KR101286140B1 - 연근 다당체를 함유하는 피부보습 및 피부자극완화용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 연근 다당체를 함유하는 피부보습 및 피부자극완화용 화장료 조성물 및 유효성분으로서의 연근 다당체의 제조 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따르면 연근 다당체를 조성물 전체 중량에 대하여 0.005 ~ 5 중량%로 함유하는 피부 보습 및 피부 자극완화용 화장료 조성물이 제공된다. 본 발명의 연근 다당체는 피부보습, 항염 활성을 갖고, 락트산, 소듐라우릴설페이트, 글리콜산, 살리실산 또는 레티놀 등과 같은 피부 자극성이 큰 화장료에 의한 피부 자극을 최소화 할 수 있어 이를 함유하는 화장료조성물은 우수한 피부 보호 효능을 가진다.

Description

연근 다당체를 함유하는 피부보습 및 피부자극완화용 화장료 조성물{Cosmetic composition for moisturizing and anti-irritation of skin containing polysaccharide from Nelumbo nucifera Rhizome}

본 발명은 연근 다당체를 함유하는 피부보습 및 피부자극완화용 화장료 조성물 및 유효성분으로서의 연근 다당체의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 항염 활성을 갖고, 락트산, 소듐라우릴설페이트, 글리콜산, 살리실산 또는 레티놀 등과 같은 피부 자극성이 큰 화장료에 의한 피부 자극을 최소화할 수 있는 연근 다당체를 제조하고, 이를 이용하여 피부 보습 효과가 우수할 뿐만 아니라, 항염증효과와 자외선 조사시 홍반 생성 억제 효과가 우수하여 피부 자극성 원료에 의해 초래되는 피부 자극을 크게 억제하는 피부자극 완화용 화장료를 제조하는 기술에 관한 것이다.

피부는 신체 중 가장 큰 기관으로 항상 외부와 접하고 있으면서, 여러 가지 자극이나 건조한 환경으로부터 생체를 보호하는 보호막의 역할을 하고 있으며, 다른 기관에 비하여 새로운 세포의 생성과 소멸이 활발히 일어나는 기관이다. 또한, 물리적인 찰과상으로부터 보호하고, 몸 안에 가지고 있는 물의 손실을 막아주며, 태양으로부터 나오는 해로운 자외선으로부터 보호해주고, 몸의 체온을 조절해주는데 매우 중요한 역할을 담당하고 있다. 아기 피부는 하얗고 부드러우며 여드름 같은 염증이 없는 것이 일반적이다. 그러나 아기 피부는 결코 여성들이 이상적이라 생각하는 것처럼 좋은 것은 아니다. 오히려 극히 미성숙한 상태로 인해 외부와의 경계를 이루는 각질층이 성인에 비해 얇고 각질층의 수분 함유량 및 각질층이 보유한 가장 중요한 기능 중 하나인 표피의 보호 장벽 기능이 약한 것이다. 이러한 이유로 아기피부는 외부영향에 민감하며, 바이러스에 쉽게 노출될 수 있다. 이렇듯 아기 피부는 건조한 피부가 되기 쉽고 이 건조한 피부는 면역기능이 약화되어 아토피 피부염뿐만 아니라 여러 피부 질환으로 발전할 수도 있으며, 마찬가지로 약하고 민감한 피부일수록 항염 및 피부 자극완화 기능의 강화가 절실하다고 하겠다.

일반적으로 피부에 적용되는 제품 가운데는 자극이나 염증, 알레르기를 유발할 수 있는 물질을 함유하고 있는 경우가 많아서 개인 관리 제품 (Personal care products)을 사용하는 사람 중 10% 이상이 피부에 대한 부작용을 호소하고 있으며, 1990년대 미국에서 소비자를 대상으로 조사한 결과 50% 이상이 자신을 민감성 피부라고 생각하고 있는 것으로 나타났다. 더구나, 최근의 화장품은 피부에 실질적인 효과(real effect)를 줄 수 있는 기능성화장품(cosmeceutical)에 치중하는 경향을 보이므로 화장품 등의 개인 관리 제품의 사용으로 인한 피부 부작용은 점점 증가할 것으로 보인다.

이처럼 민감 피부라고 느끼고 있는 비율이 증가하고 있는 요인은 오존층 파괴에 따른 자외선 조사량 증가, 생활공간의 건조화, 개인의 알레르기 체질, 스트레스, 화학 유해 물질의 증가 등이 거론되고 있으며, 한편으로 최근 소비자의 지향이 자연 친화적, 저 자극으로 이행되고 있는 것도 민감 피부에 대한 의식을 향상시키는 요인이 되고 있는 것으로 추측되고 있다. 따라서 화장품의 자극을 완화시켜 주는 물질에 대한 관심이 높아지고 있다.

화장품을 만들기 위해서는 다양한 원료들이 사용되며 통상적으로는 20종에서 50여 종까지의 원료를 사용하게 된다. 이들 원료들은 피부자극 검사를 통하여 그 안전성이 입증되었으나 제품에 적용됨으로써 피부에 염증, 가려움증 및 알레르기 등의 자극을 일으킬 수도 있다. 이러한 반응들이 모든 사람에게 일어나는 것은 아니며, 특정인에게만 일어날 수도 있다.

종래, 피부자극을 완화하기 위한 여러 가지 방법이 시도되어 왔으며, 예를 들면 피부 자극을 유발하는 물질을 제거하는 방법이 시도되었다. 그러나 기능성 원료 자체가 자극원으로 작용하는 경우가 허다하기 때문에 이와 같은 연구에는 한계가 있다. 이에 기능성 원료의 효과는 그대로 유지하고, 부작용을 줄이면서 자극완화 효과를 갖는 물질을 찾는 것이 필요하다.

이러한 물질 가운데 하나로서 종래 연근추출물을 피부자극완화용 화장료에 사용된 예가 개시된 바 있다. 대한민국공개특허 제2012-0023934호 "산화 염색용 염모제 조성물"에는 '녹차다당체, 편백다당체, 작약, 연근 및 한련초로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 천연성분; 탄수화물 또는 그 유도체; 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 케라틴 섬유의 산화염색용 염모제 조성물은 모발에의 염착성을 향상시켜 염색성과 색상의 지속성이 향상될 뿐만 아니라 모발손상을 완화하고 염색시 염모제로 인해 발생하는 알레르기나 염증으로부터 두피를 보호해주고 피부 자극 완화 효과도 우수하다'는 것이 개시되어 있다. 또한, 대한민국 공개특허 제2011-0115047호 "연꽃, 연잎, 연줄기, 연근, 연자육의 열수 추출 방법 및 그에 의하여 제조된 추출물을 유효 성분으로 하는 주름 개선 효과를 가지는 화장료 조성물"에는 연근의 열수추출물이 주름 개선효과를 가진다는 것이 개시되어 있다.

이와 같이 일반적인 연근추출물을 함유하여 피부 상태를 개선하는 화장료 조성물이 이용된 사례가 있었으나, 연근 다당체를 이용한 화장료 조성물에 대해서는 개시된 바가 없다. 본 발명자들이 기능성 원료의 효과를 그대로 유지하면서 화장품에 의한 부작용을 줄이고 피부자극을 완화하는 효과를 갖는 물질을 찾고자 연구 노력한 결과, 특정한 방법에 의하여 제조된 연근 다당체는 항염활성, 자극완화 효과가 매우 우수하다는 것을 확인하였고, 이를 화장료 조성물의 유효성분으로 사용하는 경우, 피부 보습효과와 홍반생성 억제 및 피부자극완화 효과가 우수함을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 연근 다당체를 유효성분으로 포함하는 피부 자극완화용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 연근 다당체를 유효성분으로 포함하는 피부 보습용 화장료 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 피부보습, 항염활성, 자극완화 효과가 우수한 연근 다당체의 제조방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따르면 연근다당체를 조성물 전체 중량에 대하여 0.005 ~ 5 중량%로 함유하는 피부 자극완화용 화장료 조성물이 제공된다. 이때 상기 유효성분으로서의 연근다당체는 서브마이크론캡슐화, 마이크로캡슐화 또는 리포좀화 되어 적용될 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물에는 락트산, 소듐라우릴설페이트, 글리콜산, 살리실산 또는 레티놀이 더욱 함유될 수 있다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따르면 연근다당체를 조성물 전체 중량에 대하여 0.005 ~ 5 중량%로 함유하는 피부 보습용 화장료 조성물이 제공된다.

상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, A)세절한 생연근에 헥산, 에탄올 및 메탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 용매를 넣고 교반한 후, 여과하여 지질이 용해되어 있는 용매를 제거하는 단계; B)얻어진 연근 잔사를 건조하는 단계; C)상기단계에서 제조된 연근 잔사로부터 수용성 활성성분을 추출하기 위해 열수 추출하고, 여과 및 농축하는 단계; D)열수 추출물을 한외여과하여 연근 다당체의 함량을 증가시키는 단계; E)에탄올을 첨가하여 에탄올 침전반응을 수행하는 단계; 및 F)40 ~ 50℃에서 진공 건조하는 단계를 포함하는 연근 다당체의 제조방법이 제공된다. 상기 C)단계에 있어서 열수추출은 30 ~ 40℃의 온도에서 6 ~ 8 시간 행하는 것이 바람직하다. 또한 상기 E)단계에 있어서, 에탄올을 100 ~ 200 ㎖/min의 속도로 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 제조방법에 의하여 제조되는 연근다당체는, 피부보습효과, 항염증 활성 및 피부자극완화 효과를 발휘함으로써 이를 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 피부 보습효과와 함께 자외선으로부터 유발되는 홍반생성을 억제하여 피부 염증 반응과 피부 자극을 개선하는 효과가 매우 우수하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 연근 다당체가 UV에 의해 유발된 염증 반응 유발인자인 종양괴사인자(TNF-α)의 발현을 농도 의존적으로 감소시키는 것을 나타내는 그래프 도이다.

본 발명의 연근은 수생식물인 연(Nelumbo nucifera)의 땅속 줄기이다. 연은 한국, 시베리아 지역의 못이나 늪지에서 자라는 다년생 수초로서 예전에는 연꽃을 관상용으로, 연은 차와 술로 이용되었으나 근대에 이르러 연근 및 연잎, 연꽃을 식용이나 약용으로 많이 이용하게 되었다. 특히 뿌리줄기의 끝부분이 굵어져 식용으로 사용하는 부분인 연근(Nelumbo nucifera Gaertn.)은 한방과 민가에서 어혈을 풀거나 신경통 및 류머티즘의 치료에 사용하였으며, 스트레스, 출혈성 위궤양이나 위염에 널리 이용되어 왔다. 연근과 연잎은 메틸코리팔린(methylcorypalline), 디메틸코캐우린(diemthylcocaeurine), 베타-시스토스테롤(β-sistosterol), 캠페롤(kaempferol), 쿼세틴(quercetine) 및 탄닌산(tannic acid) 등의 다양한 생리활성 성분을 함유하고 있으며, 연근 및 연잎의 효능에 관한 연구는 혈장 콜레스테롤 감소, 심장병과 대장암 예방효과, 당뇨병 예방효과, 항암효과 및 항산화 효과 등이 보고되어 왔다.

일반적인 연근추출물은 물 또는 에탄올 수용액 등으로 연근의 다양한 성분을 추출한 혼합 추출물인데, 이에 포함된 지질, 단백질 등으로 인하여 피부 적용 화장료 조성물에 사용시, 변색이나 현탁 등의 문제를 야기한다. 하지만 본 발명의 연근다당체는 주로 다당체로만 이루어져 있기 때문에 이러한 문제점을 발생시키지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 본 발명 연근 다당체는 다음과 같은 제조방법에 의하여 제조된다.

먼저, 생연근에서 지질을 제거하기 위해서 용매 추출 방법을 사용한다. 추출 용매로는 헥산, 에탄올 및 메탄올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용하는 것이 바람직하며, 화장료 적용시 잔존량으로 야기될 수 있는 독성 문제를 방지하기 위해서 에탄올을 사용하는 것이 보다 바람직하다.

세절한 생연근에 상기 용매를 넣고 상온에서 충분히 교반한 후, 여과를 통해 지질이 용해되어 있는 용매를 제거한다. 얻어진 연근 잔사를 건조하면 지질성분이 함유되지 않은 연근을 얻을 수 있다.

상기에서 제조된 연근 잔사로부터 수용성 활성성분을 추출하기 위해 열수 추출시킨다. 열수 추출은 30 ~ 40℃의 온도에서 수행하는 것이 바람직하다. 이는 40℃ 초과시 고온으로 인하여 열변성이 생길 수 있으며, 30℃ 미만일 경우는 다당체가 충분히 추출되지 않기 때문이다. 또한, 열수 추출 시간은 6 ~ 8 시간이 바람직하다. 이는 8시간 초과시 미생물에 의한 오염으로 인해 악취가 발생할 수 있고, 6시간 미만이면 다당체가 충분히 추출되지 않기 때문이다. 열수 추출하여 얻어진 추출액은 여과 기기를 이용하여 여과한 후 감압 농축한다.

상기 열수 추출물에서 다당체만을 분리하기 위해서 한외여과 및 에탄올 침전 반응을 수행한다. 다당체는 10만 달톤(dalton) 이상의 분자량을 갖고 있으며, 이는 유리 단백질의 분자량보다 훨씬 큰 값이다. 이러한 분자량의 차이를 이용하여 한외여과를 수행함으로써 연근 다당체의 함량을 증가시킬 수 있다. 또한, 한외여과는 공정이 상온에서 이루어지기 때문에 열변성의 문제가 발행하지 않는다는 장점을 갖는다.

그 다음, 상기 한외 여과 농축액에 에탄올을 서서히 가해 에탄올 침전반응을 진행한다. 이때, 에탄올의 첨가속도는 100 ~ 200 ㎖/min이 바람직하고, 200ml/min를 초과하면 최종 생성 입자의 크기가 너무 커지거나 뭉칠 수 있다. 에탄올 침전 반응이 완료되면 에탄올을 제거하고, 얻어진 연근다당체를 40 ~ 50℃에서 진공 건조하면 파우더 형태의 연근다당체를 얻을 수 있다.

본 발명의 연근다당체는 피부보습효과를 가지며, 염증 인자인 종양괴사인자(TNF-α)에 대한 발현을 억제하여 항염활성을 가지고, 기능성 화장품에 포함되는 성분 중의 하나인 레티놀과 같은 피부 자극물질에 의해 유발되는 피부 자극을 완화시키는 효과가 우수하다는 것이 확인되었다.

따라서, 본 발명의 연근다당체를 포함하는 자극완화용 화장료 조성물은 피부 보습효과와 함께 자외선으로부터 유발되는 홍반생성을 억제하여 피부 염증 반응과 피부 자극을 개선하는 효과가 있어 피부 보습, 아토피 등의 피부 건조 질환의 예방 및 개선, 항염증, 피부 재생들의 피부 트러블 예방 또는 개선 용도로 매우 유용하다.

본 발명의 유효성분으로서의 연근 다당체는 자극완화용 및 보습용 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.005 ~ 5 중량%로 함유되는 것이 바람직하다. 그 함량이 0.005 중량% 미만이면 효과가 미미하여 유효성을 기대하기 어렵고, 5 중량%를 초과하면 제형 안정성에 문제가 생길 수 있기 때문이다.

이때, 상기 연근 다당체는 서브마이크론캡슐, 마이크로캡슐, 리포좀등의 제형으로 적용될 수 있다. 만약 상기 연근 다당체를 함유하는 서브마이크론캡슐, 마이크로캡슐, 리포좀등의 제형으로 용액 또는 파우더 형태로 존재한다면 당업자는 상기 농도 범위 내에서 본 발명에 따른 조성물 내에 이 용액 또는 파우더의 양을 조절할 수 있을 것이다. 또한, 상기 화장료조성물은 다른 기능성 성분으로서 락트산, 소듐라우릴설페이트, 글리콜산, 살리실산 또는 레티놀이 함유될 수 있다. 이와 같은 기능성 성분들이 피부의 자극을 초래할 수 있지만, 본 발명의 연근 다당체가 피부 자극을 감소시켜 주므로 이들 기능성 성분들의 기능을 최대로 발휘할 수 있도록 해 준다.

본 발명의 연근다당체를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물로 제조되는 화장품은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연 화장수가 있다. 또한, 본 발명의 연근다당체를 함유하는 화장품 이외에도 피부 과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소 적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 연근다당체에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고 상기의 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형으로 적용될 수 있다.

[실시예]

이하, 하기의 실시예 및 시험예들을 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 범위가 하기 예들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 연근다당체의 제조

세절된 생연근(1kg)에 에탄올(10ℓ)를 첨가하여 상온에서 24시간 동안 교반 한 후, 여과를 한 후 원심분리형 탈수기를 통해 용매를 제거하였다. 제조된 연근 잔사를 40℃에서 8시간 동안 열수 추출하고 얻어진 열수 추출액은 누체(Nutsche) 감압여과기를 이용해 여과보조제인 규조토를 첨가하여 여과 및 회수한 후, 초기 부피의 1/10이 되도록 50℃에서 감압 농축하였다. 이어서, 상기 농축액을 한외여과(분자량 CUT OFF: 1,000 달톤)하여 저분자량의 유리 단백질을 제거하고, 최종 한외 여과농축액의 5배 부피의 에탄올을 100 ㎖/min의 속도로 서서히 가하여 에탄올 침전반응을 진행하였다. 침전된 연근다당체를 50℃에서 진공 건조하여 파우더 형태의 연근다당체 (32g)을 얻었다.

비교군으로 연근을 열수 추출하여 파우더화한 일반 연근추출물을 만들어 시험에 이용하였다.

상기 실시예 1에서 제조한 연근다당체를 농도별로 디메틸설폭사이드에 희석하여 제조한 희석용액을 실험에 사용하였다.

시험예 1: 세포독성시험

제조한 연근다당체를 가지고 유효성시험에 들어가기 전 농도별 세포성장률을 확인함으로써 적절한 시험 시료농도를 산출하고 사용하는 농도가 안전에 영향을 미치는지에 대한 확인시험으로 세포독성시험을 실시하였다.

실험에 사용된 세포는 HaCaT(Human Skin Keratinocytes cell line)이며 37℃, 5%의 CO2, 10%의 Fetal bovine serum(FBS, Lonza), 50μg/mL의 streptomycin(Sigma)을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Invitrogen)에서 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 실시예 1에서 제조한 연근다당체를 최종 농도가 100, 500, 1000, 5000㎍/㎖가 되도록 디메틸설폭시드에 희석하여 제조한 희석용액을 처리하여 24시간 배양한 후에 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium boromide, Sigma, U.S.A.)용액을 각 well에 100㎕씩 첨가한 후 (3㎎/㎖) 4시간 동안 더 배양하였다. 이후 상층액을 제거하고, 150㎕의 디메틸설폭시드를 첨가한 후, 30분간 shaking하여 생성된 formazan을 녹여 multimicroplate reader(Molecular device Spectra max190)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 아래의 식에 따라 계산하였으며 그 결과는 하기의 표 1에 나타내었다.

세포 생존율(%)=시료첨가군의 흡광도 / 대조군의 흡광도 × 100

시료물질	시료 농도(㎍/㎖)	세포 생존율(%)
연근다당체	100	100
	500	100
	1000	100
	5000	99.28
Control		100

상기 표 1의 결과에서 보는 바와 같이, 연근다당체를 적용한 시료 모두 99% 이상의 세포생존율이 확인됨에 따라 세포 독성에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었고, 이에 연근다당체가 안전에는 문제가 없는 것을 확인하였다.

시험예 2 : 항염 효능 시험

상기 실시예 1의 연근다당체의 항염 활성 효과를 확인해 보기 위해 초기 염증성 분자 중 하나인 종양괴사인자(TNF-α) 생성에 대한 효과를 알아보았다.

TNF-α와 같은 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 형성은 포스포리파제 A2(phospholipase A2)의 활성으로 인해 아라키돈산(arachidonic acid)이 프로스타글란딘 (prostaglandin)으로 바뀌는 과정 및 NO 형성 과정으로 이어지게 된다. 실험에 사용된 세포는 HaCaT(Human Skin Keratinocytes cell line)이며 37℃, 5%의 CO2, 10%의 Fetal bovine serum(FBS, Lonza), 50μg/mL의 streptomycin(Sigma)을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Invitrogen)에서 배양하였다. 배양 후 1시간 동안 UV를 조사시켜 세포에 스트레스를 주었다. 대조구로는 시료를 처리하지 않고 UV를 조사한 세포를 사용하였다.

RNA 분석을 위해 세포 내의 total RNA를 세포 배양으로부터 Trizol reagent(Invitrogen, USA)를 사용하여 추출하였다. RNA의 순도와 무결성은 A260nm/A280nm비율 측정을 통해 확인하였고, RNA 수율은 260nm에서 흡광도로 측정하였다. cDNA합성은 3㎍의 total RNA를 Oligo dT 15(500ng/㎕l) primer, dNTP (10mM), RTase inhibitor(40 U/㎕), Powerscript Ⅱ RTase(Clontech, USA)를 첨가하여 25℃에서 10분간 primer annealing, 42℃에서 60분간 cDNA를 합성하고 95℃에서 5분간 RTase denaturation 시켰다. PCR은 cDNA로부터 TNF-α, GAPDH를 증폭하기 위하여 cDNA 3㎕, 10X taq polymerase buffer 5㎕, 10mM dNTP 2㎕, 10pmol primer 각각 2㎕, taq polymerase 0.5㎕를 혼합하고 증류수를 더하여 50㎕로 조정한 후 증폭시켰다. 프라이머 서열은 표 2에 나타내었다. PCR에 의하여 생성된 산물은 1% 아가로우스 겔(agarose gel)에서 전기영동하여 image analyzer(UGEN, U:Genius)로 확인하였으며 각 밴드의 밀도는 밀도계측프로그램(Gene Tools from Syngene)을 이용하여 측정하였다.

Gene		Primer sequence
GAPDH	Forward	5' - AAC GAA TTT GGT CGA ACA GC - 3'
	Reverse	5' - TGA GGA GGG ATT CAG TG - 3'
TNF-α	Forward	5' - CAG AGG GAA GAG TTC CCC AG - 3'
	Reverse	5' - CCT TGG TCT GGT AGG AGA CG - 3'

그 결과를 하기의 표 3과 도 1에 나타내었다.

TNF-α expression(%)	미조사	UV 조사
	0.00%	0.00%	0.01%	0.05%	0.10%	0.50%
Blank	6.18	100.00
연근다당체			62.99	35.50	10.06	6.76
연근추출물			95.74	77.70	70.58	58.55
α-Bisabolol						28.75

상기 표 3과 도 1에서 확인되는 바와 같이, 본 발명에 의한 연근다당체는 UV에 의해 유발된 염증 반응 유발인자인 종양괴사인자(TNF-α)의 발현을 농도 의존적으로 감소시킴으로써 염증반응을 억제한 것을 알 수 있었다. 그러므로, 연근다당체는 피부 염증 반응을 효과적으로 억제하며, 이로써 피부 트러블을 완화시키는 효능 또한 뛰어나다. 또한 본 발명의 연근 다당체는 일반적인 연근추출물에 비하여 그 효능이 매우 우수하였다.

시험예 3: 레티놀에 의한 피부세포 자극에 대한 연근다당체의 완화 효과

인간 피부 세포인 HaCaT(Human Skin Keratinocytes cell line)를 DMEM(Sigma) 배지가 있는 T-75 플라스크(Falcon, USA)에서 80% 정도 성장할 때까지 배양하고, 다시 DMEM(Sigma) 배지가 있는 96-웰 플레이트(Falcon, USA)에서 1ㅧ10⁵ cfu/well 이 될 때까지 12시간 동안 배양하였다. 배양 후, 현미경을 통해 세포가 완전히 부착되어 잘 성장하는지 여부를 확인하고, 피부 세포 자극원으로 0.005% 레티놀을 이용하여 다음과 같이 실험을 진행하였다. 상기 레티놀의 농도에서 정상 피부세포는 일반적으로 모두 사멸한다. HaCaT cell이 배양된 상기 플레이트의 96 웰 각각에 0.005% 레티놀이 함유된 DMEM(Sigma) 배지를 200 ㎕씩 첨가하고, 이어 실시예 1에서 준비된 연근다당체를 각각 0.01, 0.05, 0.1 그리고 0.5 %로 첨가하였으며, 대조군에는 레티놀과 연근다당체를 첨가하지 않았고, 비교군으로는 레티놀만 첨가한 것과 연근다당체만 첨가한 것을 별도로 준비하였다.

시험 물질을 첨가하고 12시간이 경과한 후에, 세포의 생존율을 비교하기 위하여 MTT시약을 각 웰에 10 ㎕씩 첨가하고, 4시간 동안 방치한 후, ELISA 기기(Molecular Devices 사)를 이용하여 각 세포의 흡광도를 측정하고, 다음과 같은 수학식으로 세포 생존율을 측정하였으며, 그 결과는 다음 표 4에 정리하였다.

세포 생존율(%) = [(대조군 흡광도-시험물질 흡광도)/대조군 흡광도]×100

연근다당체 농도(%)	세포 생존율(%)
	연근다당체	연근다당체 + 레티놀	레티놀
0.01	100	37.01	세포 모두 사멸
0.05	100	64.50
0.1	100	89.94
0.5	99.28	93.24

상기 표 4의 결과에서 보는 바와 같이, 연근다당체는 레티놀에 의한 피부 세포 사멸을 억제하는 효과가 있다. 즉, 연근다당체가 피부 자극물질에 의해 유발되는 피부 자극을 완화시키는 효과가 우수함을 알 수 있었다.

실시예 2: 에멀젼 베이스 제조

본 발명의 연근다당체를 함유하는 화장료 조성물의 피부 보습 효과와 함께 자외선으로부터 유발되는 홍반생성을 억제하는 효과에 대한 임상시험을 위해 하기 표 5의 조성에 따라 에멀젼 베이스를 제조하였다.

비교예 1, 대조예 1: 에멀젼 베이스 제조

하기의 표 5의 조성과 같이 연근추출물만을 함유하거나 본 발명의 연근다당체와 연근추출물을 모두 함유하지 않는 에멀젼 베이스를 제조하여 비교예 1과 대조예 1로 하였다.

성분	중량%
	실시예 2	비교예 1	비교예 2
글리세린	3.00	3.00	3.00
디소듐이디티에이	0.02	0.02	0.02
폴리글리세릴-3-메틸글루코스 디스테아레이트	1.50	1.50	1.50
세테아릴알코올	0.50	0.50	0.50
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	7.00	7.00	7.00
폴리아크릴아마이드&C13-14이소파라핀&라우레스-7	0.60	0.60	0.60
연근다당체	0.5	-	-
연근추출물	-	0.5	-
향, 방부제	미량	미량	미량
정제수	잔량	잔량	잔량
계	100	100	100

시험예 4: 인체 적용시 수분 보유능의 평가

본 발명의 연근다당체를 함유하는 화장료 조성물에 대한 피부보습효과를 평가하기 위하여, 상기 실시예 2, 비교예 1 및 대조예 1의 각 시험물질이 도포된 피부를 대상으로 하여 수분 보유능을 다음과 같이 측정하였다.

수분 보유능의 측정은 실내온도 22℃ 및 상대습도 45%의 항온 항습실에서 상기 실시예 2, 비교예 1 및 대조예 1을 20명의 피시험자 전박 안쪽에 일정량(0.01g/4㎠)을 도포하고, 도포전, 도포 1시간 후 및 도포 2시간 후의 피부의 수분 함량을 측정하였다. 측정 기기는 피부의 수분 함량에 따른 피부의 전기 용량을 측정하여 보습력을 측정하는 수분 함량측정기(corneometer CM820, Courage + Khazaka, Cologne, 독일)를 사용하였다. 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다.

구 분	실시예 2	비교예 1	대조예 1
도포전 피부 전기전도도	50	50	50
도포 1시간 후 피부 전기전도도	82	65	58
도포 2시간 후 피부 전기전도도	78	57	53

상기 표 6으로부터 본 발명의 연근다당체가 함유된 에멀젼타입의 경우, 비교예 1과 대조예 1에 비해서 피부의 전기 전도도가 높게 나타난다. 이에 따라 수분 보유능이 우수한 것으로 보습효과를 갖는 소재임을 알 수 있다.

시험예 5 : 자외선 조사 시 홍반생성 억제효과

상기 본 발명의 연근다당체가 함유된 에멀젼타입의 경우, 자외선 조사 시 홍반생성 억제효과를 알아보기 위해 색차계(Chromameter CR 300, Minolta)를 이용하여 a값을 산출하였다. 건강한 여성 10명(평균연령 31세)을 대상으로 피검자의 팔 위쪽 부위에 자외선을 0.88 J/㎠, 1회/1일 3회 조사하였다. 각 시험부위에, 실시예 2, 비교예 1 및 대조예 1을 2회/1일, 30일간 도포하여, 도포 전의 a값과 도포 후 시간의 경과에 따른 a값의 차이인 △a 값을 하기 수학식에 따라 구하여 홍반 생성 억제 효과를 비교하였으며, 그 결과는 표 7에 나타내었다.

홍반생성 억제효과(%)= (도포전의 a값-도포후의 a값)/도포전의 a값 × 100

구 분	홍반생성 억제효과 (%)
실시예 2	89.0
비교예 1	54.3
대조예 1	24.5

상기 표 7로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 연근다당체를 함유하고 있는 에멀젼베이스는 비교예 1 및 대조예 1에 비해서 자외선에 의한 홍반생성을 억제하는 탁월한 효과를 나타내었다.

시험예 6 : 인체 피부 첩포시험

본 발명의 연근다당체를 함유한 화장료 조성물의 자극완화 효과 및 피부안전성을 확인하기 위하여 과거력상 피부자극에 과민 반응을 보인 적이 없으며, 현재 피부병 내지 피부 알러지 증상이 없는 20~30대 여성 20명을 대상으로 인체 피부첩포시험을 하였다. 피부 자극 물질인 락틱산 5.0% 본 발명의 제형인 실시예 2, 비교예 1 및 대조예 1에 첨가하여 시험에 사용하였다. 우선 시험 부위를 70% 에탄올로 닦아낸 뒤 건조시켰다. 준비된 시험 물질을 15㎍씩 핀챔버(Finn chamber, 100x 10, EPITEST, 핀란드) 내에 적하시킨 후, 시험대상자의 전박(forearm) 안쪽 부위에 밀폐 첩포하였다. 24시간 동안 첩포하고, 첩포를 제거한 후, 펜으로 시험부위를 표시하였다. 표시 후 각각 1시간 및 24시간 후에 확대경(8MC-150, DAZOR, 미합중국)을 이용하여 시험부위를 관찰하여 홍반 및 부종 유무를 관찰하였다. 피부 반응은 국제접촉피부염연구회(ICDRG, International Contact Dermatitis Research Group)의 규정에 따라 판정하고, 하기식에 따라 평균피부반응도(mean response rate)를 구하고, 그 결과를 표 9에 나타내었다. 피부반응의 평가기준 및 점수는 표 8에 나타내었다.

평균피부반응도 = (점수 × 반응 수 × 100 × 1/2) ×

[3(최대점수) × 총 피검자수(n)]

기 호	점 수	평가 기준
-	0	무반응
±	0.5	희미한 또는 가벼운 홍반
+	1	경계가 뚜렷하나 약한 홍반, 부종 및 구진
++	2	뚜렷한 홍반, 구진 및 소수포
+++	3	심한 홍반 및 대수포, 가피 형성

시험물질	1시간 후			24시간 후			반응도(%) (n=20)
	±	+	++	±	+	++
실시예 2	6	-	-	2	-	-	3.33
비교예 1	9	1	-	4	1	-	7.08
대조예 1	13	3	-	5	3	-	12.50

상기 표 9로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 연근다당체를 함유하고 있는 에멀젼타입인 화장료 조성물은 비교예 1 및 대조예 1의 화장료조성물에 비하여 피부 자극 완화효과가 우수함을 알 수 있었다.

시험예 7: 제형의 안정성 실험

상기 본 발명의 연근다당체를 함유한 화장료에 대한 안정성 시험을 하기의 방법으로 실시하였다. 화장료의 안정성을 시험하기 위해 상기 실시예 2, 비교예 1 및 대조예 1을 45℃로 일정하게 유지되는 항온조에서 불투명 초자 용기에 담아 12동안 보관하고 또한 4℃로 일정하게 유지되는 완전히 차광된 냉장고 내에서 불투명 초자 용기에 담아 12주 동안 보관한 후, 변색 및 변취, 분리정도를 비교 측정하여 그 결과를 하기 표 10에 기재하였다. 이 때 제품 변색 및 변취, 분리정도를 다음의 6등급으로 분류하여 평가하였다.

0:변화없음 1:극히 조금 분리(변색, 변취)

2:조금 분리(변색, 변취) 3:조금 심하게 분리(변색, 변취)

4:심하게 분리(변색, 변취) 5:극히 심하게 분리(변색, 변취)

구 분	제형의 안정성
	실시예 1		비교예 1		대조예 1
	45℃	4℃	45℃	4℃	45℃	4℃
변색	0	0	2	0	0	0
변취	0	0	1	0	0	0
분리	0	0	0	0	0	0

상기 표 10으로부터 알 수 있는 바와 같이, 실시예 2와 대조예 1에는 45℃와 4℃에서 변색이나 변취, 분리 현상이 거의 없이 안정하였고, 연근다당체가 제형 내에서 안정한 상태로 존재함을 나타낸다.

본 발명의 연근다당체를 함유하는 화장료 조성물은 하기의 여러 제형으로 제조될 수 있다.

실시예 3: 유연 화장수

하기 표 11에 기재된 조성으로 연근다당체를 함유하는 유연 화장수를 통상의 방법으로 제조하였다.

성분	함량(중량%)
연근다당체	0.5
1,3-부틸렌 글리콜	5.2
올레일알코올	1.5
에탄올	3.2
폴리솔베이트 20	3.2
벤조페논-9	2.0
카르복실비닐폴리머	1.0
글리세린	3.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

실시예 4: 영양 화장수(밀크로션)

하기 표 12에 기재된 조성으로 연근다당체를 함유하는 영양 화장수를 통상의 방법으로 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
연근다당체	0.5
글리세린	5.1
프로필렌글리콜	4.2
토코페릴아세테이트	3.0
유동파라핀	4.6
트리에탄올아민	1.0
스쿠알란	3.1
마카다미아너트오일	2.5
폴리솔베이트 20	1.6
솔비탄세스퀴롤레이트	1.6
프로필파라벤	0.6
카르복실비닐폴리머	1.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

실시예 5:영양 크림

하기 표 13에 기재된 조성으로 연근다당체를 함유하는 영양 크림을 통상의 방법으로 제조하였다.

성 분	함량(중량%)
연근다당체	0.5
친유형 모노스테아린산글리세린	2.0
스테아릴알콜	2.2
스테아린산	1.5
밀납	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6
정화식물유	1.0
스쿠알란	3.0
광물유	5.0
트리옥타노인	5.0
디메치콘	1.0
소듐마그네슘실리케이트	0.1
글리세린	5.0
베타인	3.0
트리에탄올아민	1.0
소듐히아루로네이트	4.0
방부제,향,색소	미량
정제수	잔량
합계	100

실시예 6: 맛사지 크림

하기 표 14에 기재된 조성으로 연근다당체를 함유하는 맛사지 크림을 통상의 방법으로 제조하였다.

성 분	함량(중량%)
연근다당체	0.5
글리세린	4.0
바셀린	3.5
트리에탄올아민	0.5
유동파라핀	24.0
스쿠알란	3.0
밀납	2.1
토코페릴아세테이트	0.1
폴리솔베이트 60	2.4
카르복실비닐폴리머	1.0
솔비탄세스퀴올레이트	2.3
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

실시예 7:팩

하기 표 15에 기재된 조성으로 연근다당체를 함유하는 팩을 통상의 방법으로 제조하였다.

성 분	함량(중량%)
연근다당체	0.5
에틸알코올	3.0
EDTA-2Na	0.02
프로필렌 글리콜	5.1
글리세린	4.5
카보폴	1.0
폴리옥사이드	0.1
방부제	미량
향	미량
정제수	잔량
계	100

Claims (8)

1. 연근 다당체를 조성물 전체 중량에 대하여 0.005 ~ 5 중량%로 함유하는 피부 자극완화용 화장료 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 연근 다당체는 서브마이크론캡슐화, 마이크로캡슐화 또는 리포좀화 되어 적용되는 것임을 특징으로 하는 피부 자극완화용 화장료 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 화장료 조성물에는 락트산, 소듐라우릴설페이트, 글리콜산, 살리실산 또는 레티놀이 더욱 함유되는 것임을 특징으로 하는 피부 자극완화용 화장료 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형을 가지는 것임을 특징으로 하는 피부 자극완화용 화장료 조성물.
5. 연근 다당체를 조성물 전체 중량에 대하여 0.005 ~ 5 중량%로 함유하는 피부 보습용 화장료 조성물.
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