KR20100102439A

KR20100102439A - 조직배양한 금선련 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 상기 조직배양한 금선련 추출물의 제조방법

Info

Publication number: KR20100102439A
Application number: KR1020090020817A
Authority: KR
Inventors: 최종완; 정민석; 권주찬
Original assignee: 주식회사 한국화장품제조
Priority date: 2009-03-11
Filing date: 2009-03-11
Publication date: 2010-09-24
Also published as: KR101093901B1

Abstract

본 발명은 조직배양한 금선련(tissue cultured Anoectochilus formosanus) 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 상기 조직배양한 금선련 추출물의 제조방법에 관한 것으로서, 본 발명의 화장료 조성물은 항산화 효과, 세포 보호, 미백, 주름개선 효과가 우수하여 피부개선, 피부보호 및 피부노화방지를 위한 화장료 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

조직배양한 금선련, 화장료, 항산화, 세포보호, 미백, 주름

Description

조직배양한 금선련 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 상기 조직배양한 금선련 추출물의 제조방법{A COSMETIC COMPOSITION COMPRISING AN EXTRACT OF TISSUE CULTURED ANOECTOCHILUS FORMOSANUS AND A PREPARATION METHOD OF THE EXTRACT OF TISSUE CULTURED ANOECTOCHILUS FORMOSANUS}

본 발명은 항산화, 세포보호, 미백 및 주름개선 효과가 우수한 조직배양한 금선련 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 상기 조직배양한 금선련 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

피부는 환경적, 물리적, 화학적인 외부자극으로부터 몸을 보호해주는 일종의 방어막으로 생명유지에 매우 중요한 기능을 가진다. 하지만, 이러한 외부자극은 피부에 기미와 잡티와 같은 색소침착성 질환을 일으킬 뿐만 아니라, 피부기능을 저하시키고 피부탄력을 유지시켜주는 섬유소를 파괴시켜 피부의 노화를 촉진한다.

따라서, 현대의 화장품의 기능은 신체를 청결하게 하고 아름답고 쾌적한 생활을 하게 하는 청결과 미적 기능뿐만 아니라, 수분, 공해 물질과 스트레스, 자외선 등의 외적인 요인차단과 자유 라디칼(Free Radical), 활성산소류 등에 피부 노화의 원인을 제거하거나 억제하는 것을 추구한다.

여기서, 자유 라디칼 및 활성 산소류는 생체 내의 각종 효소 반응에 의해 생성되어 생리 활성물질의 생합성, 면역기능, 약물의 대사 등에서 매우 중요한 역할을 한다. 하지만, 자유 라디칼 및 활성 산소류가 과잉 생성될 경우에는 오히려 생체 내 손상을 가져올 수 있다. 예를 들면 자유 라디칼 및 활성 산소류는 세포막 지질, 단백질, 핵산 등의 생체 물질을 산화시키거나 변질시켜 돌연변이, 발암, 노화 등의 원인이 된다. 이 중 노화의 경우, 피부가 태양광에 노출될 때 태양광 중의 자외선에 의해 생성된 반응성이 높은 자유 라디칼 및 활성 산소류가 생체 성분을 산화 또는 변질시킴으로써 발생된다. 여기서, 생체 성분의 산화적 손상은 산소의 분압이 높을 때 인체 등의 유산소 호흡을 하는 생명체의 호기성 물질 대사에서 부산물을 생성하면서 야기된다. 부산물은 반응성이 매우 크고, 생체 내의 여러물질과 반응하여 산화적 손상을 일으키며, 이로 인해 세포의 기능이 저해되고 세포의 사멸(apoptosis)이 초래된다.

따라서, 자유 라디칼 및 활성 산소류로 인한 생체 내 손상을 방지하기 위하여, 생체는 SOD(Superoxide Disumutase) 카탈라아제 등의 효소를 구비하고 있다. 또한, 유해한 자유 라디칼 소거능을 갖고 활성 산소류로부터 세포를 보호할 수 있는 새로운 물질의 개발이 요구되고 있다.

사람의 피부색을 결정하는 데는 여러 요인들이 관여하는데, 그 중에서도 멜라노사이트(melanocyte), 피부의 두께, 혈관의 분포 및 인체 내외의 색소 함유 유무 등의 요인들이 중요하다. 특히, 가장 중요한 요인은 인체 내의 멜라노사이트에서 타이로시나제 등의 여러 효소가 작용하여 생성되는 멜라닌이라는 흑색 색소이 다. 이 멜라닌 색소의 형성에는 많은 요인들이 있다. 특히, 멜라닌 색소는 자외선 노출과 같은 외부환경요인으로부터 발생되는 기미, 주근깨, 색소침착 등과 같은 피부색소 이상침착 증상 등으로 잘 형성된다. 과도한 멜라닌 색소 침착을 치료 또는 경감시켜주기 위해서 여러 가지 물질들이 화장료나 의약품에 배합되어 사용되고 있다. 그러나, 불충분한 미백효과, 피부에 대한 안전성 문제, 화장료에 배합 시, 제형 및 안정성 문제 등으로 인해 그 사용이 제한되고 있다.

또한, 주름은 연령, 외부환경, 자외선 조사 등에 의해서 영향을 받는다. 이러한 영향에 진피 매트릭스를 구성하는 콜라겐, 엘라스틴, GAGs의 생성 및 분해가 원활히 일어나지 않음으로 인해 피부의 탄력이 떨어지고 주름이 생성된다. 레티놀은 잘 알려져 있는 콜라겐 합성을 촉진물질이지만 불안정하고 피부 적용시 자극, 발작 등의 안전성 문제로 사용량의 제한이 있으며, 효과가 기대치에 비해 미미하여 주름 개선효과를 기대하기가 어렵다.

따라서, 노화, 피부색소 이상침착, 주름 등의 피부 현상을 방지하면서 건강하고 아름다운 피부를 유지하기 위한 노력이 계속되고 있다. 최근 피부 개선을 위한 연구 노력은 부작용이 없고 인체 친화적이며 체질과 상관없이 안심하고 사용할 수 있는 식물추출물을 이용한 소재 개발이 활발하게 연구되어 오고 있다.

일반적으로 천연 식물추출물을 함유하는 기능성 화장품은 식물들이 생육할 수 있는 조건인 열대우림기후로부터 냉대, 한대 기후에서 생육하는 모든 식물을 사용할 수 있다. 식물들은 각각의 기후에 적응하여 그 조건에서 최적의 생체 메커니즘을 통해서 생육하게 된다. 따라서 같은 종의 식물이라도 생육하는 위도에 따른 일조량, 기온, 강수량 등과 토양의 산도, 비옥도 등 기후조건과 계절별, 식물체의 부위별로 식물내부의 2차대사산물과 같은 유효성분들의 종류와 함량이 다를 수 있다. 뿐만 아니라, 제조에 따른 공급을 충족시키기가 어렵고, 가공비용이 많이 드는 등의 단점을 극복하기 어렵다.

매력적인 엽맥을 가지고 있기 때문에 보석란(Jewel Orchids)이라 알려진 아넥토킬루스(Anoectochilus) 속의 식물들은 약 50여종으로 스리랑카, 말레이시아, 인도, 일본 중국남부, 호주 그리고 남태평양 섬들의 그늘지고 습기가 많은 곳에서 발견된다. 키는 대략 20-30cm이고 검녹색의 벨벳 같은 느낌의 잎에 복잡하게 그물망처럼 얽힌 은색의 엽맥이 있으며 잎 뒷면은 엷은 자주색 빛을 띤다. 금선련(Anoectochilus formosanus)은 대만의 800-1500m의 산 중턱 그리고 란위(Lanyu)섬에서 자생하며 일본의 류큐(Ryukyu)섬, 중국의 푸젠(Fujian)지방에도 분포하고 있다.

대만의 전통치료제인 금선련(Anoectochilus formosanus)은 식물전초를 말리거나 생초를 끓여 그 추출물을 가슴과 복부통증에 사용하였고 당뇨, 신염, 고열, 고혈압, 발기부전, 간과 비장 장애 등에 이용하였으며 생초는 뱀에 물린데 사용되었다. 또한, 물 추출물은 항바이러스, 항염, 간 보호효과 등의 효능을 나타냈다. 금선련(Anoectochilus formosanus)은 매우 늦게 생장하는 식물로 다 자라서 종자를 생산하기까지 2-3년이 걸리며 종자로 증식할 수 있다. 1년에 한번 10월에서 12월 사이에 꽃을 핀다. 꽃이 피기도 전에 마구잡이식의 채취로 인하여 금선련(Anoectochilus formosanus)의 개체수가 감소하고 있다. 개체수의 감소는 유전자 유동을 저해하고 동종간의 교배를 감소시키며, 결국 생물의 환경적응도를 감소시켜 급격한 개체수 감소를 초래하였다. 따라서 금선련(Anoectochilus formosanus)의 생초와 건초 모두 매우 비싼 값으로 거래되고 있다.

이에, 본 발명자들은, 배양조건을 일정하게 유지하고 일정한 부위를 일정한 품질로 유지할 수 있으며, 또한 수확량의 한계가 있는 야생식물의 경우보다 원하는 만큼의 식물을 배양할 수 있으며, 생육시간도 단축하여 야생식물의 경우 보다 단기간에 배양할 수 있다는 장점을 가지는 식물조직배양 기술을 이용하여 조직배양한 금선련 추출물이 항산화 효과, 세포 보호, 미백, 주름개선효과를 가지고, 상기 추출물을 포함한 화장료 조성물이 피부개선, 피부보호 및 피부노화방지효과를 가지는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 항산화, 세포보호, 미백 및 주름개선 효과를 가지는 조직배양한 금선련 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 상기 조직배양한 금선련 추출물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은, 조직배양한 금선련(tissue cultured Anoectochilus formosanus) 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 a)조직배양한 금선련을 정제수, C1 내지 C4의 알코올 및 C1 내지 C5 알킬렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출용매에 3 내지 30일 동안 침적하여 침적용액을 형성하는 단계; 및 b)상기 침적용액을 여과하여 조직배양한 금선련 추출물을 얻는 단계를 포함하는 조직배양한 금선련 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물은 조직배양한 금선련 추출물을 이용하기 때문에 피부 자극으로부터 자유롭고, 항산화 효과와 세포보호, 미백 및 주름개선 효과를 가지므로 피부노화방지, 피부개선 및 보호에 매우 효과적이다.

본 발명은 조직배양한 금선련 추출물을 포함하는 화장료 조성물 및 상기 조직배양한 금선련 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 화장료 조성물은 조직배양한 금선련 추출물을 함유함으로써, 각종 외부 자극으로부터 피부를 보호하여 피부를 부드럽고 윤기있게 가꾸어주며, 피부기능 개선에 도움을 준다.

상기 금선련은 식물조직배양기술을 이용하여 조직배양하는 것이 바람직하다. 본 발명에 사용된 조직배양 금선련은 충북대학교 첨단원예기술개발연구센터에서 제공 받아 사용하였다.

본 발명의 화장료 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여, 상기 조직배양한 금선련 추출물을 0.1 내지 10.0 중량%로 포함하는 것이 바람직하다. 상기 조직배양한 금선련 추출물이 상술한 범위를 만족하면, 유의성 있는 효과, 즉 각종 외부 자극으로부터 피부를 보호하여 피부를 부드럽고 윤기있게 가꾸어주며, 피부기능 개선에 도움을 주는 효과가 얻어진다. 또한, 최종 제품에서의 추출물의 고유 냄새, 색상 등을 고려할 때 상기와 같은 범위로 포함되는 것이 유리하다.

상기 조직배양한 금선련 추출물은 상기 조직배약한 금선련을 정제수, C1 내지 C4의 알코올 및 C1 내지 C5의 알킬렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매를 사용하여 추출하는 것이 바람직하다.

본 발명의 화장료 조성물은, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 핸드크림, 파운데이션, 메이크업베이스, 트윈케익, 마스카라, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클린저, 수중유(O/W)형의 파우더, 유중수(W/O)형의 파우더 및 실리콘중수(W/Si)형의 파우더 중에서 선택되는 형태로 제형 화될 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

이하, 본 발명의 조직배양한 금선련 추출물의 제조방법에 대하여 설명한다.

본 발명의 조직배양한 금선련 추출물의 제조방법은 a)조직배양한 금선련을 정제수, C1 내지 C4의 알코올 및 C1 내지 C5의 알킬렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출용매에 3 내지 30일 동안 침적하여 침적용액을 형성하는 단계; 및 b)상기 침적용액을 여과하여 조직배양한 금선련 추출물을 얻는 단계를 포함한다.

상기 a)단계에서는, 상기 조직배양한 금선련이 건조된 상태인 것이 바람직하다. 상기 침적시간은 10 내지 20일인 것이 바람직하다.

상기 추출용매는, 상기 건조된 조직 배양한 금선련의 중량에 대비하여, 10 내지 20배(w/w)로 사용하는 것이 바람직하다.

상기 추출용매는, 상기 건조된 조직 배양한 금선련(tissue cultured Anoectochilus formosanus) 의 중량에 대비하여, 10 내지 20배(w/w)로 사용하는 것이 바람직하다.

상기 C1 내지 C4의 알코올은 에탄올인 것이 바람직하고, 상기 C1 내지 C5의 알킬렌글리콜은 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 펜틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것이 바람직하다.

또한, 상기 추출용매가 상기 알코올과 알킬렌글리콜의 혼합용매일 경우, 이들의 혼합비(w/w)가 6:4 내지 9:1인 것이 바람직하다. 상기 알코올과 알킬렌글리콜의 혼합용매의 경우, 함유량이 상술한 범위일 경우, 원하는 유용성분만을 추출하는데 보다 효율적인 극성을 갖는다. 여기서, 상기 알코올과 알킬렌글리콜의 혼합용매에 사용되는 알코올의 농도는 60 내지 100%인 것이 바람직하다.

또한, 상기 추출용매는 상기 정제수와 상기 알킬렌글리콜의 혼합용매일 수 있는데, 이들의 혼합비가 3:7 내지 1:9인 것이 바람직하다.

상기 추출용매가 단독용매일 경우, 바람직하게는 에탄올이고, 혼합용매일 경우, 알코올과 알킬렌글리콜의 혼합용매, 바람직하게는 에탄올과 1,3-부틸렌글리콜, 에탄올과 프로필렌글리콜 또는 에탄올과 펜틸렌글리콜의 혼합용매이고, 더 바람직하게는 에탄올과 1,3-부틸렌글리콜 또는 에탄올과 펜틸렌글리콜의 혼합용매이다.

상기 b)단계는 상기 추출용매를 제거하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조직배양한 금선련 추출물은 상기 조직배양한 금선련 추출물을 사람섬유아세포에 처리하여 피부자극에 대한 세포독성효과를 조사하는 단계, 상기 조직배양한 금선련 추출물을 사람섬유아세포에 처리하여 외부자극에 대한 세포보호효과를 조사하는 단계, 상기 추출물을 사람섬유아세포에 처리하여 콜라겐 생합성에 따른 피부노화방지효과를 조사하는 단계, 타이로시나제 억제에 따른 피부미백개선 효과를 조사하는 단계로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 단계로 활용될 수 있다.

이하, 본 발명을 제조예, 시험예, 및 실시예 등을 통하여 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 하기에 기재된 제조예, 시험예, 및 실시예 등은 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명은 이들에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.

제조예1 내지 제조예4, 비교제조예1 내지 비교제조예4: 조직배양한 금선련 추출물의 제조

조직배양한 금선련과 금선련(Anoectochilus formosanus)을 각각 물로 씻어 거즈로 물기를 제거한 후, 건조 및 세절하여 준비하였다. 상기 준비된 조직배양한 금선련과 금선련을 표 1에 기재된 함량으로, 표 1에 기재된 함량으로 존재하는 혼합용매에 2주간 침적하여 숙성하였다. 그 후 여과지(일본 ToyoroshiKaisha, Ltd.에서 시판되는 5C, 185㎜)에 여과하고 에탄올을 증발시켜 여액 상태인 조직배양한 금선련 추출물을 수득하였다.

	건조된 조직배양한 금선련 (g)	건조된 금선련(g)	추출용매(g)
	건조된 조직배양한 금선련 (g)	건조된 금선련(g)	종류(혼합비)	함량
제조예1	20	-	b-1:b-2=7:3	980
제조예2	20	-	b-1:b-2=6:4	980
제조예3	20	-	b-1:b-3=7:3	980
제조예4	20	-	b-1:b-3=6:4	980
비교제조예1	-	20	b-1:b-2=7:3	980
비교제조예2	-	20	b-1:b-2=6:4	980
비교제조예3	-	20	b-1:b-3=7:3	980
비교제조예4	-	20	b-1:b-3=6:4	980

b-1: 에탄올 b-2: 1,3-부틸렌글리콜

b-3: 프로필렌글리콜

시험예 1: 조직배양한 금선련 추출물의 세포독성 측정

제조예1 및 비교제조예1에 대한 세포독성 시험을 통해, 조직배양한 금선련 추출물의 안전성을 평가하였다.

<세포 배양 (Cell culture)>

ATCC사로부터 구입한 CCD-1064sk 사람섬유아세포를 10% 우태아혈청 (FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 첨가한 이스코브스 모디파이드 둘베코스 미듐(Iscove's modified Dulbeco's medium: IMDM)으로 10㎝ 세포 배양접시에 10 ㎖의 배지로 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 세포가 70 내지 80% 합류(confluency)가 되도록 배양하였다. 상기 배지는 일주일에 두번씩 갈아주고, 합류에 도달한 세포는 트립신-EDTA(trypsin-EDTA)를 사용하여 트립신처리(trypsinization)를 한 후 계대 배양하여 유지하였다. 상기에서 배양된 사람섬유아세포를 96-멀티웰 플레이트(96-multiwell plate)에 각각 1 × 10⁴세포/웰로 분주하고 24시간 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 2% FBS 배지로 교체하고 조직배양한 금선련 추출물인 제조예1과 금선련 추출물인 비교제조예1을 각각 처리 농도별로 배지에 희석하여 처리한 후 48시간 동안 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

시험예1-1: 세포독성효과의 측정(MTT assay)

배양이 끝난 세포에, PBS(phosphate buffered saline)에 용해한 MTT 저장(stock) 용액(5 mg/㎖)을 새로운 배지에서 10배 희석하고, 이 용액을 세포 각각의 웰에 100㎕씩 첨가하여 37℃에서 4시간 반응시켰다. 반응 후 살아있는 세포는 미토콘드리아에 존재하는 탈수소 효소에 의해 노란색의 수용성 기질인 MTT[3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium-bromide]가 비수용성의 MTT-포마즌(MTT-formazan) 결정으로 환원되므로 이것의 양을 재면 세포 생존율을 측정할 수 있다. 배양 상등액을 제거하고 각각의 웰에 DMSO 200㎕를 첨가하여 세포에서 생성된 MTT-포마즌 결정체를 용해시킨 후 흡수분광광도계(UVmax, Molecular Device, USA)로 포마즌의 흡광도가 최대가 되는 시험필터(Test filter)인 540㎚의 파장에서의 O.D값과 참조필터인 630nm 파장의 O.D값을 측정하여 그 차이값의 흡광도를 구하였다 (참고문헌 The EMBO Journal(2002)21, 2407-2417외 다수). 세포 독성은 흡광도의 백분율로 나타내었다.

※ 세포생존율(%) = (시료 처리군 흡광도/무처리군 흡광도)×100

로(Raw) 데이터를 토대로 무처리군의 흡광도와 시료 처리군의 흡광도의 평균을 계산하여 표준편차를 구하였다.

MTT assay	O.D. Mean ± S.D. (% of 대조군)
검약농도 (W/W%)	대조군	1	0.5	0.1	0.05	0.01
제조예1	0.480± 0.013 (100.0)	0.457± 0.011 (95.31)	0.484± 0.013 (100.94)	0.491± 0.011 (102.29)	0.495± 0.021 (103.23)	0.499± 0.021 (103.96)
비교제조예1	0.480± 0.013 (100.0)	0.456± 0.014 (95.10)	0.478± 0.012 (99.58)	0.487± 0.006 (101.46)	0.491± 0.027 (102.29)	0.494± 0.013 (103.02)

시험예1-2: 세포독성효과의 측정(Neutral Red assay)

배양이 끝난 세포에 각각의 웰에 노트랄 리드(Neutral Red, Sigma-aldrich, USA) 50㎍/㎖를 첨가하고 3시간 동안 반응시켰다. 뉴트랄 레드는 완전히 살아있는 세포 또는 손상받지 않는 세포의 리소좀에 농축된다. 반응 후, 세포를 1.0% 포르말린/1.0% 염화칼륨으로 고정한 다음 1.0% 아세트산/50% 에탄올 용액을 첨가하여 뉴트랄 레드를 추출하였다. 추출된 뉴트랄 레드를 흡수분광광도계(UVmax, Molecular Device, USA)를 이용하여 540-630㎚의 농도별 세포독성값을 측정하여 하기 표 3에 나타내었다 세포 독성은 흡광도의 백분율로 나타냈으며 3로트(lot)로 3회 실시하였다.

NR assay	O.D. Mean ± S.D. (% of 대조군)
검액농도(W/W%)	대조군	1	0.5	0.1	0.05	0.01
제조예1	0.306± 0.009 (100.0)	0.284± 0.017 (92.80)	0.302± 0.013 (98.69)	0.306± 0.016 (100.16)	0.317± 0.014 (103.60)	0.320± 0.026 (104.75)
비교제조예1	0.308± 0.016 (100.0)	0.285± 0.023 (92.37)	0.303± 0.011 (98.38)	0.308± 0.017 (99.84)	0.313± 0.020 (101.62)	0.319± 0.018 (103.57)

표 2 및 표 3에서 보는 바와 같이, 본 발명인 제조예1의 MTT₅₀, NR₅₀값은 1% 이상이며, 비교제조예1과 비교하여 안전한 원료임을 알 수 있다.

시험예2: SDS(Sodium dodecyl sulfate) 세포독성에 대한 세포보호효과 측정

상기 제조예1과 비교제조예1에 대한 SDS (Sodium dodecyl sulfate) 세포독성에 대한 세포 보호 효과 실험을 실시하였다.

사람섬유아세포를 10% 우태아혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가한 IMDM으로 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양된 사람섬유아세포를 96-멀티웰 플레이트에 각각 1×10⁴세포/웰로 분주하고 24시간 배양하였다. 배양된 세포의 배지를 2% FBS 배지로 교체하고 SDS(Sodium dodecyl sulfate) 0.002%를 1시간 전처리하였다. 그 후, 제조예1과 비교제조예1을 각각 처리 농도 별로 배지에 희석하여 병행 처리한 후 24시간 동안 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 배양이 끝난 세포에, PBS(phosphate buffered saline)에 용해한 MTT 저장(stock) 용액(5 mg/㎖)을 새로운 배지에서 10배 희석하고, 이 용액을 세포 각각의 웰에 100㎕씩 첨가하여 37℃에서 4시간 반응시켰다. 반응 후 살아있는 세포는 미토콘드리아에 존재하는 탈수소 효소에 의해 노란색의 수용성 기질인 MTT[3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium-bromide]가 비수용성의 MTT-포마즌 결정으로 환원되므로 이것의 양을 재면 세포 생존율을 측정할 수 있다. 배양 상등액을 제거하고 각각의 웰에 DMSO 200㎕를 첨가하여 세포에서 생성된 MTT-포마즌 결정체를 용해시킨 후 흡수분광광도계(UVmax, Molecular Device, USA)로 포마즌의 흡광도가 최대가 되는 시험필터(Test filter)인 540㎚의 파장에서의 O.D값과 참조필터(Reference filter)인 630nm 파장의 O.D값을 측정하여 그 차이값의 흡광도를 구하였다 (참고문헌 The EMBO Journal(2002)21, 2407-2417외 다수). 세포 보호 효과는 흡광도의 백분율로 나타내었다.

MTT assay	O.D. Mean ± S.D. (% of 대조군)
검액농도 (W/W%)	대조군	SDS Only	SDS + 0.01	SDS + 0.05	SDS + 0.1	SDS + 0.5
제조예1	0.427± 0.016 (100.0)	0.224± 0.019 (52.49)	0.231± 0.014 (54.05)	0.260± 0.016 (60.75)	0.291± 0.024 (68.01)	0.314± 0.013 (73.39)
비교제조예1	0.428± 0.011 (100.0)	0.223± 0.013 (52.18)	0.228± 0.019 (53.19)	0.243± 0.012 (56.78)	0.276± 0.009 (64.41)	0.287± 0.017 (67.13)

상기 표 4에서 보는 바와 같이, 본 발명인 제조예1의 세포 보호 효과는, 비교제조예1보다 외부자극에 대하여 세포 보호 효과를 촉진시킴을 알 수 있다.

시험예3: 조직배양한 금선련 추출물의 항산화 효과 측정

제조예1 과 비교제조예1 에 대한 항산화 효과 시험을 실시하였다.

활성 산소에 의한 반응은 거의 대부분 라디칼 반응으로서 자동산화반응 과정이 포함된다. 생체 내에서 자동산화반응을 차단시키는 역할은 항산화제가 담당하고 있다. 전자를 주는 능력으로서 환원력이 클수록 강한 항산화제가 된다. 항산화제의 환원력을 측정하는 시약으로 1,1-디페닐-2-피크릴하이드로질(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl: DPPH) 라디칼이 있다. DPPH는 화합물 내 질소 중심의 안정화된 구조의 라디칼로 존재한다. 517㎚에서 최대 흡수를 나타내며 환원되면 517㎚에서 흡수가 없어진다. DPPH(D9132, SIGMA)를 메탄올과 증류수의 6:4(v/v) 혼합용매에 녹이고, 상기 DPPH 용액을 513㎚에서 흡광도가 0.6 정도 되도록 맞추었다. DPPH 용액 2㎖를 농도에 따라 희석한 시료 1㎖에 각각 첨가하여 혼합하였다. 상온에서 약 1시간 동안 방치한 후, 흡수분광광도계(UVmax, Molecular Device, USA)를 사용하여 513㎚에서 흡광도를 측정하였으며 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

DPPH assay	O.D. Mean ± S.D. (% of 대조군)
검액농도 (W/W%)	대조군	1	0.5	0.25	0.1	0.05
제조예1	0.861± 0.021 (0.0)	0.197± 0.013 (77.12)	0.363± 0.018 (57.84)	0.542± 0.014 (37.05)	0.642± 0.023 (25.44)	0.783± 0.028 (9.06)
비교제조예1	0.861± 0.021 (0.0)	0.285± 0.011 (66.90)	0.448± 0.011 (47.97)	0.692± 0.012 (19.63)	0.769± 0.018 (10.69)	0.810± 0.025 (5.92)

상기 표 5 에 나타난 바와 같이, 제조예1은 우수한 항산화 효과를 나타내었다.

시험예4: 조직배양한 금선련 추출물의 타이로시나제 활성 및 멜라닌 합성 억제 효과 측정

시험예4-1. 타이로시나제 활성 저해 시험

제조예1 및 비교제조예1의 미백활성을 조사하기 위해 타이로시나제 활성 저해 시험을 실시하였다. 실험을 위해, 타이로시나제 효소액은 버섯 타이로시나제 (mushroom tyrosinase, T-3824, 1530U/㎎, Sigma)를 1000U/㎖이 되도록 인산염 완충액(pH 6.5)으로 녹여 준비하였다. 기질액은 L-타이로신(L-tyrosine, 45160-0410,Junsei chemical co. Ltd)을1.5mM이 되도록 인산염 완충액(pH 6.5)으로 녹여 준비하였다.

제조예1 및 비교제조예1을 완충액에 농도별로 희석하여 검액을 준비하였다. 검액 170㎕, 타이로시나제 효소액 10㎕를 넣고 37℃에서 10분간 방치하였다. 여기에 기질액 20㎕를 넣은 다음 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 바로 얼음 중에 5분간 방치한 후, 흡수분광광도계(UVmax, Molecular Device, USA)를 이용하여 파장 490㎚에서 흡광도를 측정하였다. 상기에서 측정된 흡광도를 하기 수학식 1에 대입하여 타이로시나제 활성저해율을 계산하여 하기 표 6에 나타내었다. 검액 대신 인산염 완충액(pH 6.5)을 넣어 조작한 액을 공시험액으로, 기질액 대신 인산염 완충액(pH 6.5)을 넣어 조작한 액을 보정액으로 하였다.

<수학식 1>

타이로시나제 활성저해율 (%) = 100 - (A-A')/(B-B') X 100

A: 검액 반응 후의 흡광도

B: 공시험액의 반응 후의 흡광도

A': 검액의 보정액

B': 공시험액의 보정액

타이로시나제 활성 저해 측정	O.D. Mean ± S.D. (% of 대조군)
검액농도 (W/W%)	대조군	5	2.5	1	0.5
제조예1	0.244± 0.011 (0.00)	0.089± 0.007 (63.52)	0.112± 0.009 (54.10)	0.159± 0.013 (34.83)	0.177± 0.012 (27.46)
비교제조예1	0.244± 0.011 (0.00)	0.094± 0.006 (61.47)	0.136± 0.012 (44.26)	0.188± 0.016 (22.95)	0.196± 0.014 (19.67)

시험예4-2: 조직배양한 금선련 추출물의 농도에 따른 멜라닌 합성 억제 측정 실험

제조예1 및 비교제조예1에 대하여 B-16 멜라노마 세포(Melanoma cell: 연세대학교 원주 의과대학 분양)를 이용하여 미백효과를 측정하였다. 측정방법으로는 블랙 마우스로에서 유래된 B-16 멜라노마 세포를 10% FBS(GIBCO. USA)가 함유된 DMEM으로 6 웰 조직 배양 접시에 2 x 10⁴ 세포/웰 농도로 2㎖씩 첨가하고 5% CO₂, 37℃조건하에서 24시간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 10% FBS, 2uM α-MSH(Sigma., USA, Melanocyte stimulating Hormone)과 2mM 테오필린(Sigma., USA, theophylline)이 함유된 DMEM으로 교체한 후, 조직배양한 산삼 부정근 추출물을 동일배지로 적당량 희석한 후 각각 첨가하고 나서, 5% CO₂ ,37℃ 조건하에서 세포가 웰의 바닥에 약 80% 이상 될 때까지 배양하였다. 배양 후 배지를 제거한 다음 PBS(Sigma.., USA, Phosphate buffered Saline)로 세척하고 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 5000rpm으로 10분간 원심분리한 후 상등액을 제거하였다. 상등액이 제거된 세포를 60℃ 항온기에서 24시간 건조시킨 후 1N NaOH를 첨가하여 세포내의 멜라닌을 용해시켰다. 용해된 멜라닌을 흡수분광광도계(Uvmax, Molecular Device, USA)를 이용하여 파장 490㎚에서 흡광도를 측정하였다.

<수학식 2>

타이로시나제 활성저해율 (%) = 100 - (A-A')/(B-B') X 100

A: 검액 반응 후의 흡광도

B: 공시험액의 반응 후의 흡광도

A': 검액의 보정액

B': 공시험액의 보정액

멜라닌 합성 억제 측정	O.D. Mean ± S.D. (% of 대조군)
검액농도 (W/W%)	대조군	0.25	0.1	0.05	0.01
제조예1	0.274± 0.013 (0.0)	0.117± 0.007 (57.30)	0.143± 0.013 (47.81)	0.194± 0.008 (29.20)	0.223± 0.015 (18.61)
비교제조예1	0.274± 0.013 (0.0)	0.140± 0.009 (48.91)	0.203± 0.014 (25.91)	0.223± 0.013 (18.61)	0.239± 0.016 (12.77)

표 6 및 표 7에 나타난 바와 같이, 제조예1은 타이로시나제 활성을 농도 의존적으로 억제하였으며, 세포내 멜라닌 생성억제 효과가 우수하였다.

시험예5: 조직배양한 금선련 추출물의 콜라겐 생합성 측정

피부 주름의 발생 원인 중 하나로 피부교원질 즉 콜라겐의 결핍을 들고 있다. 콜라겐은 피부 진피를 구성하는 주요 단백질로서 피부 구조와 탄력을 유지하는 역할을 하고 있다. 콜라겐은 나이가 들면서 생성의 감소를 보이며 분해도 증가되어 피부 진피층의 함몰을 유도하여 피부의 주름을 생성하는 것으로 알려져 있다.

<콜라겐 생합성량 측정>

본 발명에 따른 화장료 조성물의 주름개선 효과를 조사하기 위해 섬유아세포를 이용한 콜라겐 생합성 촉진 시험(Sircol^TM Soluble Collagen Assay Kit)을 실시하였다.

배양한 사람섬유아세포를 12웰 세포 배양접시에 1ⅹ10⁵ 세포/웰이 되도록 5% FBS를 포함하는 배지에 분주하여 24시간 배양하고, 2% FBS를 포함하는 배지에 조직 배양한 제조예1 및 비교제조예1을 각각 처리 농도별로 희석하여 세포에 처리하고 48시간 배양하여 하기 실험에 사용하였다. 상기 섬유아세포(fibroblast)에서 실제적으로 콜라겐의 합성이 증가되었음을 확인하기 위하여 Biocolor 사의 Sircol^TM 용해 콜라겐 분석 키트(Soluble Collagen Assay kit)를 구입하여 제품 메뉴얼의 실험 방법에 따라 콜라겐 양을 측정하였다. Sircol^TM 용해 콜라겐 분석 키트는 세포를 배양 하는 동안 배양 배지로 분비된 콜라겐과 염색시약의 결합에 의한 방법으로 확인 할 수 있는 정량방법이다. 상세하게는, 배양 상등액 100㎕에 염색 시약(dye reagent, 피크릭산에 Sirius red reagent이 포함된 용액) 1㎖을 첨가하고 30분간 반응시켰다(콜라겐 생성량에 따라 시험 시 배양액을 농축하거나 배양 상등액을 200㎕까지 염색 시약 1㎖와 반응시킬 수 있다.) 씨리어스 레드(Sirius red)는 음이온계 색소로서 콜라겐에 특이적으로 결합한다. 30분간 반응시킨 후 반응액을 12,000× g 이상에서 10분간 원심분리하여 콜라겐-색소 결합체를 침전시켰다. 침전물에 알칼리 시약 1.0㎖을 첨가하여 실온에서 5분 동안 용해시켰다. 상기 용액의 흡광도를 흡수분광광도계(UVmax, Molecular Device, USA)를 이용하여 540㎚에서 측정하여 하기 표 8에 나타내었으며, 이를 비시험군의 흡광도 비교하여 콜라겐 생합성 촉진 효과를 평가하였다.

콜라겐 생합성 측정	O.D. Mean ± S.D. (% of 대조군)
검액농도 (W/W%)	대조군	0.01	0.05	0.1	0.5
제조예1	0.483± 0.021 (100)	0.492± 0.022 (101.77)	0.518± 0.019 (107.15)	0.529± 0.026 (109.43)	0.541± 0.031 (112.02)
비교제조예1	0.483± 0.021 (100)	0.483± 0.018 (99.98)	0.487± 0.029 (100.74)	0.493± 0.027 (101.98)	0.501± 0.028 (103.63)

상기 표 8에 나타난 바와 같이, 제조예1은 비교제조예1과 비교하여 콜라겐 생합성 효과가 우수함을 확인하였다.

실시예1: 조직배양한 금선련 추출물을 함유하는 에센스의 제조

제조예1을 포함하는 에센스를 하기 표 9의 조성에 따라 제조하였다.

	성분명	함량(중량%)
A	1,3-부틸렌글리콜	1.0
	글리세린	1.0
	카보머	0.2
	글리세릴 메타크릴레이트	0.35
	방부제	0.50
	정제수	잔량
B	수산화칼륨	0.06
C	PEG-6-하이드로 제네이티드 캐스터 오일	1.0
C	향료	0.5
D	제조예1	5.0
	계	100.00

A를 충분히 분산, 습윤하여 균일한 겔(Gel)상이 되도록 하고, B를 첨가하여 중화하였다. (A+B)에 C를 첨가하여 균일교반하여 가용화시킨 후, D를 실온에서 첨가하여 균일하게 분포되도록 교반하고, 용기에 담아 제품화하였다.

실시예2 내지 4: 조직배양한 금선련 추출물을 포함하는 유연화장수(스킨)의 제조

제조예1을 포함하는 화장료 조성물 중 유연화장수(스킨)의 실시예는 하기 표 10과 같다.

성분	실시예2	실시예3	실시예4
성분	함량(중량%)	함량(중량%)	함량(중량%)
제조예1	10.00	5.00	2.00
부틸렌글아이콜	2.00	2.00	2.00
글리세린	3.00	3.00	3.00
올레일알코올	2.00	2.00	2.00
폴리솔베이트 20	1.00	1.00	1.00
에탄올	6.00	6.00	6.00
방부제	0.5	0.5	0.5
향	0.5	0.5	0.5
정제수	잔량	잔량	잔량
계	100.00	100.00	100.00

실시예5 내지 7: 조직배양한 금선련 추출물을 포함하는 영양유액(밀크로션)의 제조

제조예1을 함유하는 화장료 조성물 중 영양유액(밀크로션)의 실시예는 하기 표 11과 같다.

성분	실시예5	실시예6	실시예7
성분	함량(중량%)	함량(중량%)	함량(중량%)
제조예1	10.00	5.00	2.00
부틸렌글아이콜	4.00	4.00	4.00
글리세린	3.00	3.00	3.00
올레일알코올	1.00	1.00	1.00
폴리솔베이트20	1.00	1.00	1.00
방부제	0.5	0.5	0.5
향	0.5	0.5	0.5
정제수	잔량	잔량	잔량
계	100.00	100.00	100.00

실시예 8 내지 10: 조직배양한 금선련 추출물을 포함하는 크림의 제조

제조예1을 함유하는 화장료 조성물 중 크림의 실시예는 하기 표 12와 같다.

성분	실시예8	실시예9	실시예10
성분	함량(중량%)	함량(중량%)	함량(중량%)
제조예1	10.00	5.00	2.00
부틸렌글아이콜	2.00	2.00	2.00
글리세린	4.00	4.00	4.00
포타슘하이드록사이드	0.10	0.10	0.10
토코페릴 아세테이트	1.0	1.0	1.0
유동파라핀	5.0	5.0	5.0
스쿠알란	5.0	5.0	5.0
마카디미아넛트오일	10.0	10.0	10.0
폴리솔베이트 60	1.0	1.0	1.0
소르비탄세스퀴올레이트	1.0	1.0	1.0
카보머	0.3	0.3	0.3
방부제	0.5	0.5	0.5
향	0.5	0.5	0.5
정제수	잔량	잔량	잔량
계	100.00	100.00	100.00

Claims

조직배양한 금선련(tissue cultured Anoectochilus formosanus) 추출물을 포함하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여, 상기 조직배양한 금선련 추출물을 0.1 내지 10.0 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서,

상기 조직배양한 금선련 추출물이 정제수, C1 내지 C4의 알코올 및 C1 내지 C5의 알킬렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매를 사용하여 추출되는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항산화, 세포보호, 미백 및 피부 주름 개선의 목적으로 사용되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 핸드크림, 파운데이션, 메이크업베이스, 트윈케익, 마스카라, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클린저, 수중유(O/W)형의 파우 더, 유중수(W/O)형의 파우더 및 실리콘중수(W/Si)형의 파우더 중에서 선택되는 형태로 제형화되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
a)조직배양한 금선련을 정제수, C1 내지 C4의 알코올 및 C1 내지 C5의 알킬렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 추출용매에 3 내지 30일 동안 침적하여 침적용액을 형성하는 단계; 및

b)상기 침적용액을 여과하여 조직배양한 금선련 추출물을 얻는 단계를 포함하는 조직배양한 금선련 추출물의 제조방법.
청구항 6에 있어서, 상기 추출용매가 에탄올; 에탄올 및 1,3-부틸렌글리콜; 에탄올 및 프로필렌글리콜; 및 에탄올 및 펜틸렌글리콜으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조직배양한 금선련 추출물의 제조방법.
청구항 6에 있어서, 상기 b)단계는 상기 추출용매를 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조직배양한 금선련 추출물의 제조방법.