CN108148118B

CN108148118B - 一种环孢菌素h的分离纯化方法

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Publication number: CN108148118B
Application number: CN201711318491.4A
Authority: CN
Inventors: 陈秀明; 乐占线; 江莉
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-12-12
Filing date: 2017-12-12
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2037-12-12
Also published as: CN108148118A

Abstract

一种环孢菌素H的分离纯化方法，其中层析柱采用了苯基氨基甲酸酯化β‑环糊精硅胶作为层析柱的填料，进行环孢菌素H的分离纯化，可将原料中的环孢菌素A和环孢菌素H进行有效分离。同时分离纯化过程中，可使用单一极性溶剂，可对溶剂进行回收利用，节约生产成本。洗脱过程中，含有环孢菌素H的交叉部分还可以回收重新纯化，避免造成浪费。同时，该技术方案适用于各种含环孢菌素H的原料,适用性强，可大量制备，可为医药工业提供大量高纯度的环孢菌素H原材料。

Description

一种环孢菌素H的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及生物化学领域，特别涉及一种环孢菌素H的分离纯化方法。

背景技术

环孢菌素(Cyclosporin)是20世纪70年代发现的由雪白白僵菌(Beauveriabassiana，原名为多孔木霉菌Tolypocladium inflatum)产生的一组环状十一肽物质。其中的一个主要组分一环孢素A(Cyclosporin A,CsA)己作为高效免疫抑制剂广泛应用于器官移植术，环孢素A结构图与结构式可见图1。它的问世引起了器官移植领域的一场革命。除免疫抑制作用外，环孢素还有一系列其它生物活性，如治疗红斑狼疮、牛皮癣等自身免疫系统疾病，抑制HIV-1病毒，逆转肿瘤多药耐药等。

环孢菌素H(Cyclosporin H,CsH)结构图与结构式可见图2，与CsA都是首先从半知菌属多孔木霉(Tolypocladium inflatum后正名为雪白白僵菌Beauveria bassiana)代谢产物中分离出来的。CsH的化学结构和CsA相似，都是由十一个氨基酸组成的环状多肽，只是第十一位上的甲基缬氨酸(MeVal)的构型不同，在CsA中为L构型，在CsH中为D构型。CsH无免疫抑制活性，但在逆转肿瘤多药耐药、抗寄生虫以及抗病毒方面与CsA有相似的作用，特别是在对G-蛋白偶联受体(GPCR)－甲酰肽受体(FPR)功能的拮抗作用方面大大强于CsA，也强于许多其他甲酰肽受体拮抗剂，引起科学家广泛的注意。此外，CsH已经用于研究其它的一些生物过程，包括程序性死亡、K+离子通道的功能性表达、Ca+在血管平滑肌可能的作用、一氧化氮(NO)合成酶活性、病毒诱导的细胞调亡、肿瘤和获得性免疫缺陷综合症(HIV)等。

目前，环孢菌素H来源主要有两个途径：1、依据美国专利pat20120253007，Synthesis of Cyclosporin H的报道方法，将CsA转换为CsH，但先分离出CsA，再进行CsH的转换，步骤繁琐，收率较低。2、从多孔木霉的发酵液经过滤或离心分离,滤液用乙酸丁酯提取,提取物除脂后得到环孢菌素的混合物,再经硅胶柱层析后经分部收集、去色素、减压浓缩和干燥得到白色CsH粉末。图3、图4分别是由两种发酵粗提取物环孢菌素H的HPLC图，其中环孢菌素H含有不同比例，有2.7％也有4.1％(RT 79min)。从发酵粗提取物HPLC在210nm下可以看到含有的杂质大概分布情况，较难快速获得高纯度的环孢菌素H。其中，这两种发酵粗提取物一般是经过不同的层析作为环孢菌素A的生产原料。但由于发酵副产物较多，提取步骤复杂，收率较低。图5是由环孢菌素A合成制备的环孢菌素H的HPLP图，其中环孢菌素H含量为21.4％。

目前获得环孢菌素H的主要方法用硅胶或者ODS-C18色谱填料对以上环孢菌素粗品进行提纯，但分离度效果不好、收率低且繁琐。有研究报道，可采用大孔树脂结合高速逆流色谱分离纯化的方法，分离中交叉组分大，纯化周期长，不适合放大。

在《茄病镰刀菌产生的环孢菌素H的研究----分离纯化和结构鉴别》提供了硅胶层析柱分离纯化方法和HPLC检测条件，ODS-C18，4.6*250mm，5μm，1ml/min，乙腈：水：叔丁基甲醚：磷酸＝50：45：5：0.1，紫外210nm，80℃。在实用新型专利《一种环孢菌素同系物的分离纯化装置》CN205838893U中提供了一种环孢菌素同系物的分离纯化装置，该方法主要利用至少两级切向层析柱分离纯化单元的系统，该系统主要是适用于硅胶填料或者氧化铝填料介质，设备系统复杂且设置多处压力泵和洗脱体系，难适用于反相层析方式。在专利《高纯度环孢菌素A的制备方法》CN1763084报道了使用丙酮、水和正己烷长时间粗结晶以及结合硅胶层析纯化然后再结晶得到纯度高的环孢菌素A，和《一种制备环孢菌素A的方法》CN102086226A中，则使用了大孔吸附树脂层析、硅胶柱层析、结晶纯化得到纯度高的环孢菌素A，

由工业生产上环孢菌素A发酵的参考相关文献：《发酵液中小组分环孢菌素D的HPLC测定法》《果葡糖浆对环孢菌素A发酵影响的研究》《环孢菌素A发酵生产方法》《环孢菌素A产生菌诱变育种及发酵条件研究》《雪白白僵菌产环孢菌素A分批补料发酵动力学》可知一般环孢菌素A的组分初始占总纯度都会大于85％，以及后续的纯化生产才能获得有价值的环孢菌素A纯品。对于发酵粗品中本身含有的杂质小组分环孢菌素H的获得还较难获得规模化生产，一般都是通过环孢菌素A生产的边角料，经过多次富集纯化，提高含量后再进行纯化获得，专利pat20120253007和其参考文献报道的合成转换方法获得的粗品是一种有效可控的环孢菌素H获得来源，但纯化也过于繁琐收率较低。同时，合适的结晶溶剂体系会对产品的纯度和晶型起关键的作用，结晶和重结晶也是一种重要的提高产品纯度的方式。

发明内容

为此，需要提供一种高收率，高纯度的环孢菌素H的分离纯化方法，特别是将环孢菌素H与环孢菌素A进行分离纯化的方法。为实现上述目的，发明人提供了一种环孢菌素H的分离纯化方法，包括以下步骤：

待分离液的制备：将环孢菌素H含量10％以上的环孢菌素H粗品溶解于极性溶剂，过滤后得到含环孢菌素H的溶液，按溶液体积比15-25％加入水进行搅拌稀释，制成待分离液；

上样：将待分离液上样层析柱，形成含有环孢菌素H的层析柱；所述层析柱制备包括：将苯基氨基甲酸酯化β-环糊精硅胶用甲醇浸泡后装柱，再用体积百分比浓度35-40％的极性溶剂平衡层析柱；

洗脱：用洗脱液对层析柱进行梯度洗脱，所述洗脱液中含有质量百分比为0.1％的甲酸或乙酸，所述洗脱液中极性溶剂的体积百分比浓度由35-40％逐步提高至45-50％，洗脱流速为每小时3-5个柱体积，用HPLC进行跟踪监测，收集环孢菌素H含量95％以上的洗脱液；

浓缩结晶：将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95％以上的洗脱液进行浓缩，浓缩后产物用乙酸乙酯进行萃取，并取上相萃取液减压浓缩后得到稠状浓缩物，稠状浓缩物加入丙酮溶解过滤后，再依次加入甲基叔丁基醚和去离子水，最后逐步加入正己烷至溶液中出现白色不溶物后，降温至4℃，析出白色固体；

干燥：过滤浓缩结晶步骤中析出的白色固体，将白色固体在40-60℃下进行干燥，得到环孢菌素H成品。

优选的，所述环孢菌素H粗品中含有环孢菌素A。

优选的，所述极性溶剂为乙腈、甲醇、乙醇的一种或者多种。

优选的，所述待分离液的制备步骤中，所述环孢菌素H粗品与所述极性溶剂的重量比为1：8-12。

优选的，所述环孢菌素H粗品与所述苯基氨基甲酸酯化β-环糊精硅胶的重量比为1：10-100。

优选的，所述层析柱的径高比大于10。

优选的，所述浓缩结晶步骤中，将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95％以上的洗脱液减压浓缩至无极性溶剂后，再用乙酸乙酯进行萃取。

优选的，所述浓缩结晶步骤中，将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95％以上的洗脱液用截留分子量不大于200的聚醚砜纳滤膜进行浓缩，浓缩至原体积的五分一后，再用乙酸乙酯进行萃取。

优选的，所述浓缩结晶步骤中，所述稠状浓缩物与丙酮、甲基叔丁基醚、去离子水的重量比为1:1-3：1:0.001。

优选的，所述浓缩结晶步骤中，所述稠状浓缩物与正己烷的体积比为1:4-6。

区别于现有技术，上述技术方案的层析柱采用了苯基氨基甲酸酯化β-环糊精硅胶作为层析柱的填料，进行环孢菌素H的分离纯化，可将原料中的环孢菌素A和环孢菌素H进行有效分离。同时分离纯化过程中，可使用单一极性溶剂，可对溶剂进行回收利用，节约生产成本。洗脱过程中，含有环孢菌素H的交叉部分还可以回收重新纯化，避免造成浪费。该技术方案适用于各种含环孢菌素H的原料,适用性强，可大量制备，可为医药工业提供大量高纯度的环孢菌素H原材料。

附图说明

图1为背景技术所述环孢菌素A的结构图与结构式；

图2为背景技术所述环孢菌素H的结构图与结构式；

图3为背景技术所述的一种发酵提取粗品的HPLC图；

图4为背景技术所述的另一种发酵提取粗品的HPLC图；

图5为背景技术所述的一种环孢菌素A合成制备含环孢菌素H粗品的HPLC图；

图6为实施例3中制备的环孢菌素H成品的HPLC图；

图7为实施例3中制备的环孢菌素H成品的质谱图。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

本实施方式中HPLC高效液相色谱参数如下：色谱柱：ZORBAX SB-C18，4.6*250mm，5μm，流速：1ml/min，流动相比例为(乙腈：水：叔丁基甲醚：磷酸＝50：45：5：0.1)，紫外检测波长210nm，柱温：60℃。

实施例1：

实施例1中的环孢菌素H粗品来自用硅胶柱层析纯化环孢菌素A时的交叉副产物，经检测环孢菌素H含量为10％。

本实施例的分离纯化方法，包括以下步骤：

待分离液的制备：将环孢菌素H含量10％的环孢菌素H粗品溶解于10倍重量的甲醇，过滤去除固体不溶杂质后得到含环孢菌素H的溶液，并按溶液体积比20％加入水进行搅拌稀释，制成待分离液；搅拌加入20％水使得上样液含有水，且样品不会析出。

层析柱制备：将苯基氨基甲酸酯化β-环糊精硅胶用甲醇浸泡后装柱，再用体积百分比浓度40％的甲醇平衡层析柱；层析柱柱径高比H/D＝15，

上样：将待分离液上样层析柱，形成含有环孢菌素H的层析柱；环孢菌素H粗品与苯基氨基甲酸酯化β-环糊精硅胶的重量比为1：50。

洗脱：用含有质量百分比0.1％甲酸的洗脱液对层析柱进行梯度洗脱，洗脱液中甲醇的体积百分比浓度由40％逐步提高至50％，洗脱流速为每小时4个柱体积，第一个洗脱浓度40％洗12个柱体积，然后45％洗20个柱体积，然后50％洗脱，洗脱液经HPLC进行跟踪监测，收集环孢菌素H含量95％以上的洗脱液；

浓缩结晶：将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95％以上的洗脱液减压浓缩至无水后，用乙酸乙酯进行萃取，取上相萃取液减压浓缩后得到稠状浓缩物，稠状浓缩物加入丙酮溶解过滤后，再依次加入甲基叔丁基醚和去离子水，所述稠状浓缩物与丙酮、甲基叔丁基醚、去离子水的重量比为1:2：1:0.001；最后逐步加入5倍体积的正己烷至溶液中出现白色不溶物后，降温至4℃，析出白色固体。

干燥：过滤浓缩结晶步骤中析出的白色固体，将白色固体在50℃下进行干燥，得到环孢菌素H成品。

实施例2：

实施例2中的环孢菌素H粗品来自多孔木霉的发酵液，多次层析纯化环孢菌素A获得的含环孢菌素交叉杂质，其中环孢菌素H含量为30％。

本实施例的分离纯化方法，包括以下步骤：

待分离液的制备：将环孢菌素H含量30％的环孢菌素H粗品溶解于10倍重量的乙腈，过滤去除固体不溶杂质后得到含环孢菌素H的溶液，并按溶液体积比15％加入水进行搅拌稀释，制成待分离液；搅拌加入少量水使得上样液含有水，且样品不会析出。

层析柱制备：将苯基氨基甲酸酯化β-环糊精硅胶用甲醇浸泡后装柱，再用体积百分比浓度35％的乙腈平衡层析柱；层析柱柱径高比H/D＝15，

上样：将待分离液上样层析柱，形成含有环孢菌素H的层析柱；环孢菌素H粗品与苯基氨基甲酸酯化β-环糊精硅胶的重量比为1：100。

洗脱：用含有质量百分比0.1％乙酸的洗脱液对层析柱进行梯度洗脱，洗脱液中乙腈的体积百分比浓度由35％逐步提高至45％，洗脱流速为每小时5个柱体积，第一个洗脱浓度35％洗10个柱体积，38％洗15个柱体积，然后41％洗脱20个柱体积，最后45％洗脱，洗脱液经HPLC进行跟踪监测，收集环孢菌素H含量95％以上的洗脱液；浓缩结晶：

浓缩结晶：将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95％以上的洗脱液用截留分子量不大于200的聚醚砜纳滤膜进行浓缩，滤液用等体积的水进行稀释三次浓缩至原体积的五分一后，再用乙酸乙酯进行萃取，取上相萃取液减压浓缩后得到稠状浓缩物，所述稠状浓缩物加入丙酮溶解过滤后，再依次加入甲基叔丁基醚和去离子水，所述稠状浓缩物与丙酮、甲基叔丁基醚、去离子水的重量比为1:2：1:0.001；最后逐步加入4倍体积的正己烷至溶液中出现白色不溶物，降温至4℃，析出白色固体；

干燥：过滤浓缩结晶步骤中析出的白色固体，将白色固体在60℃下进行干燥，得到环孢菌素H成品。

实施例3：

实施例3中的环孢菌素H粗品来自用环孢菌素A反应制备得环孢菌素H，经过前处理后环孢菌素H含量为21.4％，其HPLC图见图5，背景技术所述一种环孢菌素A合成制备含环孢菌素H粗品的HPLC图。

本实施例的分离纯化方法，包括以下步骤：

待分离液的制备：将环孢菌素H含量50％的环孢菌素H粗品溶解于8倍重量的乙醇，过滤去除固体不溶杂质后得到含环孢菌素H的溶液，并按溶液体积比25％加入水进行搅拌稀释，制成待分离液；搅拌加入少量水使得上样液含有水，且样品不会析出。

层析柱制备：将苯基氨基甲酸酯化β-环糊精硅胶用甲醇浸泡后装柱，再用体积百分比浓度40％的乙醇平衡层析柱；层析柱柱径高比H/D＝20，

上样：将待分离液上样层析柱，形成含有环孢菌素H的层析柱；环孢菌素H粗品与苯基氨基甲酸酯化β-环糊精硅胶的重量比为1：10。

洗脱：用含有质量百分比0.1％乙酸的洗脱液对层析柱进行梯度洗脱，洗脱液中乙醇的体积百分比浓度由40％逐步提高至50％，洗脱流速为每小时3个柱体积，第一个洗脱浓度40％洗9个柱体积，43％洗12个柱体积，然后47％洗脱15个柱体积，最后50％洗脱，洗脱液经HPLC进行跟踪监测，收集环孢菌素H含量95％以上的洗脱液；浓缩结晶：

浓缩结晶：将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95％以上的洗脱液用截留分子量不大于200的聚醚砜纳滤膜浓缩，浓缩至原体积的五分之一后，再用乙酸乙酯进行萃取，取上相萃取液减压浓缩后得到稠状浓缩物，所述稠状浓缩物加入丙酮溶解过滤后，再依次加入甲基叔丁基醚和去离子水，所述稠状浓缩物与丙酮、甲基叔丁基醚、去离子水的重量比为1:3：1:0.001；最后逐步加入6倍体积的正己烷至溶液中出现白色不溶物，降温至4℃，析出白色固体；

干燥：过滤浓缩结晶步骤中析出的白色固体，将白色固体在40℃下进行干燥，得到环孢菌素H成品。

将实施例3得到的环孢菌素H成品用HPLC和质谱仪进行检测分析，环孢菌素H，RT＝78min纯度99.4％。具体可见图6实施例3中制备的环孢菌素H成品的HPLC图和图7实施例3中制备的环孢菌素H成品的质谱图。

按照本方案纯化方法，可将环孢菌素H的纯度提高至99％以上，适合医药工业化的生产要求。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims

1.一种环孢菌素H的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

待分离液的制备：将环孢菌素H含量10%以上的环孢菌素H粗品溶解于极性溶剂，过滤后得到含环孢菌素H的溶液，按溶液体积比15-25%加入水进行搅拌稀释，制成待分离液；

上样：将待分离液上样层析柱，形成含有环孢菌素H的层析柱；所述层析柱的制备包括：将苯基氨基甲酸酯化β-环糊精硅胶用甲醇浸泡后装柱，再用体积百分比浓度35-40%的极性溶剂平衡层析柱；

洗脱：用洗脱液对层析柱进行梯度洗脱，所述洗脱液中含有质量百分比为0.1%的甲酸或乙酸，所述洗脱液中极性溶剂的体积百分比浓度由35-40%逐步提高至45-50%，洗脱流速为每小时3-5个柱体积，用HPLC进行跟踪监测，收集环孢菌素H含量95%以上的洗脱液；

浓缩结晶：将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95%以上的洗脱液进行浓缩，浓缩后产物用乙酸乙酯进行萃取，并取上相萃取液减压浓缩后得到稠状浓缩物，稠状浓缩物加入丙酮溶解过滤后，再依次加入甲基叔丁基醚和去离子水，最后逐步加入正己烷至溶液中出现白色不溶物后，降温至4℃，析出白色固体；

干燥：过滤浓缩结晶步骤中析出的白色固体，将白色固体在40-60℃下进行干燥，得到环孢菌素H成品；

所述环孢菌素H粗品中含有环孢菌素A；

所述待分离液的制备步骤中，所述环孢菌素H粗品与所述极性溶剂的重量比为1：8-12；

所述上样步骤中，所述环孢菌素H粗品与所述苯基氨基甲酸酯化β-环糊精硅胶的重量比为1：10-100；

所述层析柱的径高比大于10。

2.根据权利要求1所述的一种环孢菌素H的分离纯化方法，其特征在于，所述极性溶剂为乙腈、甲醇、乙醇的一种或者多种。

3.根据权利要求1所述的一种环孢菌素H的分离纯化方法，其特征在于，所述浓缩结晶步骤中，将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95%以上的洗脱液减压浓缩至无极性溶剂后，再用乙酸乙酯进行萃取。

4.根据权利要求1所述的一种环孢菌素H的分离纯化方法，其特征在于，所述浓缩结晶步骤中，将洗脱步骤中收集的环孢菌素H含量95%以上的洗脱液用截留分子量不大于200的聚醚砜纳滤膜进行浓缩，浓缩至原体积的五分之一后，再用乙酸乙酯进行萃取。

5.根据权利要求1所述的一种环孢菌素H的分离纯化方法，其特征在于，所述浓缩结晶步骤中，所述稠状浓缩物与丙酮、甲基叔丁基醚、去离子水的重量比为1:1-3:1:0.001。

6.根据权利要求1所述的一种环孢菌素H的分离纯化方法，其特征在于，所述浓缩结晶步骤中，所述稠状浓缩物与正己烷的体积比为1:4-6。