CN111484545A - 一种米酒糟来源的降血压寡肽及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于米酒槽资源化利用和降血压技术领域，具体涉及一种米酒糟来源的降血压寡肽及其制备方法与应用，为促进米酒槽的综合利用，从中开发的具有降血压功效的寡肽，本发明以米酒糟为原料，分离纯化得到一种降血压寡肽，该寡肽具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，分子量为719.857Da，纯度高，活性好，能人工合成，安全无毒，经ACE抑制活性的测定发现，该寡肽在体外对血管紧张素转化酶具有显著的抑制作用，可以应用于降血压领域，且有利于米酒废料的资源化利用。

Description

一种米酒糟来源的降血压寡肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于米酒槽资源化利用和降血压技术领域，具体涉及一种米酒糟来源的降血压寡肽及其制备方法与应用。

背景技术

高血压是心血管疾病的主要危险因素，饮食和生活方式是预防高血压的重要途径。尽管各种降血压的机制存在差异，但其中肾素-血管紧张素系统(Rein-AngiotensinSystem，RAS)在控制血压方面起着关键性作用，RAS功能失调可引起高血压。

人工合成的ACE抑制剂，例如卡托普利和依那普利，是肾素血管紧张素系统的第一类抗高血压药物。它能阻止无活性血管紧张素I转化为有活性的血管紧张素II，从而阻断肾素-血管紧张素系统的作用。但它们也抑制包括缓激肽在内的血管扩张剂激肽类的代谢降解，导致特定的副作用，例如过敏反应，血钾水平升高，味觉障碍和皮疹等。与大多数血管扩张剂不同，血管紧张素转化酶抑制剂(Angiotensin-converting enzyme inhibitors，ACEI)降低血压而不引起心率增加。卡托普利(captopril)是第一个口服有效的非肽类ACEI。因此，抑制药ACE抑制剂在降血压方面具有不容忽视的作用。

在我国，稻米资源深度开发与综合利用仍处起步阶段，我国每吨大米糖化后，大概有半吨的残渣没有得到有效利用，研究水平落后于发达国家，致使它们的经济价值未得到充分体现。因此开发大米蛋白和大米肽具有十分广阔的应用前景和空间。

米酒糟作为米酒工业中的主要副产物，鲜米酒糟其蛋白质含量为28.1％(干计)，是一种良好的蛋白质资源。目前仅广东顺德酒厂每年产生的米酒糟就有至少8万吨，估计全省每年产米酒糟40万吨以上。

但除少数厂家将其烘干作饲料外，大部分厂家以低价直接出售给邻近的农户作饲料，还有些厂家以废弃物直接排放，既浪费资源又污染环境。作为大米发酵后的产物，米酒糟中含有大量可利用的寡肽及蛋白，因此，米酒槽的综合利用是亟待开发的领域，可大大提高米酒糟的利用价值，减少环境污染。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种米酒糟来源的降血压寡肽。

本发明的第二个目的是提供上述寡肽的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述寡肽的应用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

一种米酒糟来源的寡肽，所述寡肽具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

本发明以米酒糟为原料，经过过滤、离心除杂后，以血管紧张素转化酶抑制活性为导向，通过多次反向液相色谱分离纯化得到一种寡肽，经氨基酸序列测定发现，该寡肽具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，分子量为719.857Da，经血管紧张素转化酶(Angiotensin-converting enzyme，ACE)抑制活性的测定发现，该寡肽对ACE具有显著的抑制作用，对米酒废料的再利用及降血压肽的应用有一定参考价值。

优选的，所述寡肽对血管紧张素转化酶具有抑制作用。经ACE抑制活性的测定发现，分离纯化得到的寡肽单体的IC₅₀为370.00±11.55μg/mL，对血管紧张素转化酶具有显著的抑制作用。同时说明所述寡肽具有降血压的功效。

本发明还提供了一种米酒糟来源的寡肽的制备方法，即以米酒糟为原料，通过分离纯化得到，具体为：将米酒糟经过过滤、离心除杂后，以提高血管紧张素转化酶的抑制活性为目标，通过多次分离纯化得到，所述多次分离纯化依次包括C18制备柱一次分离、C18亲水制备柱二次分离和反相高效液相色谱分离纯化。

本发明还提供了上述寡肽在制备血管紧张素转化酶抑制剂中的应用。

本发明还提供了上述寡肽在制备降血压药物中的应用。

本发明还提供了一种血管紧张素转化酶抑制剂，包括上述的寡肽，当然，为提高制剂的适用范围，还可以包括其他可应用于降压领域的辅料，该制剂可制备成颗粒剂、胶囊剂和片剂等形式。

本发明还提供了一种降血压药物，包括上述的寡肽。当然，为提高药物的适用范围，还可以包括其他可应用于降压领域的辅料，该药物可制备成颗粒剂、胶囊剂和片剂等形式。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明以米酒糟为原料，分离纯化得到一种降血压寡肽，该寡肽具有如SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列，分子量为719.857Da，纯度高，活性好，能人工合成，安全无毒，经ACE抑制活性的测定发现，该寡肽对ACE具有显著的抑制作用，可以应用于降血压领域，且有利于米酒废料的资源化利用。

附图说明

图1为C18制备柱一次分离分段接样图(D1-5)；

图2为C18制备柱一次分离样品(D1-5)对ACE的抑制活性；

图3为C18亲水制备柱二次分离分段接样图(S1-6)；

图4为C18亲水制备柱二次分离样品(S1-6)对ACE的抑制活性；

图5为RP-HCLP分离分段接样图(H1-H6)；

图6为RP-HCLP分离样品(H1-H6)对ACE的抑制活性；

图7为组分H5的二级质谱图；

图8为组分H5的PPSQ测序图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1降血压肽的分离

(1)材料与试剂

材料：顺德红荔酒厂米酒发酵剩余基料(米酒糟)。

试剂：具体见表1。

表1试剂表

(2)ACE抑制活性的测定方法

2.1反应液的制备

分别向样品管(B)和空白管(A)加入10μLACE溶液(0.25U/mL，ACE酶溶于pH7的磷酸钾缓冲液中)，样品管加入10μL ACEI，空白管10μL缓冲液，37℃温育5min后加入30μL HHL溶液(6.5mmol/mL，HHL溶于pH8.3的0.1mol·L-1硼酸缓冲液，含0.3mol·L-1NaCl)，在37℃条件下反应1h后，后加入80μL 1.0mol/L HCl中止反应，得到反应液，如表2。

表2反应液的制备

2.2色谱条件

色谱柱：ECOSIL C18(260mm×4.6mm，5μm)。

流动相与色谱条件：乙腈：超纯水＝25：75(含0.1％(v/v)TFA)，流速：1mL/min；检测波长：228nm；柱温：30℃；进样量：20μL。

2.3结果计算

原理：HHL在ACE的催化下快速地分解产生马尿酸(Hip)和二肽(His-Leu，HL)，马尿酸在228nm处有最大吸收。当加入ACEI样品时，ACE酶的活性受到抑制，马尿酸生成量减少，所以可通过高效液相色谱测定马尿酸的生成量来评估ACEI对ACE活性的抑制率。

计算公式为：

式中：R：ACEI样品对ACE的抑制率(％)；

A：对照组中马尿酸的峰面积；

B：添加ACEI组中马尿酸的峰面积；

A0：空白管中马尿酸的峰面积。

其中，IC₅₀的定义为在一定条件下抑制ACE酶活性一半时所需要的抑制剂浓度。由于抑制率与制剂浓度之间不是一个线性的关系，因此必须首先绘制抑制剂浓度与抑制率关系的曲线，再从曲线上查出IC₅₀。

(3)米酒糟原料的预处理

将米酒糟用400目滤布过滤，弃去滤渣，滤液以55℃旋蒸浓缩，然后4000rpm/min离心15min，保留上清液，将上清液以-80℃冷冻干燥72h，得寡肽原料。

(4)C18制备柱一次分离

先将寡肽原料配制成100mg/mL的溶液，然后过0.45μm滤膜，用Shimadzu PRC-ODS(K)柱(30mm×250mm,15μm,Shimadzu)色谱柱进行分离制备，制备条件为：流动相A为一级水(含0.1％TFA)，流动相B为乙腈(含0.1％TFA)，流速为10mL/min，进样量为5mL，于245nm和280nm处监测，洗脱程序如表3所示。

表3一次分离洗脱程序

保留时间(min)	流动相B的浓度(％)
		0-30	10-34
30-45	34-90
		45-60	90

根据图1的分离检测图谱可以看出，在寡肽常用检测波长214nm下，样品大约有8个峰，根据出峰时间及峰形相似度，一共分为D1、D2、D3、D4和D5，共5段接样，分别收集这5个组分，然后即刻进行浓缩及真空冻干，减少寡肽降解，随后测量5个组分对ACE酶的抑制活性。根据图2的抑制率测定结果可知，样品浓度为1mg/mL时，D3组分的抑制率最高，达79.43％，选择其进行下一步的分离和分析。

(5)C18亲水制备柱二次分离

将上一步中对ACE抑制活性最高的组分D3配制成30mg/mL的溶液，过0.45μm滤膜，采用C18亲水制备柱对其进行再分离制备，色谱柱型号为ECOSIL C18钢柱(300mm×20mm,10μm,Germany)，制备条件为：流动相A为一级水(含0.1％TFA)，流动相B为乙腈(含0.1％TFA)，流速为10mL/min，进样量为4mL，于245nm和280nm处监测，洗脱程序如表4所示。

表4二次分离洗脱程序

时间(min)	流动相B的浓度(％)
		0-5	15-19
5-45	19-23
		45-47	23-90
47-57	90

根据图3的分离检测图谱可以看出，按照出峰情况及分离度，一共分为S1、S2、S3、S4、S5和S6，共6段接样，分别收集这6个组分，浓缩冻干后测量各组分对ACE酶的抑制活性。根据图4的抑制率测定结果可知，经过进一步分离，当样品浓度为1mg/mL时，S2组分的抑制率最高，高达93.68％。为了明确其中起主要作用的高活性肽段，对S2组分进行下一步的分离和分析。

(6)反相高效液相色谱(RP-HCLP)的分离纯化

将上一步中对ACE抑制活性最高的组分S2配制成20mg/mL的溶液，过0.45μm滤膜，利用RP-HCLP进行再分离制备，色谱柱型号为ECOSIL C18(260mm×4.6mm，5μm)，分析条件为：流动相A为一级水(含0.1％TFA)，流动相B为色谱级乙腈(含0.1％TFA)，流速为1mL/min，进样量为20μL，于245nm和280nm处监测，洗脱程序为表5。

表5分析色谱柱洗脱程序

保留时间(min)	流动相B的浓度(％)
		0-10	5-15
10-45	15-20
		45-60	90

经过两次分离纯化后的样品纯度依旧有待提升，调整分离程序后，选取其中分离度好，响应值高的色谱峰富集，根据图5所示的HPLC图谱可以看出，根据出峰情况，一共分为H1、H2、H3、H4、H5和H6，共6个峰接样，收集这6个样品，经旋蒸浓缩和冷冻干燥后测定各组分对ACE的抑制率。根据图6的抑制率测定结果可知，组分H5、H6(1mg/mL)的ACE抑制率分别达到89.27％和91.72％，显著高于其它4个组分(p<0.05)。故对H5、H6两个寡肽进行详尽的后续研究。

(7)降血压寡肽结构的确定

为了研究H5降血压肽的组成，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MOLDI-TOF-MS/MS)鉴定上述两个纯化肽的分子量，由荷质比减去附着的质子的质量单位，得出寡肽H5的相对分子质量为719.857Da。但由于亮氨酸和异亮氨酸分子量相同，仅从质谱图中难以分辨，故再运用氨基酸测序仪(PPSQ)测定肽的氨基酸组成，PPSQ可测出寡肽的N端绝对序列。根据二级质谱图(图7)和氨基酸测序仪分析图(图8)，最终确定寡肽H5的序列为Leu-Ile-Ile-Pro-Gln-His(LIIPQH)。这是首次从食物源天然产物中分离出LIIPQH(降血压寡肽H5)，且寡肽皆具有高ACE抑制活性。

实验例2降血压寡肽的人工合成以及ACE的抑制活性评价

为对降血压寡肽H5进行反向验证，并详细表征其在体外对ACE的抑制作用，由上海杰肽生物科技有限公司合成高纯度的降血压寡肽H5(纯度>98％)，并以各阶段分离所得的寡肽的活性进行对比，按照ACE抑制活性的测定方法进行ACE的抑制活性评价试验，试验所得IC₅₀值如表6所示。

根据表6的结果可以看出，本发明分离得到的降血压寡肽H5具有较好的ACE抑制活性，且通过人工合成的手段反向验证这种寡肽确实具有降血压的功效。但人工合成寡肽的IC₅₀值比分离的要高，这与寡肽的纯度有较大关系。另外每步分离后寡肽的IC₅₀值都会显著下降，说明分离效果明显。此多肽有望应用于降血压领域，为今后天然产物降压肽的应用奠定基础。

表6合成寡肽及各分离阶段寡肽的IC₅₀值

试验样品	IC<sub>50</sub>(μg/mL)
		处理后的寡肽原料	806.67±58.97
一次分离寡肽D3	643.33±17.64
		二次分离寡肽S2	479.00±59.36
RP-HCLP分离单体H5	370.00±11.55
		人工合成单体H5	82.00±19.92

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种米酒糟来源的降血压寡肽及其制备方法与应用

<141> 2020-03-31

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

Leu Ile Ile Pro Gln His

1 5

Claims (10)

1.一种米酒糟来源的寡肽，其特征在于，所述寡肽具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种米酒糟来源的寡肽，其特征在于，所述寡肽对血管紧张素转化酶具有抑制作用。

3.根据权利要求1所述的一种米酒糟来源的寡肽，其特征在于，所述寡肽具有降血压的功效。

4.权利要求1-3任一项所述的一种米酒糟来源的寡肽的制备方法，其特征在于，以米酒糟为原料，通过分离纯化得到。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将米酒糟经过过滤、离心除杂后，以提高血管紧张素转化酶的抑制活性为目标，通过多次分离纯化得到。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述多次分离纯化依次包括C18制备柱一次分离、C18亲水制备柱二次分离和反相高效液相色谱分离纯化。

7.权利要求1-3任一项所述的一种米酒糟来源的寡肽在制备血管紧张素转化酶抑制剂中的应用。

8.权利要求1-3任一项所述的一种米酒糟来源的寡肽在制备降血压药物中的应用。

9.一种血管紧张素转化酶抑制剂，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的寡肽。

10.一种降血压药物，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的寡肽。

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