CN115802905A - 阿拉伯辣木种子饼的蛋白质水解产物用于其用作药物的应用、获得其的方法及药物和皮肤病学组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种获得阿拉伯辣木种子饼特定蛋白质水解产物的方法。本发明还涉及阿拉伯辣木种子饼的蛋白质水解产物及其用作药物的用途。最后，本发明涉及一种药物组合物或皮肤病学组合物，包括作为活性剂的有效量的阿拉伯辣木种子饼的蛋白质水解产物，用于其用作治疗纤维化疾病和治疗炎症、治疗癌症、治疗细菌或病毒类型的感染性疾病和治疗遗传漂变以及与皮肤色素沉着相关的病理的药物的用途。

Description

阿拉伯辣木种子饼的蛋白质水解产物用于其用作药物的应 用、获得其的方法及药物和皮肤病学组合物

技术领域

本发明涉及药学和皮肤病学领域，并且更具体地涉及药物制剂中的活性成分领域。本发明涉及一种从阿拉伯辣木(Moringa peregrina)种子饼中获得蛋白质水解产物的方法。本发明还涉及来自阿拉伯辣木种子饼的蛋白质水解产物，涉及包含这种类型的水解产物的药物组合物和皮肤病学组合物，以及旨在用于治疗纤维化疾病，治疗炎症、癌症、感染性细菌或病毒类型的疾病，以及用于治疗遗传漂变和与皮肤色素沉着相关的病理。

背景技术

辣木科(Moringaceae)构成单属科(单一属，辣木属)，是saharo-sindian植物群的一部分，根据作者，它由在十二和十四个之间的物种组成，分布跨越非洲东部和亚洲。该属按惯例分为3个部分，然而，通过系统发育分析这三个部分并未被确认是单系的。后者相当突出了朝向某些形态特征的分支：pachycaul(瓶子树(bottle tree))、块茎灌木(tuberousshrub)和既不是pachycaul也不是块茎灌木的树(细长的树(slender tree))。物种阿拉伯辣木(Moringa peregrina(Forssk.)Fiori)属于第三群组。对该属或该科的极少遗传学研究证实了该物种相较于该属的其他物种，尤其是相较于印度辣木属(Indian Moringa)、辣木(Moringa oleifera Lam.)的现实存在。(尤其参见文章：OLSON,M.E.,2002,CombiningData from DNA Sequences and Morphology for a Phylogeny of Moringaceae(Brassicales),Systematic Botany 27(1):p.55-73；Hassanein,A.M.A.et al.,2018,Morphological and genetic diversity of Moringa oleifera and Moringa peregrinagenotypes,Horticulture,Environment and Biotechnology 59(2):p.251-261)。最近关于在沙特阿拉伯不同地点取样并且使用ITS标记物的阿拉伯辣木的文章得出结论，该物种是稳定的(A_LAKLABI,A.,2015,Genetic diversity of Moringa peregrina species inSaudi Arabia with ITS sequences,Saudi Journal of Biological Sciences 22:p.186-190)，然而具有高水平的种群内遗传变异。

在也门、阿曼、沙特阿拉伯、非洲东部、苏丹、埃塞俄比亚、厄立特里亚、索马里和吉布提的岩石环境中发现了物种阿拉伯辣木。它在伊朗的存在似乎仅限于东南部省份，但尚需要得到证实(PROTA14＝M_UNYANZIZA,E.et al.Vegetable oils/oilseed plants,Moringaperegrina(Forssk.)Fiori,http://database.prota.org/protahtml/moringaperegrina_fr.htm,accessed on 23/10/2019)。在黎凡特和埃及，发现的物种只是罕见的分散孑遗植物(relict plant)(少数高海拔种群除外)，主要在苏丹地区的区域。现今，阿拉伯辣木在苏丹和也门也被视为是稀有并且濒危的。相对于其分支的其他物种，阿拉伯辣木占据着最干燥并且条件恶劣的生境。它显然比在热带和亚热带地区的大规模商业种植的辣木更耐干旱。最近的工作表明，种子的大小和重量将对发芽时间以及幼苗个体的生长速度和速率产生有利影响(G_OMAA,N.H.et al.,2011,Seed germination,seedling traits,andseed bank of the tree Moringa peregrina(Moringaceae)in a hyper-aridenvironment,American Journal of Botany 98(6):p.1024-1030)，表明朝着种子的质量而不是种子的数量的资源分配的调整，这使得阿拉伯辣木能够在极端非生物环境(超干旱环境)中有效繁殖。就细胞层而言，阿拉伯辣木种子具有的中央中种皮(mesotesta)比辣木的那些更厚。

历史，有一些提到倾向于表明，在伊斯兰教早期在欧拉(Al-Ula)地区活跃交易阿拉伯辣木油(N_ASEEF,A.A.S.,1995,Al-‘Ulā,A study of Cultural and Social Heritage)。从阿拉伯辣木生产的油如今主要旨在用于国内消费或用于当地市场。在沙特阿拉伯，叶子传统上被用作内服汤剂，以治疗糖尿病、结肠疾病、眼疾病和贫血(A_BDEL-K_ADER et al.,Asurvey on the traditional plants used in Al Kobah village,SaudiPharmaceutical Journal 26(6):p.817-821)并且作为利尿剂、发红剂和收敛剂(A_QEEL,A.A.M.et al.,1984,Plants used in Arabian Folk medicine,Report submitted toSaudi Arabian National Centre for Science and Technology,Riyadh,SaudiArabia)。在阿曼，将女性在夏末提取的油用于对抗偏头痛、发烧、烧伤、撕裂伤和骨折、便秘和胃痛，以及对抗肌肉疼痛和头皮干燥(G_HAZANFAR,S.A.,1994,Handbook of ArabianMedicinal Plants,1^st edition,CRC Press,Boca Raton,Ann Harbor,USA；G_HAZANFAR,S.A.,1998,Plants of Economic Importance,chapter 15,in Ghazanfar,S.A.et al.(ed.)Vegetation of the Arabian Peninsula.Geobotany 25,p.241-264,Kluwer AcademicPublishers,table 11.1,p.247and 11.7p.251)。它还被用于芳香组合物(G_HAZANFAR,S.A.,1998,p.259)以及在阿曼和也门被用作面部洗剂(G_HAZANFAR,S.A.et al.,1996,Two multi-purpose seed oils from Oman.Plants for Food and Medicine。论文展现于1996年7月1日-7日在伦敦的经济植物学学会和传统药理学国际学会的联席会议(the joint meetingof the Society for Economic Botany and International Society forEthnopharmacology)上)。

已知一定数量的辣木种子提取物更特别地用于化妆品领域。在皮肤病学领域，从文件FR2776519中得知，来自辣木种子的蛋白质提取物以其对浑浊水的澄清作用而闻名，对皮肤和粘膜具有润肤、生理调节、保湿、重组、修复和抗污染的作用。在所述文件中，活性成分是具有包括在6500和8800Da之间的分子量的蛋白质，它们是通过从辣木饼的水性提取获得的。

在制药领域，已知一种来自KR20140143655的组合物含有来自辣木叶的水溶性提取物作为活性成分，以治疗或预防癌症。对辣木叶提取物的酶法水解可以用于分离具有分子量包括在6000至8000Da之间的蛋白质。

文件CN 107012190涉及使用辣木种子以在使用微波辐射进行酶法水解后提取油之后从种子蛋白质中获得多肽。获得的产品用于口服并且具有抗癌活性。事实上，这种粉末状的产品被描述为具有减少化疗副作用以及增加肝癌患者食欲或控制白细胞指数和体温的作用。

最后，从文件IN2009CH02906，包含硫代葡萄糖苷与阳离子蛋白组合的辣木饼的水提物可用作抗糖尿病的产品。

所有上述的引用文件都涉及物种辣木的用途；它们中都没有描述来自物种阿拉伯辣木的提取物在药物或皮肤病学领域中的用途。

此外，A_BU T_ARBOUSH等人的文件XP055753092，2005是已知的，其描述了经过10小时的时间段通过酶法水解产生的从去壳阿拉伯辣木种子中提取水解产物。该提取的目的是获得具有高吸油和吸水能力的产品。

使用(1/1)二氯甲烷/甲醇混合物从埃及种子生产的阿拉伯辣木油的提取物在三种人癌细胞系MCF-7(乳腺癌)、Hep-G2(肝细胞癌)和HCT-116(结肠癌)上表现出活性，IC₅₀值为2.92、9.40和9.48μg/mn(A_BD el B_AKY et al.,2013,Characterization of EgyptianMoringa peregrina seed oil and its bioactivities,International Journal ofManagement Sciences and Business Research,2(7):p.98-108)。作者还通过DPPH(2,2-二苯基1-苦基肼(DPPH(2,2-diphenyl 1-picrylhydrazyl)))、ABTS(阴离子清除能力和还原能力)和抗增殖测定证明了高抗氧化活性。由于获得提取物的方法与本发明的方法不同，因此获得的分子具有非常不同的极性。

A_BOU-H_ASHEM等人(A_BOU-H_ASHEM,M.M.M.et al.,2019,Induction of sub-G0 arrestand apoptosis by seed extract of Moringa peregrina(Forssk.)Fiori in cervicaland prostate cancer cell lines,Journal of Integrative Medicine17:p.410-422)也证明了宫颈(HELA)和前列腺(PC-3)癌细胞系上亚G₀期阻滞和凋亡的诱导活性。该方案涉及埃及阿拉伯辣木种子缩小成粉末并用95％乙醇提取，然后溶解在水溶液中，从中研究三种分级的提取物(使用石油醚(PE)、CHCl3和EtOAc的部分)以及水醇提取残留物。该活性在总氯仿级分得到证实，并且归因于饱和和不饱和脂肪酸以及多酚，而没有对机制的具体研究。由于获得提取物的方法与本发明的方法不同，因此获得的分子具有非常不同的极性。

鉴于上述情况，本发明提出要克服的问题是开发基于辣木属和辣木科的物种阿拉伯辣木的提取物的新产品，该产品可用于药学或皮肤病学并且易于使用。

因此，申请人出人意料地开发了一种从阿拉伯辣木种子饼中获得的特定蛋白质水解产物，用于其作为药物的用途，并且特别是用于治疗纤维化疾病(作为弗林(furin)转化酶的抑制剂)，治疗炎症、癌症、细菌或病毒类型的感染性疾病以及治疗遗传漂变和与皮肤色素沉着相关的病理。

物种阿拉伯辣木生长在非常干旱的气候中。因此，它耐旱和在极端条件下繁殖的能力使其获得了独特的特征，申请人已经能够通过对阿拉伯辣木种子饼实施特定的提取方法来识别这些特征。根据本发明的蛋白质水解产物已显示具有作为药物的性质，并且已经证明特别是，它具有非常高的弗林转化酶的抑制活性。

弗林转化酶(以下简称弗林)是在不同细胞类型中表达的具有794个氨基酸的1型跨膜蛋白。弗林是一种蛋白质，已被显示参与大量生物过程(BRAUN E.et al.,2019,Furin-mediated protein processing in infectious diseases and cancer,Clinical&Translational Immunology https://doi.org/10.1002/cti2.1073)。它特别地参与伤口的愈合以及其中纤维化是主要组织修复机制或过度纤维化导致病理破坏和组织功能障碍的疾患的治疗(在这方面参见WO 2004/09113文件，其涉及使用转化酶以减少损伤治愈过程中的愈合和治疗纤维化状态中减少纤维化)中纤维化的调节。成人的伤口愈合是一个复杂的修复过程。伤口可能涉及组织或内脏诸如肺、肾脏、心脏、肠、肌腱或肝脏的伤害、损伤或创伤。在组织中的伤口愈合过程通常由皮肤血管损伤引发的止血反应的起始。在此过程中，在愈合过程中形成的结缔组织通常本质上是纤维状的，并且通常作为结缔组织疤痕形成(称为纤维化的过程)。因此，纤维化可以包括肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化、眼部纤维化、心脏纤维化和其它各种纤维化状态。本发明的蛋白质水解产物还可以用于治疗由弗林介导的其它病理状态，包括但不限于：高血压、癌症、感染性疾病(细菌的和病毒的)和遗传疾患(例如囊性纤维化(CF))和神经系统变性疾患(在这方面参见WO 2019/215341，其涉及新型弗林转化酶抑制剂或化合物以及含有它们的药物组合物，并且其引用了许多证明抑制剂药物活性的出版物；这些引用特此通过引用并入本说明书)。

通过法兰西共和国政府与沙特阿拉伯王国于2018年4月10日达成的政府间协议，申请人法国AlUla发展局(AFALULA)[French Agency for AlUla]和皇家AlUla委员会(RCU)[Royal Commission for AlUla]发起了一个联合项目，特别地为了发展负责任的农业和当地经济、特别地通过当地生产源自乡土植物的天然产品，以及保护沙特阿拉伯王国AlUla地区的生物多样性和法律。沙特阿拉伯王国自2020年10月8日起成为《名古屋议定书》(NagoyaProtocol)的成员。在起草本专利时，关于《名古屋议定书》将纳入当地法律相关方面的实施法规在考虑之中。因此，在此阶段，沙特阿拉伯王国对本专利申请和《名古屋议定书》没有特定要求。因此，在提交该专利申请之日，没有关于获得遗传资源的合规证书的要求。

发明内容

在第一方面，本发明提供从阿拉伯辣木种子饼获得蛋白质水解产物的方法，包括以下步骤，其中：

a)从成熟的阿拉伯辣木果实中收集未去壳的成熟种子并且进行干燥，以获得小于8％的内部含水率，

b)以使得将油与种子的剩余部分分离的方式，以使得获得包括按重量计小于6％的残油的饼的方式，压榨干燥的种子，

c)碾磨步骤b)中获得的所述饼，

d)将步骤c)中获得的碾磨饼分散在水相中，

e)在pH大于13和包括在16℃至25℃之间的温度下，对步骤d)中获得的水性分散体进行化学蛋白水解约2小时的时间，

f)中和所述蛋白水解以稳定获得的蛋白质水解产物，

g)通过固/液分离回收所述蛋白质水解产物，

h)通过超滤和或纳滤纯化所述蛋白质水解产物，以及然后任选地，

i)冻干步骤h)中获得的所述蛋白质水解产物。

在第二方面，本发明涉及来自种子饼的蛋白质水解产物，该种子饼已从成熟的阿拉伯辣木果实中收获并且未去壳，包括分子量包括在1500Da和5000Da之间的氨基酸衍生物、氨基酸、肽和糖肽的主要部分P1，分子量包括在10000和17000Da之间的大约20％的部分P2，分子量大约为23000Da大约20％的部分P3，其中，它是通过在pH大于13的条件下在包括在16℃和25℃之间的温度下化学蛋白水解约2小时的时间获得的，并且其中它是液体并且具有大于1，优选约1.1的密度。

由于其特性，根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物从未在辣木属和辣木科中公开。将证明的是，物种阿拉伯辣木的提取物具有特定的肽谱，其不同于从该属的其他物种，尤其是申请人已经能够展示的物种辣木。

在第三方面，本发明涉及来自阿拉伯辣木种子饼的蛋白质水解产物作为药物的用途。

在第四方面，本发明关于药物组合物或皮肤病组合物，其包括作为活性剂的有效量的阿拉伯辣木种子饼的蛋白质水解产物，以及生理学上可接受的赋形剂。

最后，在第五方面，本发明涉及用于治疗纤维化疾病、治疗炎症、癌症、细菌或病毒类型的感染性疾病以及治疗遗传漂变和与皮肤色素沉着相关的病理的药物组合物或皮肤病学组合物。

附图说明

本发明的其它目的、细节、特征和优点将从以下对本发明的几个特定实施方式的描述中变得更加明显，这些描述仅通过非限制性说明的方式给出并且参考附图。

[图1]表示SARS-COV2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2)冠状病毒感染的示意图，该图显示了根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物对SARS COV2冠状病毒假病毒粒子的抗感染和病毒抑制作用。

[图2]表示使用阿拉伯辣木油的提取物对弗林的抑制图。在此图中，**表示与“对照”组显著不同(P<0.001)。

[图3]表示使用阿拉伯辣木饼提取物(96°乙醇)对弗林的抑制图。在此图中，*表示与“对照”组显著不同(P<0.001)。

[图4]表示使用根据本发明来自阿拉伯辣木饼的蛋白质水解产物对弗林的抑制图。在此图中，***表示与“对照”组(P<0.001)显著不同。

具体实施方式

在此描述中，除非另有说明，否则应理解当给出范围时，它包括所述范围的上限和下限。

在本发明中，以下缩写指以下内容：

-MTT：3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT测试是用于计数活细胞的快速方法)

-SDS：十二烷基硫酸钠

-PBS：磷酸盐缓冲盐水

-ELISA:酶联免疫吸附测定

-PCR：聚合酶链反应

-ANOVA：方差分析

-MSH：促黑素细胞激素

在本发明中：

-“主要是氨基酸衍生物、氨基酸、肽和糖肽”是指量超过20％、更优选超过30％和可能高达约40％(重量/重量)干物质的氨基酸衍生物、氨基酸、肽和糖肽，更优选按重量计50％的干物质。

-“有效量”是指获得所需结果，即保证所需的治疗活性所必需的活性分子的数量。

-“蛋白水解”是指通过化学水解将蛋白质分割成肽、寡肽及其碱基片段(氨基酸)以及其残基。

-“局部给药”是指直接施加于其作用点的药物对疾患的确切部位发挥其药理作用。局部给药的目的是限制有效成分从其给药点的扩散，使得将不良影响降至最低。皮肤、鼻腔和呼吸给药、眼部给药、耳部给药、阴道给药和口腔给药是采用的主要局部给药方式。

-“局部施用”指将根据本发明的活性成分或包含其的组合物施用或铺展到皮肤、粘膜、指甲或头发的表面上。

-在局部使用的背景下的“生理学上可接受的”是指与人体皮肤接触，或者在其它给药方式的背景下，例如口服给药或通过注射到皮肤中，是指零风险的毒性、不相容性、不稳定性或过敏反应。

-“饼”是指压榨后的脱脂种子。它是从种子中提取油之后留下的固体残余物。它是研磨(油生产过程)的副产品。它通常占种子质量的50％至75％。

-“未去壳种子”指收获的种子的壳(果皮)和皮维持在核周围。

-“当果实成熟时”是指果实成熟，优选当壳体准备裂开并且呈深米色至棕色时，以及当壳体的下部四分之一扭曲180°时，触发瓣(valve)打开。

-“大约”指针对给定信息的加或减10％至20％的幅度。

-“活性分子库”、“活性剂”和也为“活性成分”指根据本发明的方法从阿拉伯辣木种子饼开始提取的蛋白质水解产物。该水解产物负责本发明中描述的生物活性。

-“活性剂”指足够量的根据本发明的提取物以获得所述的生物活性。取决于提取物是液体或干燥的、以及是浓缩或其他的，活性剂的量可以以相对于组合物的总重量按重量计在0.0001％至40％内的比例变化。

在第一方面，本发明涉及从阿拉伯辣木种子饼获得蛋白质水解产物的方法，包括以下步骤，其中：

a)从成熟的阿拉伯辣木果实中收集未去壳的成熟种子并且进行干燥，以获得小于8％的内部含水率，

b)以使得将油与所述种子的剩余部分分离的方式，以使得获得包括按重量计小于6％的残油的饼的方式，压榨干燥的种子，

c)碾磨步骤b)中获得的所述饼，

d)将步骤c)中获得的碾磨饼分散在水相中，

e)在pH大于13和包括在16℃至25℃之间的温度下，对步骤d)中获得的水性分散体进行化学蛋白水解约2小时的时间，

f)中和所述蛋白水解以稳定获得的蛋白质水解产物，

g)通过固/液分离回收所述蛋白质水解产物，

h)通过截留阈值包括在100至25000Da之间进行的超滤和/或纳滤来纯化所述蛋白质水解产物，然后任选地，

i)冻干步骤h)中获得的所述蛋白质水解产物。

收集未去壳的种子，即在果实成熟时保留壳，并且优选在壳体开始分裂时保留壳。

将种子干燥以获得小于8％且优选约6％的内部含水率；干燥优选在避光的通风架上进行，优选在露天阴凉处进行。

接下来，用冷压即时研磨干燥的种子，这可用于将油与压榨种子的其余部分(即饼)机械分离。

然后用任何类型的机械磨机诸如锤磨机、连枷磨机、刀磨机、压碎/切碎磨机、球磨机或冲击式碾磨机(beater mill)，而且还用任何类型的冷冻磨机(cryomill)对饼进行机械碾磨。

根据步骤d)形成水相的分散和根据步骤e)的蛋白水解在连续搅拌下有利地进行，从而使固体在液体中分散和均质化，因此改善了交换的总表面积，并且因此改善了蛋白水解。

获得具有的密度大于1并且优选为约1.1的液体蛋白质水解产物，其包括在10％和15％之间、优选约12.5％的干物质内容物，所述干物质内容物包括在1％和6％之间的含氮化合物，尤其是比例为0.5％至1.5％、优选约0.8％的挥发性腈衍生物，以及20mg/升的多酚(0.002％)。

根据本发明的方法的优选实施方式，步骤f)的蛋白水解温度大约为22℃。

根据本发明的方法的优选实施方式，步骤g)的固/液分离通过各种方法诸如离心、脱水或过滤进行。

在获得液体阿拉伯辣木蛋白质水解产物的方法的一种实施方式中，蛋白质水解产物通过蒸馏、微滤、超滤和/或纳滤纯化，以便将其浓缩成为目的化合物，该化合物在也被提取的有机物质之上，特别是在也被提取的其它衍生物之上。这些纯化步骤可用于将目的化合物库浓缩在已引用的其他提取的化合物之上。

依据根据本发明的方法的另一种优选实施方式，纳滤以使得分离蛋白质水解产物的3条带或部分的方式进行，包括分子量小于10000Da的带P1，分子量在包括在10000和17000Da之间的带P2和分子量大约为23000Da的带P3。

通过纳滤分离三条带也是有利的，以便通过用于获得蛋白质水解产物的方法获得：

-带P1，用包括在1500Da和5000Da之间的截留阈值，优选用包括在3000Da和4500Da之间的截留阈值进行纳滤。

-带P2，用包括在10000Da和17000Da之间的截留阈值进行纳滤。

-带P3，用包括在17000Da和25000Da之间的截留阈值进行纳滤。

在根据本发明的提取方法的另一种实施方式中，将所获得的液体蛋白质水解产物以使得获得阿拉伯辣木种子饼的干水解产物的方式进行干燥，该干水解产物包含超过10％、优选超过20％、更优选超过30％的量和可能高达约40％(重量/重量)干物质的寡肽、糖肽和氨基酸或其挥发性腈衍生物，更优选按重量计50％的干物质。

根据本发明的一种实施方式，从阿拉伯辣木种子饼获得的液体蛋白质水解产物例如以获得将水分蒸发掉的阿拉伯辣木种子的固体水解产物的方式通过雾化、冻干或沸腾的方式干燥。干燥可以在有机载体诸如麦芽糊精、环糊精或菊糖存在下，或在无机载体诸如层状硅酸盐、硅酸镁或碳酸盐及其盐存在下进行。

本发明还涉及通过根据本发明的提取方法获得的来自阿拉伯辣木种子饼的蛋白质水解产物。

在第二方面，本发明涉及来自种子饼的蛋白质水解产物，该种子饼未去壳并且已从成熟的阿拉伯辣木果实中收获，该蛋白质水解产物包括分子量包括在1500Da和5000Da之间的氨基酸衍生物、氨基酸、肽和糖肽的主要部分P1，分子量包括在10000和17000Da之间的大约20％的部分P2，以及分子量大约为23000Da的大约20％的部分P3，其中，它是通过在pH大于13的条件下在包括在16℃和25℃之间的温度下化学蛋白水解约2小时的时间获得的，并且其中它是液体并且具有大于1，优选约1.1的密度。

根据一种实施方式，将获得的液体蛋白质水解产物以使得从阿拉伯辣木种子饼获得干水解产物的方式干燥，该干水解产物含有超过20％、更优选超过30％的量并且可能高达约40％(重量/重量)干物质的肽、寡肽、糖肽和氨基酸或其挥发性腈衍生物的，更优选按重量计50％的干物质。

根据另一种实施方式，蛋白质水解产物还包括在0.3％和3％之间的挥发性化合物，其中50％的这些化合物，即0.15％和1.5％之间的根据本发明的提取物，由轻腈化合物构成，主要是异丁腈和甲基丁腈；其中5％至10％的这些化合物，即0.015％和0.3％之间的根据本发明的提取物，由异硫氰酸酯衍生物构成，主要是异硫氰酸异丙酯和异硫氰酸异丁酯；其中1％至5％的这些化合物，即在0.003％和0.15％之间，由精油构成，主要是桉树脑、薄荷醇和苯甲醛。

根据另一种实施方式，蛋白质水解产物包括在10％和15％之间、优选约12.5％的干物质内容物，包括在1％和6％之间的含氮化合物，尤其是比例为0.5％至1.5％、优选约0.8％的挥发性腈衍生物，以及20mg/升的多酚。

在本发明的上下文中，选择的植物部分是阿拉伯辣木种子。已知的是，阿拉伯辣木种子用于提取其油，该油用于国内消费或各种传统医学治疗。种子脱油后获得的饼是废物产品，其目前尤其用于动物饲料。

根据又一种实施方式，蛋白质水解产物包括分子量包括在1500Da和5000Da之间的主要部分P1。

根据又一种实施方式，蛋白质水解产物包括分子量包括在10000Da和17000Da之间的大约20％部分的P2。

根据又一种实施方式，蛋白质水解产物包括分子量是大约23000Da的大约20％的部分P3。

根据又一种实施方式，蛋白质水解产物包含分子量包括在1500Da和5000Da之间的主要部分P1以及分子量包括在10000和17000Da之间的部分P2。

在第三个方面，本发明涉及来自阿拉伯辣木种子饼的蛋白质水解产物作为药物的应用。

在第四方面，本发明关于药物组合物或皮肤病组合物，其包括作为活性剂的有效量的根据本发明的来自阿拉伯辣木种子饼的蛋白质水解产物，以及生理学上可接受的赋形剂。

根据本发明的组合物可以是正常使用的任何盖仑形式(galenical form)，这取决于该组合物是否要被摄入、注射还是施用于皮肤或粘膜。

根据第一变化，所述各种组合物适合于摄入；所述组合物可以是胶囊、糖浆、颗粒或片剂的形式。它不必包含任何赋形剂，并且可以由包含干形式的蛋白质水解产物的植物提取物完全构成。

根据第二变化，所述各种组合物适合于注射；所述组合物可以是水性或油性洗剂的形式，或者血清的形式。

根据第三变化，各种组合物更特别适合局部给药，使得能够通过皮肤或粘膜在病症的确切部位获得药理学作用。

根据本发明用于给药活性剂的主要局部模式是皮肤和经皮模式、鼻和呼吸道模式、眼部模式、耳部模式和阴道模式。可以设想其它模式，特别是口腔模式，用于通过粘膜给药组合物以及通过微注射的皮下模式。

根据本发明的用于药物用途的组合物可以是通常通过局部途径用于施用的任何盖仑形式。它们可以向粘膜给药，特别是通过鼻或呼吸道、眼部、口腔、阴道和耳部给药。

根据本发明的用于皮肤病学用途的组合物可以是通常在用于皮肤施用的皮肤病学领域中使用的任何盖仑形式。它们可以经皮给药或局部施用于皮肤。

根据本发明掺入蛋白质水解产物的组合物可以包括常规用于局部或皮肤给药的这类制剂中的成分。

根据优选实施方式，各种组合物适合于局部给药并且包括乳膏、水包油和油包水乳剂、乳状物、软膏、洗剂、油、香膏、水性或水醇或乙醇溶液、血清、散剂、贴剂、喷雾剂或用于外部施用的任何其他产品，诸如，例如医疗器械或还包含在压力下的抛射剂的气溶胶产品。

根据另一种优选实施方式，所述各种组合物适合于皮下注射和经皮给药；所述组合物可以是水性洗剂、乳液的形式，或者血清的形式。在经皮或贴剂系统中，活性成分或成分的释放由通常是粘合的并与皮肤直接接触的可渗透膜控制。

更具体地旨在用于局部给药的根据本发明的组合物含有可接受的药物或皮肤病学介质，即与皮肤和粘膜相容，并包含所有适当的盖仑形式。这些组合物特别可以是乳膏、水包油乳液或油包水乳液或复合乳剂、血清、溶液、悬浮液、凝胶、乳状物、洗剂、棍状物、气雾剂、喷雾剂或用于外部施用的任何其他产品的形式，诸如例如，医疗器械或也含有加压推进剂的气溶胶产品，或者实际上适合施用于皮肤和粘膜的任何形式的散剂。这些组合物包括其制剂所必需的赋形剂，诸如溶剂、润肤剂、增稠剂、稀释剂、表面活性剂、抗氧化剂、生物活性剂、着色剂、防腐剂和香精。

根据本发明的组合物因此包括在预想的应用领域中常规使用的任何添加剂以及其制剂所需的佐剂，诸如溶剂、增稠剂、稀释剂、抗氧化剂、着色剂、防晒剂、仿晒剂(self-tanning agents)、颜料、填料、防腐剂、香精、气味吸收剂、皮肤病学或药物活性剂、精油、维生素、必需脂肪酸、表面活性剂、成膜聚合物等。

在所有情况下，本领域技术人员将注意确保选择这些佐剂及其比例，使得它们不会对根据本发明的组合物的所需有利性质产生有害影响。

在本发明的组合物中，根据本发明的蛋白质水解产物以按重量计相对于组合物的总重量的0.0001％至40％的量使用。

在优选的实施方式中，根据本发明的蛋白质水解产物以相对于组合物的总重量按重量计0.001％至10％，更优选相对于组合物的总重量按重量计0.01％至5％的量使用。

最后，在第五方面，本发明涉及药物组合物或皮肤病学组合物，其用作治疗以下疾病的药物：

-纤维化疾病和炎症的治疗，包括作为活性剂的有效量的蛋白质水解产物的部分P1或P2，优选部分P1。

-癌症，包括作为活性剂的有效量的蛋白质水解产物的部分P3。

-细菌或病毒类型的感染性疾病，特别是为了抑制刺突-COV2蛋白，包括作为活性剂的有效量的作为整体的蛋白质水解产物。

-遗传漂变和与皮肤色素沉着相关的病理，其包括作为活性剂的有效量的蛋白质水解产物的部分P1或P2。“遗传漂变”一词特别指的是环境应激。术语“与色素沉着相关的病理”是指例如癌和雀斑痣。

对于纤维化疾病的治疗，术语纤维化是指肺纤维化、肾纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化、眼纤维化、心脏纤维化和其他各种纤维化状态，以及对于其他弗林蛋白酶介导的病理状态的治疗，特别是但不限于高血压、癌症、包括病毒性和细菌性疾病在内的感染性疾病、遗传性疾病(例如囊性纤维化(CF))和神经退行性疾病。

虽然已经针对几个特定实施方式描述了本发明，但很明显，本发明不以任何方式局限于这些实施方式，并且如果它们落入本发明的范围内，则包括所描述的方式的任何技术等同物以及它们的组合。

动词“由……组成(compose of)”、“包括(comprise)”或“包括(include)”及其结合形式的使用并不排除除权利要求中限定的那些元素或步骤以外的元素或步骤的存在。

实施例

实施例1：从阿拉伯辣木饼开始制备根据本发明的植物蛋白质水解产物

阿拉伯辣木(Forssk.)的种子将Fiori干燥以获得小于8％且优选约6％的内部含水率，然后用无头螺杆机械压榨机以将油从种子的剩余部分中分离出来的方式压榨，以便一方面获得初榨油，另一方面获得饼。然后将饼以预切挤出物的形式分离成1至2cm的块，在其上进行提取。

所用的起始原料如下。

[表1]

方案：

a)制备一种浓缩的1摩尔的强碱诸如氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化钙的溶液，特别地或具有1摩尔浓度的强碱，但优选氢氧化钠的水性混合物；这种强碱性溶液具有在13和14之间的pH，

b)将预切成1cm块的9.1％(重量/重量)阿拉伯辣木饼称量到大约90.9％(重量/重量)的碱性溶液中，

c)碾磨在步骤b)中获得的所述饼，

d)将在步骤c)中获得的碾磨饼分散在水相中，

e)在22℃的温度下对在步骤d)中获得的水性分散体进行化学蛋白水解2小时的时间，

f)中和所述蛋白水解以稳定获得的蛋白质水解产物，

g)通过由通过1μm过滤器进行固/液分离回收所述蛋白质水解产物，

h)通过超滤纯化蛋白质水解产物，

获得包含大约12.48％的干物质的半透明黄色滤液。获得的液体提取物在下文中被称为“根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物”或“阿拉伯辣木蛋白质水解产物”或“根据本发明的提取物”。

根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物具有的密度大于1并且优选为约1.1，其包括在10％和15％之间、优选约12.5％的干物质内容物，包括在1％和6％之间的含氮化合物，尤其是比例为0.5％至1.5％、优选约0.8％的挥发性腈衍生物，以及20mg/升的多酚。下面给出了根据本发明的干燥阿拉伯辣木蛋白质水解产物的组成。

[表2]

Rt	CAS号	化合物	％DM
				4.42.	64-17-5	乙醇	0.809
5.58	67-64-1	丙酮	0.444
				6.10	75-15-0	二硫化碳	0.327
7.83	78-93-3	2-丁酮	0.165
				8.57	141-78-6	乙酸乙酯	0.047
8.99	78-82-0	异丁腈	20.720
				10.39	78-82-0	异丁腈	0.127
12.06	547-63-7	异丁酸甲酯	0.201
				14.10	18936-17-9	2-甲基丁腈	2.194
14.56	625-28-5	3-甲基丁腈	27.495
				18.77	66-25-1	己醛	0.186
21.09	2253-73-8	异硫氰酸异丙酯	4.590
				23.65	628-73-9	己腈	0.198
24.43	110-43-0	2-庚酮	0.093
				27.18	4426-79-3	2-异硫氰酸丁酯	1.058
27.59	80-56-8	α-蒎烯	0.048
				28.45	591-82-2	异硫氰酸异丁酯	2.299
28.99	100-52-7	苯甲醛	1.753
				29.77	108-95-2	苯酚	0.413
30.80	13475-82-6	22466-五甲基庚烷	0.318
				32.80	99-87-6	对伞花烃	0.232
33.10	138-86-3	柠烯	0.133
				33.34	470-82-6	桉树脑	0.918
36.45	1195-32-0	脱氢对伞花烃	0.035
				36.88	124-19-6	壬醛	0.080
40.26	65-85-0	苯甲酸	19.150
				41.07	1490-04-6	薄荷醇	0.918
56.29	96-76-4	24-二-叔丁基苯酚	0.086
						总计	85.035

阿拉伯辣木蛋白质水解产物含有相对高水平的异硫氰酸异丙酯和异硫氰酸异丁酯，证实了以前关于该物种的出版物(KJAER,A.et al.1979,Isothiocyanates inMyrosinase-treated seed extracts of Moringa peregrina,Phytochemistry,18,p.1485-1487；AFSHARYPUOR,S.et al.,2010,Volatile Constituents of the SeedKernel and Leaf of Moringa peregrina(Forssk.)Fiori,Agricolt.Cultivated inChabahar(Iran),Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences 6(2):p.141-144；DEHSHAHRI,S.et al.,2012,Determination of volatile glucosinate degradationproducts in seed coat,stem and in vitro cultures of Moringa peregrina(Forssk.)Fiori,ScienceOpen,Research in Pharmaceutical Sciences 7(1):p.51-56).异硫氰酸酯是由属于十字花目，特别是在十字花科、山柑科(Capparaceae)、番木瓜科(Caricaceae)和辣木科的各种植物产生的化合物，作为抵御病原体攻击的防御系统。在辣木属中，尤其是在辣木(M.oleifera Lam.)和狭瓣辣木(M.stenopetala(Baker f.)Cufold)(A_BD RANI,N.Z.et al.,2018,Moringa genus:A review of Phytochemistry andPharmacology,Frontiers in Pharmacology,vol.9,art.108,p.3-8)中鉴定了它们。当植物组织受损时，异硫氰酸酯来源于通过黑芥子酶水解硫代葡萄糖苷。据报道，异硫氰酸酯具有多种生物学效应，如抗真菌活性(T_RONCOSO-R_OJAS,R.et al.,2007,Natural compounds tocontrol fungal diseases in fruits&vegetables,in TRONCOSO-ROJAS,R.,TIZNADO-HERNANDEZ,M.E.,GONZALEZ-LEON,A.(ed)Recent advances in alternative postharvesttechnologies to control fungal diseases in fruits&vegetables.TransworldResearch Network,Kerala,India,p.127–156；TRONCOSO-ROJAS,R.et al.,2005,Analysisof the isothiocyanates present in cabbage leaves extract and their potentialapplication to control Alternaria rot in bell peppers,Food ResearchInternational 38,p.701–708)、抗菌、抗癌和抗炎作用(P_ARK,E.J.et al.,2011,Inhibition of lipopolysaccharide induced cyclooxygenase-2expression andinducible nitric oxide synthase by4-[(2′-Ο-acetyl-α-L-rhamnosyloxy)benzyl]isothiocyanate from M.oleifera,Nutrition and Cancer 63(6),p.971-982；R_AJANT.S.et al.,2016,Anticancer activity of glucomoringin isothiocyanate in humanmalignant astrocytoma cells,Fitoterapa 110,p.1-7；PADLA,E.P.et al.2012,Antimicrobial isothiocyanates from the seeds of Moringa oleifera Lam.,Zeitschrift für Naturforschung C,67,p.557–564；WATERMAN,C.et al.,2014,Stable,water extractable isothiocyanates from Moringa oleifera leaves attenuateinflammation in vitro.Phytochemistry103,p.114–122)。糠醛以发现的高度标准的浓度存在于这种类型的种子和许多干果中。二硫化碳、异丁腈、异丁酸甲酯、甲基丁腈和己腈是从氨基酸获得的挥发性化合物。它们是蛋白质降解的标志物。这些降解化合物占阿拉伯辣木蛋白质水解产物的挥发性化合物的大约50％。该结果表明水解产物主要由蛋白质构成。在阿拉伯辣木蛋白质水解产物中仅检测到非常微量的脂肪或游离糖；水解产物主要由蛋白质和糖蛋白构成。在干物质中，柠檬酸盐缓冲剂(其是苷类化合物)占剩余部分的大约50％，并且包括由蛋白质、寡肽和氨基酸的蛋白水解降解产生的糖基化(苷类)化合物。最后，应注意从阿拉伯辣木种子获得的多酚的存在为大约21mg/升(0.002％)。在表征中不考虑苯甲酸，因为它是添加到提取物中的稳定剂。

上述干提取物是通过基于蒸发之前和之后液体提取物中存在的质量的重量法获得的。

实施例2：根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物作为弗林转化酶(称为弗林) 抑制剂的作用

本研究的目的是评估根据实施例1获得的来自阿拉伯辣木种子饼的蛋白质水解产物的抑制活性。

方案：该研究是使用重组人弗林进行的，其催化特定荧光参比底物的裂解。

使用100nM癸酰基-Arg-Val-Lys-Arg-CMK作为用于弗林活性的参比抑制剂。

将弗林在不存在(对照)或存在参比产品或增加的测试化合物浓度的情况下，在环境温度下预温育10分钟：

“阿拉伯辣木蛋白水解物”；0.02；0.2和2％(v/v)。

在预温育步骤结束时，加入弗林底物，并且将实验条件再次在远离光照的环境温度下温育5分钟。所有实验一式三份进行。

化合物的制备：

将测试的阿拉伯辣木蛋白质水解产物直接溶解在测定缓冲液中然后稀释以获得上述测试浓度。

评价方案

在加入底物后，通过读取485nm/535nm处的荧光对荧光弗林底物的裂解监测5分钟。

统计学

结果以RFU(相对荧光单位)+/-S.D.(标准偏差)表示。

通过t检验评价“对照”和“参比产品”组之间观察到的差异的统计显著性(p<0.001)。

通过单因素ANOVA，然后Holm-Sidak检验评价“对照”或“参比产品”和“测试化合物”组之间观察到的差异的统计显著性(p<0.05)。

在100nM下测试的弗林的参比抑制剂，称为癸酰基-Arg-Val-Lys-Arg-CMK，显著抑制了97.9％的弗林活性(p<0.001)。

这个结果是预期的并且验证了研究。

下面给出了与获得的碱活性相比的弗林酶活性的结果。

[表3]

结论：在2％的浓度下，根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物能够抑制98.8％的弗林转化酶的活性。在超过0.2％的浓度下，根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物能够抑制达26.8％的弗林转化酶的活性。

实施例3：根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物在抑制组蛋白脱乙酰酶 (HDAC)和sirtuin I酶中的作用

本研究的目的是证明根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物对HDAC和sirtuinI酶的抑制活性，这些酶通过调节染色质的缩合/脱缩参与控制遗传漂变，其提供或阻断对DNA携带的基因的获取。将HDAC和sirtuin I的缓冲溶液与底物在37℃下反应超过20分钟，并将其转化以形成化合物，在37℃下温育10分钟后，该化合物在显色剂存在下显色。因此，可以通过测量在405nm处的吸光度来评价sirtuin的最大脱乙酰活性。将根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物或参比产品“曲古抑菌素A(STA)抑制剂1μM”同时作为酶底物与sirtuin溶液在37℃下接触20分钟，并通过添加显色剂对通过酶转化的底物染色。然后通过测量在405nm处的吸光度来评价在存在活性成分下HDAC和sirtuin I的脱乙酰活性。在不存在活性成分下，即仅在存在HDAC和sirtuin I酶的底物下，将此活性的调节表达为HDAC和sirtuin I的最大活性的抑制百分比或激活百分比。

方案：在不存在(对照)或存在参比产品或渐增浓度的待测试产品下，将sirtuin酶溶液在其底物中温育20min。将本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物在以下浓度下进行测试：2％；1％；0.1％(V/V)。在温育期结束时，通过使用显影剂溶液(在37℃下10min)染色来显示并通过测量在405nm处的反应介质的吸光度来评价具有和不具有测试产品或参比产品的sirtuin酶的活性。对于每个测试浓度，通过使用以下公式计算测试产品对组蛋白脱乙酰酶和sirtuin I酶的脱乙酰活性的调节。

[数学式1]sirtuin酶活性的百分比调节＝100x[(在测试或参比中产生的OD₄₀₅)–(OD₄₀₅仅HDAC和sirtuin I)]/仅OD₄₀₅ sirtuin。

如果结果为阴性，则将百分比表示为酶促反应的抑制；如果结果为阳性，则将百分比表示为酶促反应的激活。以下给出了组蛋白脱乙酰酶(HDAC)的抑制结果。

[表4]

结论：在2％时，根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物表现出对HDAC的显著抑制；这种抑制揭示了促进皮肤细胞自我保护免受遗传漂变的能力。因此，该提取物似乎可用于对抗皮肤表面上最常见的遗传漂移之一，即纤维化，其通过肉的“肿块”(纤维化隆凸)的出现来表现。提取物可以有利地干扰皮肤表面的纤维化现象。

实施例4：根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物对抑制内皮素1(ET-1)作用的 效果

内皮素是一种源自内皮细胞的激素肽，能够通过其受体作用于各种细胞和组织。例如，已知内皮素会导致平滑肌血管细胞和其他细胞中钙的细胞内浓度增加(OHBA T.等人，WO 2012/081370)。

近年来有报道称，内皮素1型(ET-1)是通过直接和间接作用来收缩平滑血管和非血管肌肉细胞的生物活性因子。据认为，内皮素作用的增加为外周部位中、肾脏中和大脑中的血管提供了持续的血管收缩，并且可能是多种疾病诸如高血压、心肌梗死、脑血管意外、急性肾功能不全，雷诺综合征(Raynaud sydrome)、动脉粥样硬化、哮喘和前列腺癌的起源(M_IYAGAWA K.&Emoto N.et al.,2014,Current state of endothelin receptorantagonism in hypertension and pulmonary hypertension,Therapeutic Advances inCardiovascular Diseases,vol.8(5)202-216；SCHINZARI F.et al.,2018,IncreasedEndothelin-1-Mediated Vasoconstrictor Tone in Human Obesity:Effects of GutHormones,Physiological Research 67suppl.1:S69-S81)。来自具有相似结构的内皮素家族的三种类型的肽存在于动物中，包括人类(K_ADONO,S.et al.,2001,The Role of theEpidermal Endothelin Cascade in the Hyperpigmentation Mechanism of LentigoSenilis,Journal of Investigative Dermatology 116 4,p.571-577；A_NONYMOUS,2006,American Society for Biochemistry and Molecular Biology,New CosmeticsHandbook,p.527-529)。所有这些肽都具有血管收缩作用和血管抑制作用。

最近，已经阐明了内皮素在平滑血管肌肉细胞以外的多种细胞中的作用。例如，科学出版物报道，当皮肤暴露于UV辐射时，ET-1和其他因子的产生会增加角质形成细胞，并且表明ET-1可能与暴露于UV辐射的黑素细胞中的黑色素生成有关。因此，抑制内皮素的表达被认为是有用的，不仅用于预防和/或治疗上述疾病，而且为了预防或改善(I_MOKAWA,G.etal.,1995,Endothelin-1as a New Melanogen:Coordinated Expression of its Geneand the Tyrosinase Gene in UVB-Exposed Human Epidermis,Journal ofInvestigative Dermatology 1051,p.32-37；IMOKAWA,G.et al.,1992,EndothelinsSecreted from Keratinocytes are Intrinsic Mitogens for Human Melanocytes,Journal of Biological Chemistry,267,p.24675-24680；G_ILCHREST,B.et al.,1996,Mechanisms of Ultraviolet Light-Induced Pigmentation,Photochemistry andPhotobioliogy 63,p.1-10)。

其目的是在暴露于根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物24h后测定人微血管内皮细胞中的1型内皮素。

方案：人微血管内皮细胞由PELOBiotech公司提供，并根据供应商的生产程序在96孔板中培养。这意味着允许提取物在不同浓度在80％汇合下作用于内皮细胞24小时，然后借助ELISA PicoKine(EDN1)试剂盒对细胞上清液中的内皮素1进行量化。进行了先前的生存力测试，以对在测定内皮素1时将使用的无毒剂量进行限定。将培养基中未处理的细胞形成阴性对照。生存力测试中的阳性对照为0.5％SDS。所有条件均在培养基中准备并且随后将细胞在36.5℃/5％CO₂下温育24小时。

a)将测试溶液施用至内皮细胞：

将测试产品与在96孔板中的处于亚汇合的内皮细胞接触。对每种浓度的3个孔进行测试。将板在36.5℃/5％CO₂下温育24小时±1小时。

b)生存力测试：

与产品一起温育后，用MTT方法评价细胞的细胞生存力。温育24小时后，将上清液回收并且储存在-20℃下用于测定。然后用200μL的PBS冲洗孔一次。向每个孔中添加50μL的0.5mg/ml MTT溶液：在36.5℃/5％CO₂下温育3小时。向每个孔中添加100μL的异丙醇。均质化后，在550nm处记录吸光度。对于每种条件，细胞的光密度平均值与阴性对照的光密度平均值的比率确定生存力比率。

c)内皮素1测定：

测定是在ELISA试剂盒的帮助下进行的。以下给出了对内皮素作用的抑制的结果。

[表5]

结论：在处理结束时进行的生存力测试没有示出对测试的浓度的任何毒性作用。

内皮素1测定在无毒浓度的细胞上清液中进行。借助于ELISA试剂盒测定每种条件下的内皮素1的量。

对于基础水平对照细胞，该值为大约134.94pg/mL。对于用不同浓度的水解产物处理的细胞，基础水平降低47.09pg/mL(用2％的根据本发明的提取物)，并且降低17.58pg/mL(用1％的根据本发明的提取物)。这证明了1％的根据本发明的提取物的非常显著的抑制作用，对1型内皮素的产生具有大约13％的抑制作用，并且2％的根据本发明的提取物具有高达34.90％的抑制作用。

内皮素及其特异的剂量依赖性抑制的结果表明，根据本发明的蛋白质水解产物由于其显著降低内皮素的能力而具有抗血管生成和抗纤维化作用。

下面描述了用于评估实施例12中描述的P1、P2、P3和复合物P1+P2的补充研究，用于内皮素的生产：正常人内皮细胞的细胞测试模型。

如实施例12所述，从根据本发明的水解产物中分离出3条带或蛋白质部分，其特征为它们的质量P1(分子量小于10000Da)、P2(分子量包括在10000和17000Da之间)和最后P3(分子量约为23000Da)。这些部分在下文中也称为“提取物”。

[表6]

统计显著性(p>0.05)

在所有浓度下，标准偏差都高，并且蛋白质水解产物的部分P1对1型内皮素没有表现出任何显著的调节。

[表7]

^*统计显著性(p>0.05)

^**统计显著性(p<0.05)

在0.1％和1％的浓度下，标准偏差高，并且在这些浓度下，蛋白质水解产物的部分P2对1型内皮素没有表现出任何显著的调节。在0.3％的浓度下，P2对1型内皮素的产生的抑制为24.8％。

[表8]

^*统计显著性(p>0.05)

在所有浓度下，标准偏差都高，并且部分P1+P2的组合对1型内皮素没有表现出任何显著的调节。

[表9]

^*统计显著性(p>0.05)

***:统计显著性(p<0.001)

在0.3％和1％的浓度下，蛋白质水解产物的部分P3非常显著地抑制大约50％的1型内皮素的产生。

结论：称为“提取物P1”和“提取物P2”的化合物对1型内皮素的调节没有显著作用，只有具有根据本发明的提取物的0.3％的“提取物P3”显著降低了单层培养物中正常人内皮细胞释放到培养基中的内皮素-1，其抑制得分为52.3％。当P1和P2组合时，未观察到协同效应。

提取物P3特别地表现出抗癌作用(B_AGNATO A.et al.,2011,Role of theendothelin axis and its antagonists in the treatment of cancer,BritishJournal of Pharmacology,163:220-233)。

实施例5:根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物对干细胞保护的作用

成人组织，包括皮肤表皮、胃肠上皮和造血系统，具有非常高的细胞更新水平。维持组织稳态的生理过程归因于在器官更新中维持恒定数量的细胞。胚胎干细胞(ESC)对于维持和再生皮肤组织至关重要。

表皮是从胚胎表面的外胚层发育而来的。它从神经胚形成之后覆盖胚胎的单层非特异性祖细胞开始，并且发育成基底表皮层。基底表皮层富含ESC(表皮干细胞)。事实上，这一层的细胞产生所有的表皮结构，包括分层表皮(也称为毛囊间表皮)和表皮附件，诸如毛囊、皮脂腺和汗腺。下层真皮主要来源于外胚层下的中胚层。中胚层是间充质干细胞的主要来源，间充质干细胞产生生成胶原蛋白的成纤维细胞、下层脂肪细胞和皮肤的免疫细胞。

干细胞是未分化的细胞，被称为多能细胞，具有年轻的基因型，能够自我更新和分化以产生器官或组织诸如皮肤。在这个阶段，它们被鉴定为“多能细胞”。鉴于50％的干细胞群的后代仍未分化，干细胞有助于保持体内平衡并且确保受损或衰老的分化细胞的更新。然而，这些表皮干细胞经常受到环境的影响。根据Y_EJIN Ge et al.(10March 2020,Theaging skin microenvironment dictates stem cell behavior,PNAS,Vol.117,p.5339-5350)，氧化应激诸如污染或紫外线辐射损害它们的DNA。这种损伤改变了它们的自我更新和分化能力，导致干细胞库的减少，最终导致皮肤老化。

该研究的目的是评估根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物对保护表皮干细胞免受UVB辐照的影响。

方案：从62岁的供体获得人角质形成细胞。为了进行实验，将角质形成细胞以单层培养，直到它们达到80％的汇合。

然后按照Goodell，M.等人(1996,Hoescht 33342HSC staining and stem cellpurification protocol,Journal of Experimental Medicine 183,p.1797-806)描述的方法将细胞培养物富集在表皮干细胞中。

参比产品：本研究使用1μM槲皮素作为参比产品。槲皮素购自于Sigma Aldrich。

将细胞在没有(“对照”)或存在参比产品或渐增浓度的待测化合物的情况下预温育24小时。在预温育期结束时，用UVB(30mJ/cm²)辐照细胞，然后在37℃下在没有(参比)或存在参比产品的情况下或通过增加待测化合物的浓度来温育8天。

“阿拉伯辣木蛋白质水解产物”：0.01；0.05和0.15％(v/v)。

测试化合物的制备：

将测试化合物“阿拉伯辣木蛋白质水解产物”直接稀释在温育培养基中以获得上述各种浓度。

在温育期结束时，使用阿尔玛蓝(Alamar blue)测量细胞生存力，阿尔玛蓝是基于通过线粒体减少刃天青(rezazurin)的非细胞毒性生存力指标。每个实验条件一式三份(n＝3)进行。

结果在下面以相对于“无UVB的对照”实验条件(平均值+/-S.D)的生存力百分比表示。借助t检验评估“无UVB的对照”和“具有UVB的对照”之间的显著水平(p<0.05)。

[表10]

结论：阿拉伯辣木蛋白质水解产物可以显著地对受到细胞应激(UV)的人体皮肤的干细胞进行保护。干细胞是具有保存的和年轻DNA物质的细胞。它们是组织再生的起源，并且恢复到年轻和健康的状态。干细胞的保护与保存DNA材料的能力相关。根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物维持干细胞的完整性，因此它涉及DNA转换。

实施例6：根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物对保存DNA的作用

端粒长度的动态对于调节细胞中的复制寿命非常重要，特别是在长寿的物种的情况下。端粒的缩短和端粒酶的活性是衰老和肿瘤发生的重要因素(SHAY,J.W.&Wright,W.E.,2005,Senescence and Immortalization:Role of Telomeres and Telomerase,Carcinogenesis 26(5),p.867-874)。端粒是复杂的核苷酸序列，它覆盖染色体末端使其免于降解、不希望的融合重组和对DNA损伤反应的不适当激活。它们还在细胞分裂和染色体稳定性中发挥重要作用。越来越多的证据表明，端粒的稳定性及其平均长度会受到压力的影响，特别是环境压力或环境影响下的疾病。(V_ALDES,A.L.et al.,July 2005,Obesity,cigarette smoking and telomere length in women,Research Letters.366(9486),p.662-664；PHILLIPS A.C.et al.,2013,Do symptoms of depression predict telomerelength？Evidence from the West of Scotland Twenty-07 Study,PsychosomaticMedicine,75(3),p.288-296；SHIN,D.et al.May 2019,Effects of inflammation anddepression on telomere length in young adults in the United States,Journal ofClinical Med 2019,8(5),p.711；SALIQUES,S.et al.,October 2010,Telomer lengthand cardiovascular disease,Archives of Cardiovascular Diseases,103(8-9),p.454-459)。因此，极短的端粒与神经退行性疾病、心血管疾病(CVD)和癌症风险有关。

端粒酶是核糖核蛋白，它催化将端粒重复添加到端粒末端。端粒是长段的重复序列，其覆盖染色体末端并且已知稳定染色体。在人类中，端粒通常为7至10kb长，并包括序列-TTAGGG-的多个重复。

端粒酶在大多数成体细胞中不表达，并且端粒的长度随着连续的复制周期而减少。在一定数量的复制周期后，端粒的渐进缩短引起细胞进入端粒危机阶段，进而导致细胞衰老。某些疾病与端粒的快速丧失有关，导致早熟细胞的过早衰老。已经表明，人类细胞中编码人类端粒酶蛋白的基因的表达(B_LASCO M.,2007,Telomere Length,Stem Cells andAging,Nature Chemical Biology,3(10),p.640-649)产生具有恒定质量的表型，可能是通过逆转细胞自然衰老的途径。此外，在上面引用的研究中已经证明，端粒酶基因在具有短端粒的衰老细胞中的表达导致端粒长度增加并且恢复通常与年轻细胞相关的表型。

此研究的目的是评价被称为“阿拉伯辣木蛋白质水解产物”的化合物在单层培养中由正常的人成纤维细胞构成的模型中对端粒缩短的作用。众所周知，端粒对应于生物钟。端粒的长度随着细胞分裂而逐渐减小，最终导致细胞无法复制。使用定量PCR测量端粒的长度，并且与第2代和第5代细胞之间的端粒长度进行比较。

方案：从44岁的供体获得人成纤维细胞。为了进行实验，使用第2代和第5代细胞。成纤维细胞在没有(对照)或存在阿拉伯辣木蛋白质水解产物的测试浓度增加的情况下连续培养3代：0.01％；0.1％和0.5％(V/V)。

测试化合物的制备：将“阿拉伯辣木蛋白质水解产物”测试化合物直接溶解在温育培养基中以获得上述各种浓度。

在温育结束时，将细胞胰酶消化。通过专用的DNA提取试剂盒从细胞中提取DNA。通过nanodrop对DNA进行定量。

通过定量PCR(q-PCR)测量端粒长度。对于每个样品，使用SCR(单拷贝参比)基因作为参比基因，通过相对定量测量端粒长度的变化。对于每个样品，使用识别和扩增端粒序列的一组端粒引物进行q-PCR，并且使用识别和扩增人17号染色体上100bp区域的一组SCR引物进行第二q-PCR并充当用于数据归一化的参比。

结果以对应于相对于第2代细胞端粒的长度的相对单位表示(平均值±S.D.)。借助Student检验评估第2代和第5代与“对照”的显著水平(*:p<0.05)。通过单因素方差分析(单因素ANOVA)、随后的Holm-Sidak检验独立评价每种产品的“对照”和“测试化合物”之间的显著性水平(*：p<0.05)。

[表11]

结果：在我们的实验条件下，将阿拉伯辣木蛋白质水解产物在0.05％、0.1％和0.5％(v/v)下测试，显著减少了正常人成纤维细胞端粒的缩短。

端粒缩短(与对照相比)在0.05％(v/v)时表现出+8.9％抑制(p<0.05)；在0.1％(v/v)时为+15.1％(p<0.01)和在0.5％(v/v)为+16.6％(p<0.01)。结论：在人细胞正常增殖或分裂的背景下，根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物显示出显著增加端粒长度的能力。端粒是参与保护DNA材料的栓；增加端粒的长度与保存DNA材料的能力相关。阿拉伯辣木蛋白质水解产物能够增加端粒的长度。因此，这种水解产物参与人类遗传物质(DNA)的保存。

对实施例12中描述的提取物P1、P2、P3和复合物P1+P2的通过增加端粒长度在几代细胞分裂后保护DNA的能力的补充研究。

[表12]

^*统计显著性(p>0.05)

**:统计显著性(p<0.01)

***:统计显著性(p<0.001)

从浓度为0.3％的细胞分裂3次后，根据本发明的提取物P1使正常人细胞培养模型(成纤维细胞)上的端粒大小增加了24.3％。在1％浓度下，在相同条件下，提取物P1使端粒大小增加了39.6％。

[表13]

^*统计显著性(p>0.05)

在正常人细胞培养模型(成纤维细胞)上进行3次细胞分裂后，根据本发明的提取物P2对于每种测试浓度的端粒具有未经统计学证实的伸长趋势。

[表14]

^*统计显著性(p>0.05)

在正常人细胞培养模型(成纤维细胞)上进行3次细胞分裂后，根据本发明的提取物P3对于每种测试浓度没有促进端粒伸长能力。

[表15]

^*统计显著性(p>0.05)

**:统计显著性(p<0.01)

在1％浓度(即每种提取物的0.5％)下细胞分裂3次后，根据本发明的提取物P1和P2的混合物(按体积计50/50)使正常人细胞培养模型(成纤维细胞)上的端粒大小增加了49.1％。单个提取物未达到该得分，并且因此通过混合提取物P1和P2证明了协同效应。

结论：被称为“提取物P1”和“提取物P1+P2”的化合物，显著减少了在3个连续细胞代之后发生的端粒的缩短。P1和P2的组合证实了协同效应。

实施例7：根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物刺激ZAG蛋白的作用

锌α-2-糖蛋白(ZAG)是一种血浆糖蛋白，它的名字来源于它的电泳迁移率和它被Zn盐沉淀的能力。ZAG是免疫球蛋白基因超家族的成员，并且具有与I类和II类CMH分子高度同源的三维结构。已在乳腺、前列腺和肝的正常分泌上皮细胞中、在唾液腺、支气管、胃肠道和汗腺中以及在包括表皮的正常复层上皮细胞中免疫组织化学地检测到ZAG。ZAG的mRNA保持均匀分布在各种类型的细胞中(F_REIJE,J.P.et al.,1991,Human Zn-α2-GlycoproteincDNA Cloning and Expression Analysis in Benign and Malignant Breast Tissues,FEBS Letters 290(1-2),p.247-249)。由于其由分泌上皮产生，ZAG存在于大部分身体分泌物中，并且分别占唾液中蛋白质的2.5％和精液中蛋白质的30％。据报道，血浆和血清中ZAG的水平随年龄而变化，报告的值从0.9至3.5mg/dl(胎儿)到7.8至12.1mg/dl(年轻人)(J_IRKA,M.et al.,1974,The Zn-alpha 2-Glycoprotein Level in Human Serum DuringOntogenesis.Clinica Chimica Acta 56,p.31-33；Jirka,M.et al.,1978,Human SerumZn-α2-Glycoprotein in Amniotic Fluid,Clinica Chimica Acta 85,p.107-110)。ZAG在乳腺囊肿液中积聚高达30至50倍的血浆浓度(B_UNDRED et al.,1987,AnImmunohistochemical Study of the Tissue Distribution of the Breast Cyst FluidProtein,Zinc Alpha2-Glycoprotein,Histopathology 11,p.603-610；D_IEZ-I_TZA,I.etal.,1993,Zn-α2-Glycoprotein Levels in Breast Cancer Cytosols and Correlationwith Clinical,Histological,and Biochemical Parameters,European Journal ofCancer 29A,p.1256-1260)，并在40％至50％的乳腺癌中过度表达。最近已经证明(SUSAN,M.el al.,Zinc-alpha2-glycoprotein Expression as a Predictor of MetastaticProstate Cancer Following Radical Prostatectomy,2006,Journal of the NationalCancer Institute,Volume 98(19),p.1420–1424)ZAG是由大多数前列腺癌大量产生的，这导致前列腺癌患者在基底细胞癌中的血清ZAG水平升高。本研究的目的是评估阿拉伯辣木蛋白质水解产物刺激ZAG的能力。

方案：根据内部程序，从包皮中分离正常人角质形成细胞并将其在24孔板和96孔板中培养。

这涉及在80％汇合时让样品以规定浓度作用于角质形成细胞48小时，然后借助ELISA试剂盒定量细胞上清液中的ZAG。

进行了先前的生存力测试，以对在测定ZAG时将使用的无毒剂量进行限定。阴性对照是在未经处理的培养细胞的帮助下产生的。用于生存力测试的阳性对照为0.5％SDS。

所有条件均在培养基中准备，并且随后将细胞在36.5℃/5％CO₂下温育24小时用于生存力测试，以及温育48小时用于ZAG测定。

·将测试溶液施用至角质形成细胞：

-将测试产品与在24和96孔板中的处于亚汇合的角质形成细胞接触。

-对于每种浓度，在3个孔中进行测试。

-将板在36.5℃/5％CO₂下温育24小时和48小时。

·生存力测试：

-与产品一起温育后，用MTT方法评价细胞的细胞生存力。

-温育24和48小时后，用200μL PBS冲洗提供的孔一次。

-向每个孔中添加50μL的0.5mg/mL MTT溶液：在36.5℃/5％CO₂下温育3小时。

-向每个孔中添加100μL的异丙醇。

-均质化后，在550nm处记录吸光度。

-对于每种条件，细胞的平均光密度值与阴性对照的平均光密度值的比率确定生存力比率。

·ZAG蛋白的测定：

-温育48小时后，将所有上清液回收并且在-20℃下储存用于测定。

-在ELISA试剂盒的帮助下进行测定。以下给出结果。

[表16]

结论：阿拉伯辣木蛋白质水解产物可以显著增加ZAG的产生，具有良好的剂量依赖性和对人细胞的低毒性。由于这一原因，它具有抗纤维化作用和基于其显著增加ZAG的能力的抗炎作用。

下面描述了用于正常人角质形成细胞的刺激ZAG的补充研究，其从实施例12中鉴定的蛋白质带开始。

[表17]

^*统计显著性(p>0.05)

**:统计显著性(p<0.01)

从0.2％开始，提取物P1将ZAG的产量显著增加了超过107％。

[表18]

^*统计显著性(p>0.05)

**:统计显著性(p<0.05)

从0.2％开始，提取物P2将ZAG的产量显著增加了超过80％。

[表19]

^*统计显著性(p>0.05)

在该研究模型中，提取物P3没有显著影响ZAG的产生的能力。

[表20]

^*统计显著性(p>0.05)

提取物P1和P2的组合表现出激活ZAG产生的趋势，但从统计学角度来看，这种趋势并不显著。因此，提取物P1和P2的组合没有协同作用。

称为“提取物P1”和“提取物P2”的化合物显著增加了单层培养物中正常人角质形成细胞释放到培养基中的ZAG，但是P1和P2的组合没有观察到协同作用。

结论：在根据本发明的水解提取物中，提取物P1在增加ZAG上是性能最佳的提取物。由于这一原因，它从0.2％的剂量具有抗纤维化作用和抗炎作用。

实施例8：根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物对调节DKK1和DKK3测定的作 用

黑素细胞和成纤维细胞之间的相互作用在黑素生成调节中的参与是众所周知的，并且已经被深入研究。尽管这些相互作用尚未完全了解，但它们是导致掌跖区域“美白”的起因，并且现在用于皮肤病学中，用于开发脱色产品。Yamaguchi et al(Y_AMAGUCHI Y.et al.,2004,Mesenchymal-Epithelial Interactions in the Skin:Increased Expression ofDickkopf by Palmoplantar Fibroblasts Inhibits Melanocyte Growth andDifferentiation,Journal of Cell Biology 165(2),p.275-285)已经证明，由掌跖区域的成纤维细胞产生的可溶性信使能够修改这些区域的黑色素细胞分化程序，从而减少黑色素的产生。该信使被该团队鉴定为一种名为Dickopf-1(DKK-1)的蛋白质。

DKK-1用于产生这些结果使用的信号通路现在已被清楚地确定。凭借其对Wnt受体的拮抗作用，DKK-1实际上能够短路由β-联蛋白激活的细胞内信号通路，这些信号通路通常负责调节参与黑素生成的基因。Yamaguchi等人(cf.Supra))还证明了DKK-3(一种与DKK-1相似但对Wnt受体没有任何作用的分子)可能对DKK-1的效应起调节作用。事实上，在这个Wnt受体附近的DKK-3的量越大，DKK-1和这个受体之间在黑素生成上的相互作用就越弱。Yamaguchi等人(cf.supra)的工作还表明，在非掌跖来源的正常人真皮成纤维细胞培养物中鉴定出对DKK1/DKK3比率有影响的剂将使得可以从正常人非掌跖黑素细胞起始来控制黑素产生。

此研究的目的是评价阿拉伯辣木蛋白质水解产物在单层培养中由正常人成纤维细胞构成的模型中对DKK-1的合成和释放的作用。

方案：从68岁的供体获得人成纤维细胞。为了进行实验，将成纤维细胞以单层培养至汇合。100nM地塞米松(dexamethasone)用作DKK-1合成和释放的参比诱导物。将皮肤盘在没有(对照)或存在参比产品或测试产物的情况下温育48小时：“阿拉伯辣木蛋白质水解产物”：0.01％；0.1％和0.5％(V/V)。

在温育结束时，移除温育培养基以进行DKK-1释放方法。

将“阿拉伯辣木蛋白质水解产物”测试化合物直接溶解在温育培养基中以获得上述各种浓度。

在48小时温育期结束时，释放到温育培养基中的DKK-1借助于灵敏和特异的ELISA试剂盒进行定量。

在温育期结束时，借助于光谱比色方法(布拉德福德(Bradford)方法)对细胞裂解物中所含的蛋白质进行定量。

结果表示为每mg的蛋白质的ng DKK-1(平均值±S.D.)。

借助Student检验评估“对照”和“参比产品”之间的显著性水平(p<0.05)。

通过单因素方差分析(单因素ANOVA)、随后的Holm-Sidak检验评价在“对照”和“测试产品”之间的显著性水平(p<0.05)。

在我们的实验条件下，在100nm处测试的注释为“地塞米松”的参比产品相对于“对照”使释放的DKK-1显著增加了181.8％(p<0.01)。以下给出了DKK1测定的调节的结果。

[表21]

研究表明，根据本发明的水解产物在0.05％的剂量下显著增加了DKK1的水平，相对于基础水平增加了26.1％，并且在根据本发明的提取物的浓度为0.5％时，观察到基础水平增加了131.5％。

此研究的目的是评价阿拉伯辣木蛋白质水解产物在单层培养中由正常人成纤维细胞构成的模型中对DKK-3的合成和释放的作用。从68岁的供体获得人成纤维细胞。为了进行实验，将成纤维细胞以单层培养至汇合。从68岁的供体获得人成纤维细胞。为了进行实验，将成纤维细胞以单层培养至汇合。

在48小时温育期结束时，释放到温育培养基中的DKK-3通过灵敏和特异的ELISA试剂盒进行定量。

在温育期结束时，借助于光谱比色方法(布拉德福德方法)对细胞裂解物中所含的蛋白质进行定量。

结果表示为每mg蛋白质的ng DKK-3(平均值±S.D.)。借助Student检验评估“对照”和“参比产品”之间的显著性水平(*：p<0.05)。

通过单因素方差分析(单因素ANOVA)、随后的Holm-Sidak检验评价在“对照”和阿拉伯辣木蛋白质水解产物之间的显著性水平(*：p<0.05)。以下给出了调节DKK3测定的结果。

[表22]

结论：根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物与基础水平相比在0.5％时对DKK3表现出大约21％的显著抑制。根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物由于掌跖抑制原理(β-联蛋白信号通路)而具有管理参与细胞分化的基因的大的能力，通过其能力显著增加DKK1和显著降低DKK3，增加了DKK1/DKK3的比率。

评估实施例10中描述的P1、P2、P3和复合物P1+P2对DKK1的生产的补充研究：正常人成纤维细胞的细胞测试模型。

[表23]

^*统计显著性(p>0.05)

**:统计显著性(p<0.01)

由0.3％的剂量的提取物P1使DKK1的产生显著增加了26.6％，并且在1％的剂量下增加了27.8％。

[表24]

^*统计显著性(p>0.05)

提取物P2在任何实验剂量下都没有显著增加DKK1的产生。

[表25]

^*统计显著性(p>0.05)

提取物P3在任何实验剂量下都没有显著增加DKK1的产生。

[表26]

^*统计显著性(p>0.05)

**:统计显著性(p<0.01)

提取物P1和P2的组合在1％的剂量下(即每种提取物为0.5％)显著增加了DKK1的产量并且超过39％。该得分高于单独使用提取物P1或P2获得的得分；因此，这意味着两种提取物P1和P2的组合具有协同效应。

结论：称为“提取物P1”和“提取物P1+P2”的化合物显著增加了单层培养中正常人成纤维细胞释放到培养基中的DKK-1。当P1和P2混合时，未观察到协同效应。

根据本发明的蛋白质水解产物的上述活性得出的结论是：

在纤维素测试中证明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物最显著的活性是其表观遗传作用，其能够非常显著地减缓细胞分裂后端粒缩短的过程。水解产物是一种细胞保护剂，尤其是干细胞的保护剂，这使它们成为非常好的细胞和组织再生器。这些特性为DNA及其遗传物质提供了非常高的保护。阿拉伯辣木蛋白质水解产物也是ZAG和1型内皮素产生的强大调节剂，具有抗纤维化和抗炎的作用。

实施例9：评估来自脱脂阿拉伯辣木饼的蛋白质水解产物对血管紧张素转化酶2 (ACE2)的作用-抑制剂作用的无细胞研究。

血管紧张素转化酶2特别参与在由其他转化酶激活刺突蛋白后COVID19的细胞内感染，更具体地说是弗林，参见Peter Bradding等人(ACE,TMPRSS2,and furin geneexpression in the airways of people with asthma–implications of COVID-19,JOURNAL ALLERGY CLINICAL IMMUNOLOGY,July 2020,n°146(1),p.206-211)。

[表27]

结论：阿拉伯辣木饼的水解提取物没有显著地参与血管紧张素转化酶2(ACE2)的直接抑制。通过考虑下面实施例11的表[32]，评估了该提取物对另一种转化酶(即弗林)的作用幅度。根据本发明的提取物对弗林的抑制作用已在实施例11的表[32]中明确证明并建立。在单个转化酶上证明的这种特异性抑制强化了根据本发明的蛋白质水解产物作为弗林转化酶的特异性抑制剂的重要性。

实施例10：通过防止“刺突SARS-CoV-2假型冠状病毒”的渗透来评估水解提取物在 抑制纤维素中弗林的抗感染作用：在“SARS-CoV-2假型慢病毒”存在的情况下对人HEK细胞 的纤维素模型。

本评价使用了两种主要组分。一方面，组成型表达全长人ACE2的稳定的重组克隆HEK293细胞(Genbank#NM_021804.3)，具有经流式细胞术证实的ACE2的表面表达。另一方面，刺突SARS-CoV-2假型慢病毒是用刺突SARS-CoV-2(Genbank登录号QHD43416.1)作为包膜糖蛋白而不是传统使用的VSV-G产生的。这些假病毒粒子还含有由CMV启动子引导的萤火虫荧光素酶基因；因此，可以通过荧光素酶报告体的活性以实用的方式测量由峰值介导的细胞进入。刺突SARS-CoV-2假型慢病毒可用于筛选生物安全2级设施中的应用。

所用的起始原料如下：

[表28]

步骤1：将ACE2-HEK细胞平板接种

将ACE2-HEK细胞在解冻培养基1中解冻，在1N生长培养基中扩增，然后收获并且以在50μL解冻培养基1中的10000个细胞/孔的量置于白色透明平底96孔培养板中。将细胞在37℃下温育过夜。

步骤2：假型慢病毒感染试验

第二天，借助倒置显微镜视觉监测验证了细胞层均匀性和完整性，并按照以下说明制备了以下测试成分：

[表29]

在第一步中，将阿拉伯辣木蛋白质水解产物在解冻培养基1中稀释11X至中等浓度，随后将5μL转移到测试板中并与ACE2-HEK细胞进行共温育。在37℃温育30min后，将5μL未稀释的假型慢病毒(裸或S1-刺突)加入相应的孔中用于分析。

将阻断ACE2的mAb用作阳性对照，其在孔中终浓度为0.5uM以用于分析。

步骤3：

温育48小时后，将体积为50μL的荧光素酶试剂加入孔中用于分析，并使用PolarStar Omega发光计测量发光信号。

图1中给出的结果是根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物针对SARS COV2的假病毒的抗感染效果。

结论：阿拉伯辣木蛋白质水解产物对SARS COV2的假病毒表现出令人信服的抗感染作用，从研究模型上的3％(C1)剂量开始。在浓度C1(3％)下已证明有60％的显著抑制作用。

实施例12中鉴定的带P1、P2、P3和复合物P1+P2对弗林转化酶的评价：无细胞测试模型。

对鉴定的带进行的研究并未证明用P1、P2、P3和P1+P2测试的所有浓度下对弗林转化酶有任何抑制作用。

结论：因此，这些蛋白质带中没有一个显示对弗林转化酶的抑制活性。这表明对弗林转化酶的抑制活性是由于通过所述方法获得的蛋白质水解产物整体。

蛋白质水解产物以其整体抑制SARS-CoV2刺突型蛋白，特别是通过灭活弗林转化酶。这些抑制提供抗感染和抑制病毒性质。

实施例11：从阿拉伯辣木种子中获得的不同制剂对弗林转化酶的抑制的比较试验

本研究的目的是评估通过首先对带壳种子冷压获得的阿拉伯辣木油对弗林的活性的抑制作用，然后由大约1.1％的干物质组成的具有乙醇(96％)的阿拉伯辣木提取物对弗林的活性的抑制作用，该干物质本身由按重量计大约55％的2,5-二甲酰基呋喃、2.5％糠醛、1.2％肉豆蔻酸异丙酯、4.7％棕榈酸、11.1％油酸和25.8％甘油三酯组成，并且最后是根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物对弗林的活性的抑制作用。

方案：在使用之前将乙醇(96％)中的阿拉伯辣木提取物和阿拉伯辣木蛋白质水解产物避光储存在+4℃。阿拉伯辣木油在环境温度下储存在黑暗区域。

参比产品：使用100nM癸酰基-Arg-Val-Lys-Arg-CMK作为用于弗林活性的参比抑制剂。

温育方案：将弗林在不存在(对照)或存在参比产品或渐浓度的测试化合物的情况下，在环境温度下预温育10分钟：

-0.3％、1％和3％(V/V)的阿拉伯辣木油。

-0.02％、0.2％和2％(V/V)的在乙醇(96％)中的阿拉伯辣木提取物。

-0.02％、0.2％和2％(v/v)的根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物。在预温育步骤结束时，加入弗林底物，并且将实验条件再次在避光的环境温度下温育5分钟。所有实验一式三份进行。

化合物的制备：将96％乙醇中的阿拉伯辣木提取物和阿拉伯辣木蛋白质水解产物直接溶解在测定缓冲液中，然后稀释以达到测试浓度，如上所述。将阿拉伯辣木油溶解在测定缓冲液中的0.05％吐温20溶液中至3％。然后将溶液稀释以获得上述浓度。

评价方案：在加入底物后，通过读取485nm/535nm处的荧光对荧光弗林底物的裂解监测5分钟。g.统计学：结果以RFU(相对荧光单位)+/-S.D.(标准偏差)表示。通过Student检验评价“对照”和“参比产品”组之间观察到的差异的统计显著性(p<0.001)。通过单因素ANOVA，然后Holm-Sidak检验评价“对照”或“参比产品”和“测试化合物”组之间观察到的差异的统计显著性(p<0.05)。阿拉伯辣木油的结果如图2所示；在图3中是96°乙醇阿拉伯辣木提取物的结果和最后图4给出了根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物的结果。

结果：

[表30]

阿拉伯辣木油的浓度	弗林转化酶的活性
		0.3％(V:V)	91.2％**
1％(V:V)	90.6％**
		3％(V:V)	92.8％**

[表31]

[表32]

^*统计显著性(p>0.05)

**:统计显著性(p<0.01)

***:统计显著性(p<0.001)

结论：本研究使我们能够证明，只有根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物才能在2％的浓度下显著抑制弗林的活性98.8％。

实施例12：阿拉伯辣木蛋白质水解产物-蛋白质带的分离电泳凝胶色谱

在含有十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺上进行凝胶电泳，称为SDS-PAGE电泳。它是一种技术，包括在电场的影响下通过SDS使负电荷饱和，使变性蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中迁移，从而使它们能够分离。这是一种变性技术，通过使用带负电荷的离子洗涤剂(SDS)解离非共价蛋白质复合物。这种洗涤剂通过疏水键无选择性地与两种氨基酸结合。因此，该技术可用于分析蛋白质并且根据其分子量的进行分离。

通过电泳法的分离色谱：

沉积：

-MW＝尺寸标记

-孔1：水解的阿拉伯辣木饼提取物

-孔2：水解的阿拉伯辣木饼提取物的上清液

-孔3：水解的阿拉伯辣木饼提取物的沉淀

孔1中的水解提取物清楚地显示出所有预期的蛋白质带。

孔2(上清液)表现出预期的带，特别是对于中间和最高分子量；孔2似乎浓缩了最低分子量，特别具有挥发物。

孔3(沉淀)明显表现出最高的分子量带(>75000Da)，然后是称为P3的大约23000Da的带，然后是包括在10000和17000Da之间的称为P2的带，最后是小于10000Da的称为P1的带，估计在4000至6000Da之间。

旋转蒸发器制备：

-挥发物在逻辑上与“最轻”化合物一起在上清液中；回收10mL上清液并补充10mL96°乙醇；

-混合物在45℃真空下提取；挥发性化合物在真空烧瓶中冷凝。

-浓缩在挥发物中的冷凝物在SPME微萃取后通过GC/FID。

在SPME萃取法与FID检测之后的气相色谱研究

未检测到挥发性化合物。

结论：蛋白质带的分离表明挥发性化合物不与蛋白质结合；挥发性化合物不参与最小蛋白质带的分子团(molecular cavalcade)。

三个蛋白质带的测定：制备带P1(小于10000Da)和P2(在10000至17000Da之间)和P3(约23000Da)并通过液相色谱分析结合质谱分析(LC MS/MS)。

使用两个用于植物中蛋白质识别的专用软件程序(Mascot和Peaks)获得结果：

鉴定的结果并不能使这些蛋白质被精确鉴定；我们在上述数据库中尚未描述的蛋白质面前。

实施例13：皮肤病抗纤维化产品的制剂(液体清洁剂)

[表31]

实施例14：治疗局部纤维化的皮肤病学产品的制剂(免洗护理产品)

[表32]

实施例15：可皮下注射的组合物的制剂

用于皮下给药的产品的制剂：使根据本发明的干提取物(在菊糖载体上含有60％的蛋白质水解产物)包装单剂量烧瓶中，在惰性气体下，准备通过生理介质溶解。

实施例16：可皮下注射的组合物的制剂

可注射液体产品的配制：根据本发明的液体提取物以在生理培养基中5％的剂量在灭菌条件下包装，特别是通过具有截留阈值为0.45μm真空过滤。

实施例17：以贴剂为形式的制剂(附着到皮肤的敷料或外部医疗器械，浸渍有活性成分，其缓慢释放以提供活性成分的缓慢扩散的效果)。

实施例18：用于在胶囊中药物的制剂

750mg的胶囊中的抗纤维化药物，胶囊含有100g的胡椒碱、300mg根据本发明的干提取物(在菊糖载体上含有60％的蛋白质水解产物)、100mg的乳香脂酸、250mg的碳酸钙)。

实施例19：用于作为片剂的药物的制剂

在1g片剂中的抗纤维化药物：300mg的根据本发明的干提取物(在菊糖载体上含有60％的蛋白水解物)、400mg的含有200IU维生素D的碳酸钙、150mg的葡萄糖酸镁、80mg的菊糖和70mg的硬脂酸镁。

实施例20：用于作为鼻喷雾剂的药物的制剂(在医疗器械中的含有活性成分的溶液，该医疗器械通过通过向鼻腔内喷洒活性溶液来推动活性成分)。

实施例21：对根据本发明的蛋白质水解产物的毒性测试

根据实施例1的蛋白质水解产物的制备：阿拉伯辣木的未去壳种子(Forssk.)在果实成熟时将Fiori干燥，以获得小于8％且优选约6％的内部含水率，然后用无头螺杆机械压榨机以将油从种子的剩余部分中分离出来的方式压榨，以便一方面获得初榨油，另一方面获得饼。然后将饼分离为呈1至2cm块的挤出物的形式。通过按照实施例1中描述的方案，获得液体提取物，在以下测试中以未稀释的形式使用。

1.确定对细菌菌株鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)(TA 100)的致突变 活性–反向细菌突变测试

测试分3个主要阶段进行：

-进行初步实验，以评价待测试元素的细胞毒性，并为随后实验选择剂量范围，

-第一遗传毒性实验(测试1)，具有和不具有代谢活化，在初步研究规定的剂量范围内，在最小凝胶上直接掺入测试系统和测试(或对照)，

-第二实验(测试2)，对测试体系和测试元素(或对照)进行预温育，具有和不具有代谢活化，剂量水平由研究负责人在分析第一实验结果后限定。进行该第二实验以便确认或补充第一实验的结果，尤其是当获得相等的或阴性的结果时。

在水中制备根据实施例1的提取物的稀释液以进行细胞毒性测试

在浓度为5000、1600、500、160和50μg/板，具有和不具有S9-Mix的鼠伤寒沙门菌TA100菌株上进行细胞毒性测试。

根据以下说明制备用于制备S9-Mix的试剂：

[表33]

将细菌暴露于具有和不具有代谢活化体系的本发明的测试提取物中。使用的代谢系统是用辅因子(S9)改善的后线粒体组分。该组分S9是用酶诱导剂处理的Sprague Dawley大鼠肝脏匀浆的微粒体组分，是根据M_ARON,D.M.et al.,1983,Revised Methods for theSalmonella Mutagenicity Test,Mutation Research/Environmental Mutagenesis andRelated Subjects,113,p.173-215)制备的，并由MOLTOX TM提供。它储存在低于-70℃的温度下。微粒体组分S9以在S9-Mix中10％的浓度使用。施用的方案如下：

将以下引入3个溶血管中：

ο不具有代谢活化的测定：

-0.1mL的各种浓度的测试元素，

-0.5mL的无菌磷酸盐缓冲液，0.2M、pH 7.4,

-2mL的用于鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)的顶层琼脂，

-0.1mL的细菌接种物(TA100)。

ο具有代谢活化的测定：

-0.1mL的各种浓度的测试元素，

-2mL的用于鼠伤寒沙门菌(S.typhimurium)的顶层琼脂，

-0.1mL的细菌接种物(TA100)，

-0.5mL的S9-Mix。

·混合并倒入已经放置在培养皿中的底部琼脂表面。

·在37℃±2℃下温育48至72小时。

对于每个测试进行这些测定：初步细胞毒性测试、测试1和测试2。将未经处理的对照、在预温育方法期间产生的阴性对照和阳性对照在37℃±2℃下温育20至30分钟，之后倒入顶层琼脂。

施用的方案如下：

对于鼠伤寒沙门氏菌，将以下引入4个2mL的顶部琼脂的组分中：

ο0.1mL的磷酸盐缓冲液，0.2M、pH 7.4,

ο0.1mL的溶剂，

ο0.1mL的S9-Mix。

ο0.1mL的在最高浓度的测试元素制剂，

·使用2mL顶部琼脂的组分来控制鼠伤寒沙门氏菌的无菌度。

·混合并倒入已经放置在培养皿中的底部琼脂表面。

·在37℃±2℃下温育48至72小时。

测试分一式三份进行：

·可以未观察到细菌生长。

对至少5种浓度的测试提取物进行了没有代谢活化的测试和具有代谢活化的测试。

结果的表达和解释

许多准则可以用于确定结果是否为阳性，尤其是与测试项的剂量相关的回复体的数量增加，或在一种或多种浓度下，在具有或不具有代谢活化下，回复体数量的可再现增加。

-如果在验证步骤的最后，在具有和/或不具有代谢活化的5种菌株中的一种或多种上以可再现的方式获得剂量-作用关系，则将测试元素视为是致突变的。当回复体的数量对于菌株TA98、TA100和TA102至少等于自发回复率的两倍(R≥2)以及对于菌株TA1535和TA1537至少等于自发回复率的三倍(R≥3)时，才将给定浓度视为致突变性。

-如果在试验1和试验2结束时，在有和没有代谢活化下，并且前提是致突变作用已被证实与测试浓度的毒性有关，回复体的数量仍然小于已测试的菌株TA98、TA100和TA102的所有浓度的自发回复率的两倍(R<2)，并且小于菌株TA1535和TA1537的自发回复率的三倍(R<3)，认为测试元素是非致突变的。

初步研究未证明测试元素有任何细胞毒性；因此，该浓度范围用于遗传毒性试验1。

由于测试1获得的结果，决定对测试2使用相同的稀释范围。回复体的分析示出：

-没有观察到细胞毒性作用，

-在具有和不具有代谢活化下，没有测试提取物的浓度示出比率R对于TA98、TA100和TA102大于或等于自发回复率的至少两倍，或对于TA1535和TA1537，大于或等于自发回复率的三倍，

-无论测试体系或测试条件如何，均未观察到剂量反应。

鉴于在本研究期间获得的结果，根据实施例1的蛋白质水解产物可被认为既不具有致突变活性也不具有促致突变活性。

2.体外3T3 NRU光毒性测试

测试的原理是在存在和不存在非细胞毒性剂量的UVA下，根据实施例1的蛋白质水解产物对培养物中细胞的细胞毒性的比较。在具有或不具有UVA辐照下，在用参比元素和根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物处理后24h，通过活体染料：中性红，辅助确定细胞生存力来评价细胞毒性。使用的细胞是Balb/c 3T3克隆31系(ATCC–CCL163)的小鼠胚胎成纤维细胞。阳性对照为氯丙嗪溶液(CAS号：69-09-0)。阴性对照是测试和参比提取物的稀释液(缓冲盐+/-1％溶剂)。在存在或不存在UVA下，在8个浓度下，在至少四个培养孔/研究的浓度中测试阿拉伯辣木蛋白质水解产物。将成纤维细胞进行胰酶消化并且在两个96孔培养板中接种在完全培养基中的100μL的2×10⁵个细胞/mL(即2x10⁶个细胞/孔)的细胞悬浮液。

将温育的板在37℃，/5％CO₂下在烘箱中温育24小时。在温育结束时，检查细胞垫(cell mat)的半汇合。在将它们沉积在细胞上之前制备稀释液。测量最高浓度的pH；它包括在6.5和7.8之间。去除培养基；每个孔都已用在环境温度下保持的150μL的PBS仔细冲洗，然后用100μL的每种提取物稀释液或参比稀释液进行处理。将培养板在37℃和5％CO₂下在暗处温育1h±5分钟。辐照是在BIO SUN太阳辐照系统(Vilber Lourmat RMX3W)的帮助下进行的。BIO SUN是借助可编程微处理器控制UV辐照的系统。该系统持续监测UV光的发射。当递送的能量等于程序编入的能量时，辐照自动停止。使用校准的光谱辐射计在250至700纳米的波长范围内测量测试装置的光谱辐照度。

将2块板中的一块在环境温度下用其盖(cover)辐照，并且另一块板被保护免受UVA，并在辐照期间保持在环境温度。辐照后，抽取处理介质并冲洗细胞。接下来，小心添加100μL的完全培养基，并将板在37℃和5％CO₂下温育18至22h。第二天，通过使用相差显微镜观察来评价细胞生存力(生长、形态、单层完整性)。去除培养基，并且在用100μL的染色溶液处理之前，每个孔已经被冲洗并保持在环境温度。在相同条件下，将板放回培养箱3h。去除染色溶液并冲洗细胞，然后去除冲洗溶液，并向每个孔中添加150μL的解吸(desorption)溶液。摇动板，直到晶体完全溶解。在450nm处测量吸光度值。

测试验证：

在暴露于增加剂量的照射后通过评估细胞的生存力，在所有大约10代中监测细胞对UVA的敏感性。以测试中使用的密度培养细胞。第二天以2.5至9J/cm²的剂量对它们辐照，并且一天后借助于NRU测试确定细胞生存力。如果细胞在5J/cm²下的UVA辐照后生存力是或大于保持在黑暗中的参比的生存力的80％；则细胞符合品质准则；在最高剂量9J/cm²的UVA下，生存力必须至少为保持在黑暗中的参比的生存力的50％。

结果：

阴性对照具有的吸光度为0.4或更高。阳性对照氯丙嗪在存在UVA下具有的CI₅₀值为在0.1和2μg/ml之间，以及在不存在UVA下为在7和90μg/ml之间。这些结果使测试得以验证。不能估计在存在或不存在UVA下，提供50％细胞死亡的根据实施例1的阿拉伯辣木蛋白质水解产物的浓度。死亡率从未达到50％。不能估计在存在或不存在UVA下，产生50％细胞生存力的阿拉伯辣木蛋白质水解产物的浓度。生存力始终大于50％。

结论：在所采用的实验条件下，根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物可以被认为是无光毒的。

3.根据对于SIRC细胞系的中性红的浸出方法，通过体外细胞毒性研究评估眼部刺 激性可能性

这项体外研究基于通过借助中性红浸出技术确定细胞单层上导致50％细胞死亡(IC₅₀)的浓度来评价阿拉伯辣木蛋白质水解产物的细胞毒性。使用的细胞是SIRC，兔角膜成纤维细胞(ATCC–CCL60)，其不含支原体。

将阿拉伯辣木蛋白质水解产物用生理血清稀释至25％和50％。将成纤维细胞进行胰酶消化并且在两个24孔培养板中接种在完全培养基中的1mL的量的2×10⁵个细胞/mL的细胞悬浮液。将温育的板在37℃和5％CO₂下在烘箱中温育。在温育结束时，检查细胞垫的汇合。在完全培养基中以0.5mg/mL的浓度制备染色溶液。去除培养基；在每个孔中沉积1mL的染色溶液。将板放回在37℃和5％CO₂/下的培养箱中3h±15分钟。在该接触时间后，去除染色溶液，并用每孔1mL的完全培养基替换。在与提取物或参比接触之前，将板在环境温度下保持至少30分钟，以稳定体系。将每个孔用2mL的PBS冲洗，保持在环境温度下，并且然后将500μL的阿拉伯辣木蛋白质水解产物或参比的每种稀释液沉积与细胞垫接触。接触时间为60秒(阳性对照为30秒)。逐孔进行处理，在沉积阿拉伯辣木蛋白质水解产物或参比的那一刻开始计时。在整个处理期间手动摇动板。55秒(或阳性对照为25秒)后，抽取稀释液。在精确的60或30秒时，进行5次依次冲洗(5x2mL PBS，保持在环境温度下)。每次冲洗后抽取上清液，并且最后一次冲洗后，在等待显示阶段时，保持孔中没有介质。完成培养板的处理之后，在每个孔中沉积1mL的染色溶液。将板摇动约15分钟，直到获得均匀的染色。将每个培养孔获得的溶液取出并分入96孔板的2个孔中，即150μL/孔。

结果：

提供50％细胞死亡的阿拉伯辣木蛋白质水解产物的浓度评价为>50％。阿拉伯辣木蛋白质水解产物产物在50％下的细胞死亡百分比被评价为17％。

结论：在所采用的实验条件下，根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物可以被归类为：细胞毒性可忽略不计。

4.在皮肤病学控制下，在包扎疗法下单次施用48小时后评价根据本发明的阿拉伯 辣木蛋白质水解产物的皮肤相容性

此研究的目的是通过在手臂的前外表面进行48小时的表皮(epicutaneous)测试来评价阿拉伯辣木蛋白质水解产物的皮肤相容性程度；并且通常评价阿拉伯辣木蛋白质水解产物保持皮肤良好状态的能力。将来自18至65岁，不具有干性皮肤也不具有敏感皮肤并且处理区域没有任何皮肤病学病变的10名健康的女性或男性志愿者将纳入研究中。在去除敷料后初始施用30至40分钟后，48小时评价了阿拉伯辣木蛋白质水解产物的皮肤相容性，该阿拉伯辣木蛋白质水解产物以具有5％的根据实施例1的阿拉伯辣木蛋白质水解产物和95％丙二醇/山梨糖醇混合物的洗剂形式制备。根据以下等级对皮肤反应(红斑和水肿)给予0至3的得评分：

[表34]

将所有的皮肤反应(大疱、丘疹、水疱、干燥、脱屑、粗糙、肥皂效应等)根据以下等级评价并描述性报告：

-0：没有反应，

-0.5：非常轻度

-1：轻度

-2：中等

-3：严重。

研究结束时，使用以下公式计算平均刺激指数(M.I.I.)：

[数学式4]

M.I.I.＝皮肤反应的总和(E+Oe+大疱+丘疹+水疱)/分析的志愿者数

获得的M.I.I.使得测试的阿拉伯辣木蛋白质水解产物能够使用以下等级进行分类：

M.I.I.≤0.20 无刺激的

0.20<M.I.I.≤0.50 轻微刺激的

0.50<M.I.I.≤2 平均刺激的

2<M.I.I.≤3 高度刺激的

结果：阿拉伯辣木蛋白质水解产物的平均刺激指数(M.I.I.)等于：0.

结论：12名志愿者连续48小时施用之后，可以将阿拉伯辣木蛋白质水解产物视为无刺激的。

测试的一般结论：

对于根据实施例1的阿拉伯辣木蛋白质水解产物，上述进行的测试的结果是结论性的，并证明：

1)眼睛和皮肤刺激测试为阴性

2)光毒性测试为阴性

3)致突变性测试为阴性。

已经证明根据本发明的阿拉伯辣木蛋白质水解产物的安全性，并且它是理想的用于大规模皮肤病学使用，而不受目标群体的限制。

Claims (22)

1.一种从阿拉伯辣木种子饼中获得蛋白质水解产物的方法，其特征在于，其包括以下步骤，其中：

a)从成熟的阿拉伯辣木果实中收集未去壳的成熟种子并且进行干燥，以获得小于8％的内部含水率，

b)以使得将油与所述种子的剩余部分分离的方式，以使得获得包括按重量计小于6％的残油的饼的方式，压榨干燥的种子，

c)碾磨步骤b)中获得的所述饼，

d)将步骤c)中获得的碾磨饼分散在水相中，

e)在pH大于13和包括在16℃至25℃之间的温度下，对步骤d)中获得的水性分散体进行化学蛋白水解约2小时的时间，

f)中和所述蛋白水解以稳定获得的蛋白质水解产物，

g)通过固/液分离回收所述蛋白质水解产物，

h)通过截留阈值包括在100至25000Da之间进行的超滤和/或纳滤来纯化所述蛋白质水解产物，然后任选地，

i)冻干步骤h)中获得的所述蛋白质水解产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳滤以这样方式进行：分离所述蛋白质水解产物的3条带，包括分子量小于10000Da的带P1、分子量包括在10000和17000Da之间的带P2和分子量大约为23000Da的带P3。

3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其特征在于，所述纳滤步骤h)用包括在1500Da和5000Da之间的截留阈值，优选用包括在3000Da和4500Da之间的截留阈值进行。

4.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其特征在于，所述纳滤步骤h)用包括在10000Da和17000Da之间的截留阈值进行。

5.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其特征在于，所述纳滤步骤h)用包括在17000Da和25000Da之间的截留阈值进行。

6.一种蛋白质水解产物，来自通过根据权利要求1至5中任一项所述的方法获得的从成熟的阿拉伯辣木果实中收获并且未去壳的种子饼。

7.一种蛋白质水解产物，来自从成熟的阿拉伯辣木果实中收获并且未去壳的种子饼，其特征在于，其包括分子量包含在1500Da和5000Da之间的氨基酸衍生物、氨基酸、肽和糖肽的主要部分P1，分子量包括在10000和17000Da之间的大约20％的部分P2，分子量大约为23000Da的大约20％的部分P3，其中它是通过在大于13的pH在包括在16℃

和25℃之间的温度下化学蛋白水解大约2小时的时间获得，并且其中它是液体并且具有大于1并且优选约1.1的密度。

8.根据权利要求7所述的蛋白质水解产物，其特征在于，其包括0.3％和3％之间的挥发性化合物，其中50％的这些化合物，即0.15％和1.5％之间的所述提取物，由轻腈化合物构成，主要是异丁腈和甲基丁腈；其中5％至10％的这些化合物，即0.015％和0.3％之间的所述提取物，由异硫氰酸酯衍生物构成，主要是异硫氰酸异丙酯和异硫氰酸异丁酯；其中1％至5％的这些化合物，即0.003％和0.15％之间，由精油构成，主要是桉树脑、薄荷醇和苯甲醛。

9.根据权利要求7和8中任一项所述的蛋白质水解产物，其特征在于，其包括在10％和15％之间、优选约12.5％的干物质内容物，所述干物质内容物包括在1％和6％之间的含氮化合物，尤其是比例为0.5％至1.5％、优选约0.8％的挥发性腈衍生物，以及20mg/升的多酚。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的蛋白质水解产物，其特征在于，其包括分子量包括在1500Da和5000Da之间的主要部分P1。

11.根据权利要求7和9中任一项所述的蛋白质水解产物，其特征在于，其包括分子量包括在10000Da和17000Da之间的大约20％的部分P2。

12.根据权利要求7至9中任一项所述的蛋白质水解产物，其特征在于，其包括分子量是大约23000Da的大约20％的部分P3。

13.根据权利要求7至9中任一项所述的蛋白质水解产物，其特征在于，其包括分子量包括在1500Da和5000Da之间的部分P1以及分子量包括在10000和17000Da之间的部分P2。

14.一种根据权利要求6或7所述的来自阿拉伯辣木种子饼的蛋白质水解产物，用于其用作药物的应用。

15.一种药物组合物或皮肤病学组合物，其特征在于，其包括作为活性剂的有效量的根据权利要求6或7中任一项所述的来自阿拉伯辣木种子饼的蛋白质水解产物，以及生理学上可接受的赋形剂。

16.根据权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，其被配制用于摄取。

17.根据权利要求15所述的皮肤病学组合物，其特征在于，其被配制用于局部施用于皮肤或粘膜。

18.根据权利要求15至17中所述的组合物，其特征在于，所述阿拉伯辣木种子饼的蛋白质水解产物以相对于所述组合物的总重量，按重量计以0.0001％至40％的浓度存在于所述组合物中。

19.根据权利要求15至18中任一项所述的组合物，用于其用作治疗纤维化疾病和治疗炎症的药物的用途，其特征在于，其包括作为活性剂的有效量的根据权利要求10或11，优选根据权利要求10所述的蛋白质水解产物。

20.根据权利要求15至18中任一项所述的组合物，用于其用作治疗癌症的药物的用途，其特征在于，其包括作为活性剂的有效量的根据权利要求12所述的蛋白质水解产物。

21.根据权利要求15至18中任一项所述的组合物，用于其用作治疗细菌或病毒类型的感染性疾病，并且特别是为了抑制刺突COV2蛋白的药物的用途，其特征在于，其包括作为活性剂的有效量的根据权利要求6或7所述的蛋白质水解产物。

22.根据权利要求15至18中任一项所述的组合物，用于其用作治疗遗传漂变和治疗与皮肤色素沉着相关的病理的药物的用途，其特征在于，它包括作为活性剂的有效量的根据权利要求13所述的蛋白质水解产物。

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