CN112851754B - 一种萃取-反萃取分离纯化surfactin方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物化工技术领域，尤其是一种萃取‑反萃取分离纯化surfactin方法，利用surfactin发酵液的酸沉物，加入醇溶液振荡或超声10min后，过滤，得醇过滤液；醇过滤液与正己烷、乙酸乙酯、水构建萃取体系a，调pH为1.5‑4萃取，分层，取上层有机相；另将正己烷、乙酸乙酯、水和醇混合构建萃取体系b，静置分层，取下层，获得萃取体系b下层水相；将上层有机相与萃取体系b下层水相按体积比1:1混合，调节pH为7‑8，振荡，静置分层，取下层水相冷冻干燥后，即得surfactin纯化物，充分利用了surfactin酸性条件下不溶于水，但易溶于复配有机溶剂，且中性条件下易溶于水，但不溶于复配有机溶剂的特性，使得纯化物中，surfactin含量≥65％。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，尤其是一种萃取-反萃取分离纯化surfactin方法。
背景技术
Surfactin是由7个氨基酸残基组成的环肽和13-15个碳原子链长的β-羟基脂肪酸酯化而成，于1968年被Arima等首次从枯草芽孢杆菌中分离出来。经研究表面：Surfactin在抗菌、抗病毒、抗癌、溶血栓等方面表面出极好的生物活性，在化妆品、医药、食品、乳化剂、保湿剂、精细化工等行业具有广泛的应用前景。可是，目前市场上Surfactin的商品价格昂贵，Surfactin标准品的价格超过200元/mg，究其原因，主要体现在：①现有Surfactin生产主要依靠生物发酵，发酵生产的产量极低，致使生物发酵产物中的Surfactin含量低，维持在mg-g/L的水准；②Surfactin为小分子脂肽化合物，与培养基的杂质成分类似，分离纯化困难。
经查阅相关研究文献，发现有许多集中在环脂抗菌肽分离提纯的研究，但是未注重对分离物中Surfactin的含量提升，以便于后续进一步精制研究，例如：刘佳欣等.枯草芽孢杆菌HS-A38产抗菌脂肽Bacillomycin D的组分分析与鉴定[J].工业微生物，2017年04月，第47卷第2期，公开了将HS-A38发酵液离心分离上清液，酸沉淀、醇抽提、甲醇溶液减压旋蒸，获得固态粗提物，得出粗提物棕黄色粉末，产率1.956g/L，然而，该研究并未公开最终提取物surfactin的含量。再例如：林青荣.枯草芽孢杆菌脂肽类物质的分离纯化鉴定与应用研究[D].山西大学，2012：12-15，公开了将发酵液在8000r/min条件下离心20min除去菌体，得到上清液，再从上清液中提取脂肽类物质：①甲醇直接抽提，静置12h；②乙醇直接抽提，静置12h(同甲醇，)；③6mol/L盐酸调pH沉淀，离心收集沉淀，除去水分，加入甲醇萃取，搅拌，滤去沉淀，得甲醇提取液；④6mol/L盐酸调pH沉淀，离心收集沉淀，除去水分，加入乙醇抽提沉淀。再将①、②、③、④处理中所得的溶液加入适量蒸馏水，调整pH至7.0,50℃旋转蒸发除去有机溶剂，得到黄色粉末样品，采用正己烷洗涤三次，除去游离脂肪酸，得样品；得出：第③组提取脂肽获得量达到最优，利用标样，HPLC测定脂肽提取的平均回收率为91.65％，该研究也未公开提取物中surfactin的含量。
除上述缺陷之外，现有研究中的分离提纯手段，主要采用的是：酸沉淀、吸附分离、膜过滤、絮凝、色谱分离等，但这些分离纯化方法存在着诸多问题：①所得产品中Surfactin含量不高，例如酸沉淀；②所得产品的成本高昂，工艺要求高，例如：膜过滤、超滤等；③仅适用于试验室小批量生产，不适合大规模工业化操作，例如色谱分离；④带来新的杂质，影响后续精制工艺，例如絮凝，带入絮凝剂杂质等。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种萃取-反萃取分离纯化surfactin方法，利用surfactin酸性条件下不溶于水，但易溶于复配有机溶剂，且中性条件下易溶于水，但不溶于复配有机溶剂的特性，实现萃取-反萃取工艺分离纯化surfactin，此发明适宜工业化纯化surfactin，为后面进一步精制surfactin提供条件，步骤简单，耗能低，设备要求低，且降低废液排放量，不消耗大量酸碱，可实现有机溶剂循环利用，降低surfactin产品分离纯化成本。
具体是通过以下技术方案得以实现的：
本发明创造的目的之一在于提供萃取-反萃取分离纯化surfactin方法，包括以下步骤：
(1)将含surfactin发酵液离心除菌，得到上清液；向上清液中加入酸，固液分离收集沉淀，得酸沉物；
(2)向酸沉物中加入甲醇或乙醇，振荡或超声10min，过滤，得醇过滤液；
(3)将醇过滤液与正己烷、乙酸乙酯、水混合构建萃取体系a，调节萃取体系a的pH为1.5-4，振荡，静置分层，取上层有机相；
(4)将正己烷、乙酸乙酯、水和醇混合构建萃取体系b，静置分层，取下层，获得萃取体系b下层水相；
(5)将步骤(3)中的上层有机相与步骤(4)中的萃取体系b下层水相按体积比1:1混合，调节pH为7-8，振荡，静置分层，取下层水相；冷冻干燥，即得含量≥65％的surfactin纯化物。
优选，所述的萃取体系a和所述萃取体系b均是以正己烷、乙酸乙酯、醇和水按照体积比为1:1:1:1或6:1:6:1或1:2:1:1混合而成。更优选，所述的萃取体系a和所述萃取体系b均是以正己烷、乙酸乙酯、醇和水按照体积比为1:1:1:1，在该配合比下，一是能够起到更好的分层效果，二是surfactin在酸性下易溶于有机相、不溶于水相，中性条件下易溶于水相，不溶于有机相，保障了分离纯化效果，提高萃取、反萃取的回收率。
优选，所述的醇为甲醇或乙醇。
优选，所述的步骤(3)，调节pH为2。
优选，所述的步骤(4)，调节pH为7。
优选，所述的步骤(3)，所述萃取体系a的温度为40-50℃；和/或所述步骤(4)，所述萃取体系b的温度为40-50℃。能够解决乳化效应，防止萃取体系发生乳化，保障萃取和反萃取的效果，有助于提高回收率和纯度。
本发明创造的目的之二在于提供上述的萃取-反萃取分离纯化surfactin方法制备的含surfactin的纯化物，所述纯化物中surfactin含量≥65％。
本发明创造的目的之三在于提供一种萃取-反萃取分离纯化surfactin方法用萃取体系，以正己烷、乙酸乙酯、醇和水按照体积比为1:1:1:1或6:1:6:1或1:2:1:1混合而成。该萃取体系能够经过调节pH值，使得pH值在酸性时，将surfactin萃取至有机相层，pH值在中性时，将surfactin反萃取至水相层，实现分离纯化surfactin的目的，且能够使得纯化物中surfactin含量≥65％。
与现有技术相比，本发明创造的技术效果体现在：
①适用于液态发酵的surfactin分离纯化，也适合与固态发酵生产的surfactin分离纯化。
②醇过滤液与正己烷、乙酸乙酯、水构建萃取体系a，调pH为1.5-4萃取，分层，取上层有机相；另将正己烷、乙酸乙酯、水和醇混合构建萃取体系b，静置分层，取下层，获得萃取体系b下层水相；将上层有机相与萃取体系b下层水相按体积比1:1混合，调节pH为7-8，振荡，静置分层，取下层水相冷冻干燥后，即得surfactin纯化物，充分利用了surfactin酸性条件下不溶于水，但易溶于复配有机溶剂，且中性条件下易溶于水，但不溶于复配有机溶剂的特性，使得纯化物中，surfactin含量≥65％。
③纯化surfactin步骤简单，发酵液酸沉物，仅仅通过液液萃取、反萃取操作，可得到含量达到65％以上的surfactin，且surfactin回收率达到90％以上，为surfactin后续进一步精制提供了条件，适用于工业生产。
④本发明采用简单的萃取-反萃取技术，因为是对发酵液酸沉物进行萃取-反萃取，相对于发酵液，处理体积大为减少，不需要消耗大量有机溶剂，废水废液排放量低，且使用的有机溶剂可回收利用；不需要高耗能操作，能耗低，对仪器设备要求低，不需要高昂的设备耗材；萃取-反萃取技术酸碱使用总量少(有机溶剂构成的萃取体系，再加上总体积少，耗酸碱少)；操作过程不带来新的杂质。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
1、试验方法
surfactin HPLC定量测定方法：
色谱条件：色谱柱5TC-C18，波长210nm，流速1mL/min，时间0-20min，流动相：90％乙腈(有机相和水相均含0.1％三氟乙酸)，仪器：安捷伦1100型。
配制surfactin(sigma)标准品浓度梯度溶液，在上述色谱条件下检测，制作surfactin标准品浓度与峰面积关系的标准曲线，得到：surfactin标准品峰面积与浓度(mg/mL)的关系函数，Y＝6920.7x+404.36，R2＝0.9976(Y为峰面积，x为浓度)。
后续样品检测，均按照上述色谱条件、仪器下测定其峰面积，根据关系函数，得到surfactin的浓度。
含surfactin的发酵液：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21发酵培养液，经8000r/min离心分离20min，取上清液。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S21，于2018年04月02日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏编号为：CGMCCNo：15544。该菌种已于2018年06月13日提交了并公开在了专利申请号为201810608662.5的专利申请文件中。
2、萃取-反萃取分离纯化surfactin用醇过滤液制备研究：
实施例1：
(1)取上清液，加入2mol/L盐酸至溶液pH为2，固液分离，收集沉淀，得到酸沉物；
(2)取酸沉物，向酸沉物中加入甲醇溶液(料液比g/mL:1:10-1:15)，振荡10min，过滤，取甲醇过滤液，得到醇过滤液；
取100mL醇过滤液，利用HPLC测醇过滤液中surfactin含量为2.714mg/mL，以测定的surfactin含量与醇过滤液体积相乘积，得surfactin质量为271.4mg。
取100mL醇过滤液，干燥，利用千分之一天平称量烘干后的干燥固形物质量，得干燥固形物质量为4.523g。
计算：surfactin在干燥固形物中含量＝100％×(surfactin质量/干燥固形物质量)。得：surfactin在干燥固形物中含量约为6.00％。
实施例2：
在实施例1的基础上，将步骤(2)中的甲醇溶液替换成乙醇溶液，得到乙醇过滤液。将乙醇过滤液采用HPLC测surfactin含量，得surfactin含量为2.748mg/mL，100mL乙醇过滤液中含surfactin 274.8mg。100mL醇过滤液经干燥，所得干燥固形物质量为4.476g。经计算：得surfactin在干燥固形物中含量约为6.13％。
3、萃取-反萃取分离纯化surfactin工艺研究：
实施例3-11：
取实施例1得到的醇过滤液100mL，向其中加入正己烷、乙酸乙酯和水，使得醇过滤液与正己烷、乙酸乙酯和水构建萃取体系a，用HCl调节pH，振荡，静置分层，取上层有机相，得萃取液。采用的萃取体系a成分配比和pH调节如下表1所示：
表1
| 萃取体系a(体积比) | pH | |
| 实施例3 | 正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1:1:1:1 | 1.5 |
| 实施例4 | 正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝6:1:6:1 | 1.5 |
| 实施例5 | 正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1:2:1:1 | 1.5 |
| 实施例6 | 正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1:1:1:1 | 2.0 |
| 实施例7 | 正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝6:1:6:1 | 2.0 |
| 实施例8 | 正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1:2:1:1 | 2.0 |
| 实施例9 | 正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1:1:1:1 | 4.0 |
| 实施例10 | 正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝6:1:6:1 | 4.0 |
| 实施例11 | 正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1:2:1:1 | 4.0 |
将实施例3-11制备得到的萃取液，用于检测萃取液中surfactin含量，得出该100mL醇过滤液中含surfactin的质量，且能够计算出对应实施例中surfactin的回收率和干燥固形物中的surfactin含量，具体结果如下表2所示：
表2
| surfactin质量(mg/100mL醇过滤液) | surfactin回收率(％) | surfactin含量(％) | |
| 实施例3 | 264.18 | 97.34 | 35.98 |
| 实施例4 | 263.74 | 97.18 | 35.94 |
| 实施例5 | 263.91 | 97.24 | 35.96 |
| 实施例6 | 264.33 | 97.39 | 36.01 |
| 实施例7 | 264.01 | 97.28 | 35.97 |
| 实施例8 | 263.77 | 97.19 | 35.94 |
| 实施例9 | 264.23 | 97.36 | 36.02 |
| 实施例10 | 263.83 | 97.21 | 35.94 |
| 实施例11 | 263.86 | 97.22 | 35.91 |
经表1、表2数据显示可见，采用体积比计为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1:1:1:1组成的萃取体系a，在pH值为2条件下，能够使得从醇过滤液中萃取所得的surfactin回收率达到97％以上，纯度达到36％。
实施例12：
取实施例6得到的萃取液，向其中加入萃取体系b下层水相，两者体积比为1:1(萃取体系b下层水相是按照体积比为正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水＝1:1:1:1混合，静置分层，取下层得)，调整pH为7.3，振荡10min，静置分层，取下层水相，得到反萃取液。测反萃取液中surfactin含量并计算surfactin质量，得surfactin质量为244.69mg，得该步骤中，surfactin回收率为92.57％。
取反萃取液，采用冷冻干燥冻干得粉末，采用千分之一天平称量冻干粉质量，得到352mg冻干粉。
计算：冻干粉中surfactin含量＝(surfactin质量/冻干粉质量)×100％。得出：冻干粉中surfactin含量为69.51％。
实施例13：
按照实施例12的操作方式，取所述6的萃取液，直接采用纯水按体积比为1:1加入，调节pH为7.3，振荡10min，静置分层，取下层水相，得到反萃取液。测反萃取液中surfactin含量并计算surfactin质量，得surfactin质量为214.50mg，得该步骤中，surfactin回收率约为81.15％。
实施例14：
在实施例6的基础上，将实施例12反萃取余液返回配制萃取体系a，且将其按照实施例6萃取方法，用于对醇滤过液萃取处理，得到萃取液，并检测萃取液中surfactin含量，得出该100mL醇过滤液中含surfactin的质量263.99mg，surfactin回收率约为97.23％。
本发明创造其他未尽事宜参照现有技术或者本领域技术人员所熟知的公知常识、常规技术手段加以实现即可。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种萃取-反萃取分离纯化surfactin方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将含surfactin发酵液离心除菌，得到上清液；向上清液中加入酸，固液分离收集沉淀，得酸沉物；
（2）向酸沉物中加入甲醇或乙醇，振荡或超声10min，过滤，得醇过滤液；
（3）将醇过滤液与正己烷、乙酸乙酯、水混合构建萃取体系a，调节萃取体系a的pH为1.5-4，振荡，静置分层，取上层有机相；
（4）将正己烷、乙酸乙酯、水和醇混合构建萃取体系b，静置分层，取下层，获得萃取体系b下层水相；
（5）将步骤（3）中的上层有机相与步骤（4）中的萃取体系b下层水相按体积比1:1混合，调节pH为7-8，振荡，静置分层，取下层水相，冷冻干燥，即得含量≥65%的surfactin纯化物；
所述的萃取体系a和所述萃取体系b均是以正己烷、乙酸乙酯、醇和水按照体积比为1:1:1:1或6:1:6:1或1:2:1:1混合而成；
所述的醇为甲醇或乙醇。
2.如权利要求1所述的萃取-反萃取分离纯化surfactin方法，其特征在于，所述的步骤（3），调节pH为2。
3.如权利要求1所述的萃取-反萃取分离纯化surfactin方法，其特征在于，所述的步骤（4），调节pH为7。
4.如权利要求1所述的萃取-反萃取分离纯化surfactin方法，其特征在于，所述的步骤（3），所述萃取体系a的温度为40-50℃；和/或所述步骤（4），所述萃取体系b的温度为40-50℃。
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