젊음을 유지하고자하는 소비자의 많은 관심을 받고 있다.

주름살은 특정 방향으로 근육이 오랜 기간 동안 반복하여 움직임으로써 형성되는데, 연령, 외부환경, 자외선 조사 등에 영향을 받는다. 이러한 인자에 의한 피부 세포의 손상은 여러 가지 노화 현상을 일으키는데, 진피 매트릭스를 구성하는 콜라겐, 엘라스틴의 생성 및 분해가 원활하지 못해 매트릭스의 견고성이 떨어져 피부의 탄력이 떨어지고 주름이 생성된다.

광노화의 경우, 자외선 조사에 의해 콜라겐의 합성이 감소하는 동시에 기질 금속 단백 분해효소의 발현이 증가하여 기질의 주요 구성 성분인 콜라겐과 엘라스틴 등의 분해가 증가되어 주름살을 비롯한 광노화 현상이 진행되는 것으로 알려져 있다. 엘라스타제 역시 탄력섬유의 분해과정에서 탄력소를 분해하는 효소로 자외선 조사에 의해 그 활성이 증가하여 광노화 현상에 관여하게 된다.

현재 주름개선 화장품시장은 레티놀 중심으로 형성되어 있다. 레티놀의 주름 제거 효능이 우수하기는 하지만 건성피부에 사용할 경우 피부의 각질을 벗겨내 피부자극이 심해 피부가 빨갛게 변하거나 더욱 건성이 될 가능성이 있다. 또한 제형이 불안정하여 쉽게 파괴되는 단점을 가지고 있다. 이를 극복하기 위해 다양한 주름개선 원료들이 연구되고 있다. 대표적인 성분들로 표피에 영양과 수분을 공급하고 노화를 막는 항산화 작용을 하는 플라보노이드, 비타민C 유도체, 메디민A가 있다. 또한 피부에 자극이 없으면서,섬유아세포의 증식 및 콜라겐 합성을 촉진시킴으로써 피부 잔주름을 방지하며, 물질 자체의 안정성이 우수한 것으로 발표된 3-아미노프로판인산이 있

다.

한편 최근 들어 천연물을 소재로 하여 피부주름을 개선하고자 하는 많은 연구들이 발표되고 있다. 대한민국 공개특허 제2008-1031호에는 하고초(Prunella vulgaris) 추출물을 함유하는 주름개선용 화장료 조성물에 대하여 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제2008-94458호에는 황기, 어성초, 은행, 의이인, 치마버섯, 황백, 비파엽, 알로에, 율피, 자작나무, 장미, 강낭콩, 느타리버섯, 능소화, 백년초, 빈랑자, 사철쑥, 예덕나무, 옥죽, 조구등, 질려자, 풍년화, 피마자, 혈갈, 호과, 호도, 호박, 호이초, 홍화, 황정 및 감잎으로 이루어지는 군으로부터 1 종 이상 선택되는 약재의 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름개선용 화장료 조성물이 개시되어 있으며, 대한민국 공개특허 제2008-101821호에는 홍화추출물을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 화장료 조성물에 대하여 개시되어 있다.

이에 본 발명자들은 주름개선에 효능이 있는 생약들을 선별하였고, 그 결과 특정 배합 비를 가지는 딱총나무 및 으아리의 혼합추출물이 상승효과를 발휘하여 엘라스타제의 발현을 억제하며, 콜라겐의 생합성을 촉진함으로써 주름을 개선한다는 사실을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 딱총나무 및 으아리 혼합추출물을 함유하여 피부 주름 개선효과가 있는 화장료조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히, 엘라스타제(elastase)의 활성을 억제하고, MMP-1 생성을 억제하며 콜라겐의 생합성을 촉진함으로써 주름을 개선하는 화장료조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 딱총나무 및 으아리 혼합추출물을 함유하는 주름개선용 화장료 조성물이 제공된다. 상기 혼합추출물은 딱총나무 추출물 및 으아리 추출물이 1:10~10:1의 중량비로 혼합되는 것이며, 바람직하게는 딱총나무 추출물 및 으아리 추출물이 1:1의 중량비로 혼합되는 것이다. 바람직하게는 상기 혼합추출물은 딱총나무의 줄기와 으아리의 뿌리를 추출하여 얻어지는 것이다.

상기 딱총나무 및 으아리 혼합추출물은 화장료 조성물 총중량에 대해서 0.005~50중량%, 바람직하게는 0.01~20중량% 함유된다.

상기 혼합추출물은 피부 내에서 콜라겐 생성을 촉진함에 의해 주름을 개선한다. 또한 상기 혼합추출물은 피부 내에서 MMP-1 생성을 억제하고 엘라스타제의 활성을 저해함으로써 피부주름을 개선하는 특징을 가진다.

상기 혼합추출물은 서브마이크론캡슐화, 마이크로캡슐화 또는 리포좀화 되어 용액 또는 파우더 형태의 원료로 적용될 수 있다.

또한, 딱총나무추출물 및 으아리 추출물을 함유하는 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형으로 적용되어질 수 있다.

딱총나무 및 으아리 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 피부 주름개선에 효과가 있으며, 특히, 엘라스타제 저해활성 효과, MMP-1 생성 억제 효과 및 콜라겐 생합성 촉진효과가 우수하다. 이러한 딱총나무 및 으아리 추출물이 함유된 화장료 조성물은 주름개선 효과를 통한 피부노화방지용 화장료 조성물에 유용하다.

본 발명은 딱총나무 및 으아리 추출물의 콜라겐 생성촉진, MMP-1 생성 억제 및 엘라스타제 활성저해 효과를 이용한 주름개선용 화장료에 관한 것이다.

딱총나무(접골목, Sambucus williamsii var. coreana)는 한국, 중국, 일본 등지에 분포하는 낙엽 활엽관목으로 산골짜기에서 자란다. 높이는 3m 정도로 덩굴처럼 자라며 수피는 갈색 또는 회갈색이고, 줄기의 속이 어두운 갈색이다. 잎은 마주나고 2~3쌍의 작은잎으로 우상복엽이며, 길이 5∼14 cm로 긴 타원형 또는 타원상 난형이고 끝은 뾰족하며 밑은 날카롭고 가장자리에 톱니가 있다. 꽃은 5월에 피고 돌기가 있으며 짧은 원추꽃차례를 이룬다. 화관은 황록색이 돌고 털이 없으며, 꽃밥은 황색이다. 열매는 핵과로 공 모양이며 7월에 붉게 익는다. 딱총나무는 접골목이라하여 뼈에 좋은 약재로 이용한다. 한국, 일본, 중국 등지의 그늘지고 습한 산골짜기에서 생육이 되고 있는 낙엽활엽관목이다. 경남 산청 지방에서는 딱총나무를 구수한 맛이나 향이 난다고 하여 꾸순대 나물이라고 하여 식용하는데, 어린잎이나 순은 약간 쓴맛이 있기는 하지만 나물로 무쳐 먹거나 튀김을 해서 먹기도 한다. 전통한의학에서는 국내에서 자생하고 쉽게 얻을 수 있는 식물들을 한약의 재료로 사용하여 왔으며, 딱총나무의 경우도 널리 이용되어 지고 있지는 않지만, 동물들이 그 열매를 식용으로 이용하며, 우리나라의 민간요법에서는 옛날부터 근골의 좌상 등의 치료약으로 사용되어왔으며, 민간요법으로 신장병, 수종 등의 이뇨약으로 사용되어 왔다.

으아리(위령선(威靈仙), Clematis mandshurica Rupr)는 미나리아재비과 으아리속에 속하는 다년생의 덩굴성 초본으로서 우리나라에서는 산야에 자생하며 6 월부터 8 월 사이에 독특한 흰색의 꽃이 피고 과기는 9 월이다. 중약에서는 이 생약의 뿌리를 약용하는데, 채집은 가을철에서부터 이듬해 봄 사이에 채취해서 그대로 또는 수취하여 약용한다. 우리나라에서 자생하는 것으로는 으아리(Clematis mandshurica Rupr)와 참으아리(C. termiflora) 및 외대으아리(Clematis bradhyura Max.)를 약용하며 중국에서는 C. chinennsis 와 C. mandshurica를 약용한다. 전통적으로 이 으아리 (위령선)은 신경통, 근육통, 편두통과 부종의 치료제로 사용되어 왔고, 항염작용, 항균작용, 항뇨작용 및 진통작용에 대한 연구가 보고되어 있다. 으아리(위령선)의 성분으로는 clematoside A, A', B, C 등의 배당체와 hederagenin 이 있고, flavonoid가 분리 보고된 바가 있다. 그 외에도 anemonol, steroids, saponin, amino acid, phenol 등을 함유하고 있으며 배당체나 saponin이 주 약효 물질로 볼 수 있다.

본 발명 화장료조성물에 있어서, 딱총나무 및 으아리 혼합추출물은 1:10~10:1의 중량비, 바람직하게는 1:1의 중량비로 이루어지는 것이다.

유효성분으로서의 상기 딱총나무 및 으아리 추출물은 조성물 전 중량에 대하여 0.005 ~ 50중량% 함유되며, 0.01~20 중량% 함유되는 것이 더욱 바람직하다. 0.005중량% 미만으로 함유되는 경우에는 활성이 약하며, 50중량%를 초과하는 경우 제형에 있어 불안정하다.

본 발명 딱총나무 및 으아리 혼합추출물은 피부 내에서 엘라스틴의 분해효소인 엘라스타제의 활성을 억제하며, MMP-1 생성을 억제하는 작용을 한다. 또한 콜라겐의 생합성을 촉진함으로써 피부주름을 개선하는 작용기전을 가진다.

본 발명의 딱총나무 추출물 및 으아리 추출물은 다음과 같이 제조할 수 있다. 딱총나무의 가지 또는 으아리를 물로 깨끗이 세척한 후, 그늘에서 건조한다. 건조물을 추출용기에 넣고, 적당량의 추출 용매에 적절한 온도에서 일정 시간 추출한다. 상기 추출물은 여과되고, 진공회전증발기 등을 이용하여 농축될 수 있다.

상기 추출 용매로는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알콜, 아세톤, 클로로포름, 헥산, 아세토나이트릴 또는 이들의 혼합 용매로부터 선택된 용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올을 첨가하여 열수 추출하는 것을 특징으로 한다. 상기 추출 용매의 양은 생약 건조 중량의 1 ~ 15배, 바람직하게는 7 ~ 8배로 한다.

상기 추출 방법은 중탕 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출 등의 추출 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 중탕 추출의 추출방법으로 1회 내지 5회 추출될 수 있다.

상기 침적 온도는 40 ~ 70℃ 정도로, 더욱 바람직하게는 60℃로 유지하는 것이 부패, 변색 및 변취의 예방에 가장 효과적이다. 상기 침적 시간은 2 ~ 7시간, 바람직하게는 3시간을 유지하는 것이 좋다.

상기 침적에 의하여 수득한 추출물을 1~3일, 바람직하게는 1일 방치한 후 여과포와 여과지를 이용하여 여과하고 회전감압 증발기로 건조하여 딱총나무 추출물 및 원추리 추출물에 해당하는 파우더를 얻는다.

본 발명의 딱총나무 추출물 및 으아리 추출물을 혼합하는 최적의 혼합비는 딱총나무 추출물 및 으아리 추출물이 각각 1:10~10:1, 더욱 바람직하게는 1:1의 중량비로 혼합되는 것이다. 한편, 본 발명의 혼합 추출물은 딱총나무와 으아리를 혼합 후 추출할 수도 있고, 각각의 추출물을 얻은 후 혼합할 수도 있다.

만약 상기 딱총나무 추출물 및 으아리 추출물을 함유하는 서브마이크론캡슐, 마이크로캡슐, 리포좀 등의 제형으로 용액 또는 파우더 형태로 존재한다면 당업자는 상기 농도 범위 내에서 본 발명에 따른 조성물 내에 이 용액 또는 파우더의 양을 조절할 수 있을 것이다.

본 발명 딱총나무 및 으아리 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물로 제조되는 화장품은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연 화장수가 있다. 또한, 본 발명의 딱총나무 및 으아리 추출물을 함유하는 화장품 이외에도 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 딱총나무 및 으아리 혼합추출물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고 상기의 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형으로 적용될 수 있다.

[실시예]

이하, 하기의 실시예와 시험예들을 통하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이 예들에 의하여 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 딱총나무 추출물의 제조

음지에서 건조한 딱총나무의 줄기를 분쇄한 뒤, 1kg을 10배 가량의 70%(V/V) 에탄올 수용액으로 6시간 가온 환류추출하고 냉침한 후, 8㎛ 투과사이즈를 갖는 여과지로 여과하였다. 이 여과된 추출액을 60℃이하에서 감압농축한 후 감압건조기를 이용해 완전히 건조시켜 딱총나무추출물 31g을 수득하였다.

제조예 2: 으아리 추출물의 제조

음지에서 건조한 으아리의 뿌리를 분쇄한 뒤, 1kg을 10배 가량의 70% (V/V) 에탄올 수용액으로 6시간 가온 환류추출하고 냉침한 후, 8㎛ 투과사이즈를 갖는 여과지로 여과하였다. 이 여과된 추출액을 60℃이하에서 감압농축한 후 감압건조기를 이용해 완전히 건조시켜 으아리추출물 25g을 수득하였다.

상기 제조예 1과 2에서 제조한 딱총나무추출물과 으아리추출물, 그리고 이를 각각 1:1로 혼합한 혼합물을 농도별로 디메틸설폭사이드에 희석하여 제조한 희석용액을 실험에 사용하였다.

시험예 1 : 엘라스타제 제어 활성시험

0.1 중량% Elastin-Congo red(Sigma, USA)가 포함된 2.5 중량% agar에 시험시료 및 엘라스테이즈 효소 용액(1,000 units/mL, Sigma, USA)을 혼합하고 상온에서 10분간 반응시킨 용액 10 ul 씩 주입 후 37℃에서 18시간 배양하였다. 배양 종료 후 엘라스테이즈의 활성에 의해 Elastin-Congo red agar 주변에 투명대가 형성되면 그 헤일로(halo)의 직경을 측정하여 엘라스테이즈 활성 저해 효과를 측정할 수 있다.

엘라스틴을 포함하는 한천배지에 엘라스타제만을 적가하는 한편, 상기 딱총나무 추출물과 으아리 추출물 그리고 이들 추출물의 1:1 중량비의 혼합물의 농도가 0.01, 0.05, 0.1 및 0.5%되는 용액을 시료로 하여 엘라스타제와 함께 적가하여 배지 상에 나타나는 헤일로(halo)의 직경을 측정하여 딱총나무 추출물의 엘라스타제 저해활성을 측정하였으며, 대조예로서 retinol을 엘라스타제와 함께 적가하여 비교하였다.

상기 시험결과 하기의 표 1과 같은 결과를 얻었다.

시료 농도 (%)	Halo diameter (cm)
	딱총나무 추출물	으아리 추출물	딱총나무추출물 + 으아리추출물	Elastase	Retinol
0.01	1.4	1.5	1.2	1.8	0.9
0.05	1.3	1.4	1.1
0.10	1.0	1.2	0.9
0.50	1.0	1.2	0.9

헤일로 직경(Halo diameter)이 클수록 엘라스틴의 분해가 많이 된 것인데, 상기 표 1에서 확인되는 바와 같이, 딱총나무추출물, 으아리추출물 및 이들의 혼합 추출물을 처리했을 때 헤일로 직경(halo diameter)이 감소하는 것으로 우수한 엘라스타제 억제 효과를 나타냄을 알 수 있었고, 각각의 추출물을 처리한 경우에 비하여 딱총나무 및 으아리 혼합추출물을 처리하였을 때 상승적인 효과가 있음을 알 수 있었다.

시험예 2: 콜라겐 생합성 촉진효과시험

섬유아세포를 10% FBS를 첨가한 IMDM 배지에 5×10⁵의 세포농도로 접종하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양하여 제조예 1과 2에서 제조한 딱총나무추출물과 으아리추출물, 그리고 이를 각각 1:1로 혼합한 혼합물을 최종 농도가 50, 100, 500, 1000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가하여 18시간 동안 동일 조건에서 배양 후 1시간 동안 UV를 조사시켜 세포에 스트레스를 주었다. 이후 Trizol reagent(invitrogen, USA)를 이용하여 섬유아세포를 회수하여 mRNA를 추출하여 일련의 과정을 거쳐 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA로부터 PROCOLLAGEN TYPEⅠ유전자 부위를 증폭시켜 전기영동을 통해 유전자 발현 양을 확인하였으며, 유전자 증폭은 thermal cycler (GenePro, Hangzhou bioer tech., CHINA)를 사용하여 10x taq polymerase buffer, 10 mM dNTP, 10 pmol primer (F: AGC CAG CAG ATC GAG AAC AT, R: TCT TGT CCT TGG GGT TCT TG), taq polymerase를 혼합하고 증류수를 더하여 50 uL로 조정 후 95도 5분 1cycle/95도 1분/51도 2분/72도 1분 28 cycle 증폭, 72도에서 5분간 반응하는 조건으로 수행하였다. 생성된 procollagen의 발현율은 아래 식에 따라 계산하였으며 대조구로는 시료를 처리하지 않고 UV를 조사하지 않은 정상 섬유아세포를 사용하였다.

procollagen 발현율(%) = B/A × 100(%)

A: 상기 대조군에서의 procollagen 발현 량

B: 시료 처리 및 UV조사 섬유아세포의 procollagen 발현 량

상기 시험결과 하기의 표 2와 같은 결과를 얻었다.

시료 농도 (㎍/㎖)	procollagen 발현율(%)
	딱총나무추출물	으아리추출물	딱총나무추출물 + 으아리추출물
0	2.62	2.62	2.62
50	26.32	18.42	42.26
100	49.12	38.86	59.75
500	83.10	72.88	98.86
1000	117.47	104.62	142.68

상기 표 2의 결과에서 보는 바와 같이, 딱총나무추출물과 으아리추출물을 단독으로 적용한 경우보다 딱총나무 및 으아리 추출물을 혼합해 적용한 시료가 피부 주름에 관련 있는 콜라겐 생합성 촉진효과가 더 높았으며, 보다 우수한 시너지 효과를 보여주었다.

시험예 3: MMP -1 생성 억제 효과

인간 정상 피부세포인 섬유아세포(한국 세포주 은행, 대한민국)를 48-웰 마이크로 플레이트(Nunc. 덴마크)에 각 웰 당 1st 10⁶세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지(Sigma, 미합중국) 및 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후 상기 제조예 1과 2에서 제조한 딱총나무추출물과 으아리추출물, 그리고 이를 각각 1:1로 혼합한 혼합물을 최종 농도가 50, 100, 500, 1000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가한 후 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 킷트(Amersham, 미합중국)를 이용하여 새로 합성된 MMP-1의 양(㎍/㎖)을 측정하고, 하기 식에 따라 MMP-1 생성 억제율을 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다. 이때, MMP-1 생성 억제율의 양성 대조군으로 TGF-β(10㎎/㎖, Roche, 미합중국)을 사용하였다.

시료 농도 (㎍/㎖)	MMP-1 생성 억제율(%)
	딱총나무추출물	으아리추출물	딱총나무추출물 + 으아리추출물	TGF-β
50	16.2	15.8	34.5	38.2
100	24.9	24.5	62.5	68.5
500	49.6	38.8	69.5	72.8
1000	61.1	52.5	88.5	88.8

상기 표 3의 결과에서 보는 바와 같이, 딱총나무추출물과 으아리추출물을 단독으로 적용한 경우보다 딱총나무 및 으아리 추출물을 혼합해 적용한 시료가 MMP-1 생성 억제율 효과가 더 높았으며, 보다 우수한 시너지 효과로 대조군 TGF-β와 유사한 경향의 효과를 보여주었다.

시험예 4: 세포독성시험

섬유아세포를 10% FBS를 첨가한 IMDM 배지에 5×10⁵의 세포농도로 접종하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 제조예 1과 2에서 제조한 딱총나무추출물과 으아리추출물, 그리고 이를 각각 1:1로 혼합한 혼합물을 최종 농도가 50, 100, 500, 1000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 처리하여 24시간 배양한 후에 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium boromide, Sigma, U.S.A.)용액을 각 well에 100㎕씩 첨가한 후(3㎎/㎖) 4시간 동안 더 배양하였다. 이후 상층액을 제거하고, 150㎕의 디메틸설폭시드를 첨가한 후, 30분간 shaking하여 생성된 formazan을 녹여 multimicroplate reader(Molecular device Spectra max190)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기의 표 4에 나타내었다.

세포 생존율(%)=시료첨가군의 흡광도 / 대조군의 흡광도 × 100

시료 농도 (㎍/㎖)	세포 생존율(%)
	딱총나무추출물	으아리추출물	딱총나무추출물 + 으아리추출물
0	100	100	100
50	100	100	100
100	100	100	100
500	100	100	100
1000	96.76	95.43	96.12

상기 표 4의 결과에서 보는 바와 같이, 딱총나무추출물, 으아리추출물 그리고 딱총나무 및 으아리 추출물을 혼합해 적용한 시료 모두 500㎍/㎖ 농도에서 세포 독성이 없는 것으로 확인되었고, 사용 농도가 1000㎍/㎖에서는 세포 생존율이 감소하였으나 안전에는 문제가 없는 것을 확인하였다.

실시예 1: 에멀젼 베이스 제조

본 발명의 딱총나무추출물 및 으아리 혼합추출물을 함유하는 화장료의 피부 주름 개선효과와 피부안전성에 대한 임상시험을 위해 하기 표 5의 조성에 따라 에멀젼 베이스를 제조하였다.

비교예 1, 2: 에멀젼 베이스 제조

하기의 표 5의 조성과 같이 딱총나무추출물만을 함유하거나 본 발명의 추출물을 함유하지 않는 에멀젼 베이스를 제조하여 비교예로 하였다.

성분	중량%
	실시예 1	비교예 1	비교예 2
글리세린	3.00	3.00	3.00
디소듐이디티에이	0.02	0.02	0.02
폴리글리세릴-3-메틸글루코스 디스테아레이트	1.50	1.50	1.50
세테아릴알코올	0.50	0.50	0.50
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	7.00	7.00	7.00
폴리아크릴아마이드&C13-14이소파라핀&라우레스-7	0.60	0.60	0.60
딱총나무추출물	1.00	1.00	-
으아리추출물	1.00	-	-
향, 방부제	미량	미량	미량
정제수	잔량	잔량	잔량
계	100	100	100

시험예 5: 피부주름 개선 효과

본 발명의 딱총나무 및 으아리추출물을 함유하는 화장료 조성물의 피부주름 개선 효과를 건강한 35세에서 50세의 여성 30명을 대상으로 측정하였다. 먼저, 세 그룹으로 나누고, A 그룹에는 실시예 1을, B 그룹에는 비교예 1을, C 그룹에는 비교예 2의 제형을 안면부에 하루 2회씩 (아침 및 저녁) 3개월간 도포하였다. 3개월 후 주름의 개선 정도를 피험자의 설문 및 주름의 영상 분석을 통해 평가하였다.

피험자의 설문은 사용전과 비교하여 개선 없음, 약간의 개선, 중등도의 개선, 상당한 개선의 4단계로 판단하였으며 결과를 하기의 표 6에 나타내었다.

주름의 영상분석에 의한 평가는 실험이 시작되기 전 눈 밑의 레플리카를 채취하고 실험이 종료된 직후의 레플리카를 눈 밑의 동일 부위에서 채취하여 영상분석을 통해 주름의 2차원적 분석으로 주름의 밀도를 측정하였다. 영상분석에 의한 주름 밀도의 측정 결과는 사용 전과 비교한 주름 밀도에 대한 감소율로 하기의 표 7에 나타내었다.

시료	개선없음	약간의 개선	중등도의 개선	상당한 개선
실시예 1	1	1	4	4
비교예 1	2	3	4	1
비교예 2	7	3	-	-

시료	주름 밀도 감소율 (%)
실시예 1	54
비교예 1	36
비교예 2	28

상기 표 6 및 7로부터, 딱총나무 및 으아리 혼합추출물을 함유한 실시예 1의 피부주름 개선 효과가 매우 우수함을 알 수 있었다.

시험예 6 : 피부안전성시험

본 발명의 딱총나무추출물 및 으아리추출물을 함유한 화장료 조성물의 피부안전성을 확인하기 위하여 과거력상 피부자극에 과민 반응을 보인 적이 없으며, 현재 피부병 내지 피부 알러지 증상이 없는 20~30대 여성 20명을 대상으로 인체 피부첩포시험을 하였다. 우선 시험 부위를 70% 에탄올로 닦아낸 뒤 건조시켰다. 실시예 1 및 비교예 1 내지 2의 물질을 15㎍씩 핀챔버(Finn chamber, 100x 10, EPITEST, 핀란드) 내에 적하시킨 후, 시험대상자의 전박(forearm) 안쪽 부위에 밀폐 첩포하였다. 24시간 동안 첩포하고, 첩포를 제거한 후, 펜으로 시험부위를 표시하였다. 표시 후 각각 1시간 및 24시간 후에 확대경(8MC-150, DAZOR, 미합중국)을 이용하여 시험부위를 관찰하여 홍반 및 부종 유무를 관찰하였다. 피부 반응은 국제접촉피부염연구회(ICDRG, Internatiolnal Contact Dermaitis Research Group)의 규정에 따라 판정하고, 하기식에 따라 평균피부반응도(mean response rate)를 구하고, 그 결과를 표 8에 기재하였다.

평균피부반응도=(점수×반응수×100×1/2)×[3(최대점수)×총 피검자수(n)]

* 피부 반응의 평가 기준, 기호 및 점수

무반응: -(0)

희미한 또는 가벼운 홍반:±(0.5)

경계가 뚜렷하나 약한 홍반, 부종 및 구진:+(1)

뚜렷한 홍반, 구진 및 소수포:++(2)

심한 홍반 및 대수포, 가피 형성:+++(3)

시험물질	1시간 후			24시간 후			반응도(%) (n=20)
	±	+	++	±	+	++
실시예 2	-	-	-	-	-	-	0.00
비교예 2	-	-	-	-	-	-	0.00
비교예 3	-	-	-	-	-	-	0.00

상기 표 8로부터 알 수 있는 바와 같이 딱총나무 및 으아리 추출물을 함유하는 화장료에서 피부자극이 나타나지 않아 피부안정성이 우수하였다.

시험예 7: 제형의 안정성 실험

상기 본 발명의 딱총나무 추출물 및 으아리 추출물을 함유한 화장료에 대한 안정성 시험을 하기의 방법으로 실시하였다. 화장료의 안정성을 시험하기 위해 상기 실시예 1 및 비교예 1, 2를 45℃로 일정하게 유지되는 항온조에서 불투명 초자 용기에 담아 12동안 보관하고 또한 4℃로 일정하게 유지되는 완전히 차광된 냉장고 내에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관한 후, 변색 및 변취, 분리정도를 비교 측정하여 그 결과를 하기 표 9에 기재하였다. 이 때 제품 변색 및 변취, 분리정도를 다음의 6등급으로 분류하여 평가하였다.

0:변화없음 1:극히 조금 분리(변색, 변취)

2:조금 분리(변색, 변취) 3:조금 심하게 분리(변색, 변취)

4:심하게 분리(변색, 변취) 5:극히 심하게 분리(변색, 변취)

구 분	제형의 안정성
	실시예 1		비교예 1		비교예 2
	45℃	4℃	45℃	4℃	45℃	4℃
변색	0	0	0	0	0	0
변취	0	0	0	0	0	0
분리	0	0	0	0	0	0

상기 표 9로부터 알 수 있는 바와 같이, 실시예 1과 비교예 1, 2에는 45℃와 4℃에서 변색이나 변취, 분리 현상이 거의 없이 안정하였고, 딱총나무 추출물 및 으아리 추출물이 제형 내에서 안정한 상태로 존재함을 나타낸다.

본 발명의 딱총나무 및 으아리 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 하기의 여러 제형으로 제조될 수 있다.

실시예 2: 유연 화장수

하기 표 10에 기재된 조성으로 딱총나무 및 으아리 추출물을 함유하는 유연 화장수를 통상의 방법으로 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
딱총나무 추출물	0.5
으아리 추출물	0.5
1,3-부틸렌 글리콜	5.2
올레일알코올	1.5
에탄올	3.2
폴리솔베이트 20	3.2
벤조페논-9	2.0
카르복실비닐폴리머	1.0
글리세린	3.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

실시예 3: 영양 화장수( 밀크로션 )

하기 표 11에 기재된 조성으로 딱총나무 및 으아리 추출물을 함유하는 영양 화장수를 통상의 방법으로 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
딱총나무 추출물	0.6
으아리 추출물	0.6
글리세린	5.1
프로필렌글리콜	4.2
토코페릴아세테이트	3.0
유동파라핀	4.6
트리에탄올아민	1.0
스쿠알란	3.1
마카다미아너트오일	2.5
폴리솔베이트 20	1.6
솔비탄세스퀴롤레이트	1.6
프로필파라벤	0.6
카르복실비닐폴리머	1.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

실시예 4:영양 크림

하기 표 12에 기재된 조성으로 딱총나무 및 으아리 추출물을 함유하는 영양 크림을 통상의 방법으로 제조하였다.

성 분	함량(중량%)
딱총나무 추출물	1.0
으아리 추출물	1.0
친유형 모노스테아린산글리세린	2.0
스테아릴알콜	2.2
스테아린산	1.5
밀납	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6
정화식물유	1.0
스쿠알란	3.0
광물유	5.0
트리옥타노인	5.0
디메치콘	1.0
소듐마그네슘실리케이트	0.1
글리세린	5.0
베타인	3.0
트리에탄올아민	1.0
소듐히아루로네이트	4.0
방부제,향,색소	미량
정제수	잔량
합계	100

실시예 5: 맛사지 크림

하기 표 13에 기재된 조성으로 딱총나무 및 으아리 추출물을 함유하는 맛사지 크림을 통상의 방법으로 제조하였다.

성 분	함량(중량%)
딱총나무 추출물	0.5
으아리 추출물	0.5
글리세린	4.0
바셀린	3.5
트리에탄올아민	0.5
유동파라핀	24.0
스쿠알란	3.0
밀납	2.1
토코페릴아세테이트	0.1
폴리솔베이트 60	2.4
카르복실비닐폴리머	1.0
솔비탄세스퀴올레이트	2.3
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

실시예 6:팩

하기 표 14에 기재된 조성으로 딱총나무 및 으아리 추출물을 함유하는 팩을 통상의 방법으로 제조하였다.

성 분	함량(중량%)
딱총나무 추출물	0.5
으아리 추출물	0.5
에틸알코올	3.0
EDTA-2Na	0.02
프로필렌 글리콜	5.1
글리세린	4.5
카보폴	1.0
폴리옥사이드	0.1
방부제	미량
향	미량
정제수	잔량
계	100

Claims (7)

1. 딱총나무 줄기 추출물 및 으아리 뿌리 추출물이 1:1의 중량비로 이루어진 딱총나무 및 으아리 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 혼합추출물은 서브마이크론캡슐화, 마이크로캡슐화 또는 리포좀화 된 것임을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 콜라겐생성 촉진에 의하여 주름을 개선하는 것임을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 엘라스타제 저해활성 및 MMP-1 생성 억제에 의하여 주름을 개선하는 것임을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 딱총나무 및 으아리 혼합추출물이 조성물 전 중량에 대해서 0.005~50중량% 함유되는 것임을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형으로 이루어지는 것임을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.