CN102311484A - 一种抑制血管紧张素转移酶的六肽及其制备方法 - Google Patents

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胡松青
倪贺
李琳
张喜梅
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Abstract

本发明公开了一种抑制血管紧张素转移酶的六肽及其制备方法。该六肽的氨基酸残基序列为：苏氨酸-脯氨酸-苏氨酸-谷氨酰胺-谷氨酰胺-丝氨酸。该六肽的两种制备方法为：（1）酵母来源酶解分离制备法：以干酵母粉为原料，通过酶解、分离后，获得分子量小于10kDa的酵母多肽组分，进一步应用分子排阻柱层析和阴离子交换柱层析分离纯化获得该ACE抑制六肽；（2）固相合成法：以Wang树脂为固相载体，芴甲氧羰酰基（Fmoc-）为氨基保护基，羟基苯并三唑（HOBT）为缩合剂进行接肽反应，固相合成该ACE抑制六肽。本发明制备条件温和；经体外活性实验证实，本发明所得六肽具有对ACE的抑制作用。

Description

一种抑制血管紧张素转移酶的六肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物制品领域，具体涉及一种血管紧张素转移酶（ACE）抑制六肽及其制备方法。
背景技术
随着科学技术的发展和生活水平的提高，健康已经成为二十一世纪人类追求的最终目标。高血压已成为危害人类健康的常见病之一，我国高血压患者已近2亿，高血压引起的脑血管病和心脏病发病率呈上升趋势，估计全国每年新发生脑卒中200万人，其中2/3致死或致残。因此，开发有效控制血压的生物制品具有重要的经济和社会效益。
ACE作为人体内血压调节的关键酶，在肾素-血管紧张素系统和激肽-激肽释放酶系统中均起着重要的作用，因此，通过抑制ACE的活性能够有效地降低血压。目前临床常用的ACE抑制剂主要为人工设计的化学合成类药物，虽然能够有效地控制血压，但是也暴露了一些副作用。本发明提供了一种天然产物（酵母）来源的、能有效抑制ACE活性的六肽，有望在降血压的同时克服化学药的副作用。
发明内容
本发明的目的在于公开一种ACE抑制六肽，并提供该六肽的酵母来源酶解分离纯化和固相合成两种制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种抑制血管紧张素转移酶的六肽，该六肽的氨基酸序列为苏氨酸-脯氨酸-苏氨酸-谷氨酰胺-谷氨酰胺-丝氨酸（Thr-Pro-Thr-Gln-Gln-Ser），半抑制浓度为52.35~73.25 μg/mL。
所述的六肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）将干酵母粉和水按固液比1: 5~1: 15 w/v混合后加入酶进行酶解，所述酶为内切酶、外切酶及风味酶的混合物，三种酶所占比例依次为10~30%wt、10~30%wt和40~80%wt，酶解温度为20~45℃，酶解时间为2~4h；步骤（1）得到的酶解液在90~110℃灭酶后，过滤或离心分离得到液相组分；再除去液相组分中的多糖及核酸类杂质；然后通过超滤膜分离，滤过液经减压浓缩和真空冷冻干燥后获得分子量小于10kDa的多肽组分；
（2）多肽组分用分子排阻层析柱分离，以pH 7.0~8.0的磷酸缓冲液为流动相，洗脱流速为0.3~1.0mL/min；
（3）收集分子排阻层析柱流出的目标组分，进一步采用阴离子交换柱分离，用0~2mol/L、pH 7.0~8.5的NaCl溶液梯度洗脱，收集目标组分后冷冻干燥，获得六肽。
所述酶的加入量为干酵母粉质量的0.5%~2.5%。
步骤（2）所述除去过滤或离心所得液相组分中的多糖及核酸类杂质是采用乙醇沉淀法，乙醇的加入量为液相组分的体积的2~6倍。
所述超滤膜分离选用截留分子量为5kDa~10kDa的超滤膜。
所述分子排阻层析柱流出的目标组分为对ACE的半抑制浓度最小的多肽组分；收集流出的不同组分后，分别检测其对ACE的抑制效果，得到对ACE的半抑制浓度最小的多肽，阴离子交换柱流出的所述目标组分为对ACE的半抑制浓度最小的多肽，收集流出的不同组分后，分别检测其对ACE的抑制效果，得到对ACE的半抑制浓度最小的组分。
所述的六肽的制备方法：按照固相合成法在羧基树脂上依次连接以芴甲氧羰酰基为保护基团的氨基酸，缩合剂为羟基苯并三唑；反应温度20~40℃，单个氨基酸的接肽反应时间为0.5~2h，脱保护剂为含哌啶的DMF，脱保护时间为0.5h，获得六肽化合物粗品，再经C18柱分离纯化，冷冻干燥，制得六肽；
所述以芴甲氧羰酰基为保护基团的氨基酸为Fmoc-Ser、Fmoc-Gln、Fmoc-Gln、Fmoc-Thr、Fmoc-Pro和Fmoc-Thr；
所述羧基树脂为Wang树脂。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
（1）本发明公布的ACE抑制六肽氨基酸序列来源于天然产物（酵母）中，克服了化学药的副作用；
（2）本发明制备条件温和；
（3）经体外活性实验证实，本发明所得六肽具有对ACE的抑制作用。本发明六肽对ACE的半抑制浓度为73.25 μg/mL。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
（1）酵母蛋白的提取和酶解：将干酵母粉和水按固液比1: 10 (w/V) 混合，选用含糜蛋白酶20%、亮氨酸氨肽酶20%及风味蛋白酶60%的混合酶酶解。加酶量为干酵母粉的0.5%（w/w），酶解温度为35℃，酶解时间为3h。
（2）酶解液的分离与除杂：酶解液在100℃下灭酶后离心，取液相组分加入4倍（V/V）的乙醇，去除其中的多糖和核酸类杂质。
（3）活性多肽的超滤膜分离：利用截留分子量为10kDa的超滤膜过滤分离，滤过液减压浓缩及真空冷冻干燥后得到活性多肽。
（4）多肽组分用分离范围为100~7000Da的分子排阻层析柱分离，以pH7.0的磷酸缓冲液为流动相，洗脱流速为1.0mL/min；
（5）收集分子排阻层析柱流出的目标组分，进一步采用阴离子交换柱分离，用0~2mol/L、pH 8.5的NaCl溶液梯度洗脱，收集目标组分后冷冻干燥，获得六肽。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）及氨基酸N端测序鉴定该六肽的结构。结果证实，该六肽的氨基酸组成为：Thr-Pro-Thr-Gln-Gln-Ser。
利用HPLC检测该六肽对ACE的半抑制浓度为73.25 μg/mL。
实施例2
（1）酵母蛋白的提取和酶解：将干酵母粉和水按固液比1: 10 (w/V) 混合，选用含糜蛋白酶20%、亮氨酸氨肽酶20%及风味蛋白酶60%的混合酶酶解。加酶量为干酵母粉的0.5%（w/w），酶解温度为35℃，酶解时间为3h。
（2）酶解液的分离与除杂：酶解液在100℃下灭酶后离心，取液相组分加入4倍（V/V）的乙醇，去除其中的多糖和核酸类杂质。
（3）活性多肽的超滤膜分离：利用截留分子量为10kDa的超滤膜过滤分离，滤过液减压浓缩及真空冷冻干燥后得到活性多肽。
（4）多肽组分用分离范围为100~7000Da的分子排阻层析柱分离，以pH8.0的磷酸缓冲液为流动相，洗脱流速为0.3mL/min；
（5）收集分子排阻层析柱流出的目标组分，进一步采用阴离子交换柱分离，用0~2mol/L、pH 7.0的NaCl溶液梯度洗脱，收集目标组分后冷冻干燥，获得六肽。
通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）及氨基酸N端测序鉴定该六肽的结构。结果证实，该六肽的氨基酸组成为：Thr-Pro-Thr-Gln-Gln-Ser。
利用HPLC检测该六肽对ACE的半抑制浓度为73.25 μg/mL。
实施例3
以Wang树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接以芴甲氧羰酰基（Fmoc-）为保护基团Fmoc-Ser, Fmoc-Gln, Fmoc-Gln, Fmoc-Thr, Fmoc-Pro, Fmoc-Thr，反应温度20℃，反应时间为2h，获得六肽树脂，期间依次采用含20%((哌啶与 DMF体积比))哌啶的DMF的脱保护剂，羟基苯并三唑（HOBT）为缩合剂进行接肽反应，单个氨基酸接肽反应时间为0.5h，脱保护时间为0.5h，获得六肽化合物粗品，再经C18柱分离纯化，冷冻干燥，制得该ACE抑制六肽。
利用HPLC检测该六肽对ACE的半抑制浓度为52.35 μg/mL。
实施例4
以Wang树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接以芴甲氧羰酰基（Fmoc-）为保护基团Fmoc-Ser, Fmoc-Gln, Fmoc-Gln, Fmoc-Thr, Fmoc-Pro, Fmoc-Thr，反应温度30℃，反应时间为6h，获得六肽树脂，期间依次采用含20%(哌啶与 DMF体积比)哌啶的DMF的脱保护剂，羟基苯并三唑（HOBT）为缩合剂进行接肽反应，单个氨基酸接肽反应时间为2h，脱保护时间为0.5h，获得六肽化合物粗品，再经C18柱分离纯化，冷冻干燥，制得该ACE抑制六肽。
利用HPLC检测该六肽对ACE的半抑制浓度为52.35 μg/mL。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  华南理工大学
 
<120>  一种抑制血管紧张素转移酶的六肽及其制备方法
 
<130> 
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.5
 
<210>  1
<211>  6
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<400>  1
 
Thr Pro Thr Gln Gln Ser
1               5      
 
 
 

Claims (8)

1.一种抑制血管紧张素转移酶的六肽，其特征在于：该六肽的氨基酸序列为苏氨酸-脯氨酸-苏氨酸-谷氨酰胺-谷氨酰胺-丝氨酸。
2.权利要求1所述的六肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将干酵母粉和水按固液比1: 5~1: 15 w/v混合后加入酶进行酶解，所述酶为内切酶、外切酶及风味酶的混合物，三种酶所占比例依次为10~30%wt、10~30%wt和40~80%wt，酶解温度为20~45℃，酶解时间为2~4h；步骤（1）得到的酶解液在90~110℃灭酶后，过滤或离心分离得到液相组分；再除去液相组分中的多糖及核酸类杂质；然后通过超滤膜分离，滤过液经减压浓缩和真空冷冻干燥后获得分子量小于10kDa的多肽组分；
（2）多肽组分用分子排阻层析柱分离，以pH 7.0~8.0的磷酸缓冲液为流动相，洗脱流速为0.3~1.0mL/min；
（3）收集分子排阻层析柱流出的目标组分，进一步采用阴离子交换柱分离，用0~2mol/L、pH 7.0~8.5的NaCl溶液梯度洗脱分离，收集目标组分后冷冻干燥，获得六肽。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酶的加入量为干酵母粉质量的0.5%~2.5%。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述除去过滤或离心所得液相组分中的多糖及核酸类杂质是采用乙醇沉淀法，乙醇的加入量为液相组分的体积的2~6倍。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述超滤膜分离选用截留分子量为5kDa~10kDa的超滤膜。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述分子排阻层析柱流出的目标组分为对ACE的半抑制浓度最小的多肽组分；阴离子交换柱流出的所述目标组分为对ACE的半抑制浓度最小的多肽。
7.权利要求1所述的六肽的制备方法，其特征在于，按照固相合成法在羧基树脂上依次连接以芴甲氧羰酰基为保护基团的氨基酸，缩合剂为羟基苯并三唑；反应温度20~40℃，单个氨基酸的接肽反应时间为0.5~2h，脱保护剂为含哌啶的N,N-二甲基甲酰胺，脱保护时间为0.5h，获得六肽化合物粗品，再经C18柱分离纯化，冷冻干燥，制得六肽；
所述以芴甲氧羰酰基为保护基团的氨基酸为Fmoc-Ser、Fmoc-Gln、Fmoc-Gln、Fmoc-Thr、Fmoc-Pro和Fmoc-Thr。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述羧基树脂为Wang树脂。
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