CN112225759A - 一种β-烟酰胺单核苷酸溶液的制备及纯化方法 - Google Patents

一种β-烟酰胺单核苷酸溶液的制备及纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种β‑烟酰胺单核苷酸溶液的制备及纯化方法。用烟酰胺核糖盐通过磷酸化反应得到烟酰胺单核苷酸盐，然后在酸性条件下酸化得到β‑烟酰胺单核苷酸溶液；将经过预处理的上述溶液用膜浓缩设备先后进行微滤和纳滤，然后将获得的初步产物pH值调至3～7，进样上反相高效液相色谱制备柱，固定相为硅胶，流动相A为盐酸溶液，流动相B为乙醇，进行梯度洗脱纯化，得到纯化产物；将纯化产物用膜浓缩设备进行纳滤后，用真空冷冻机冻干，获得纯化的烟酰胺单核苷酸。

Description

一种β-烟酰胺单核苷酸溶液的制备及纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种β-烟酰胺单核苷酸溶液的制备及纯化方法。
背景技术：
β-烟酰胺单核苷酸溶液是一种有机分子，也是一种核苷酸。目前，β-烟酰胺单核苷酸溶液的大规模制备方法主要是通过发酵以及酶促反应来实现的，之后的纯化主要通过离子交换树脂进行。
目前的酶法合成中主要缺陷是反应条件困难、产出效率低、进而导致成本高昂。且酶法合成中还涉及反应副产物有可能对人体有害等问题。在纯化过程中，由于其与多种类似物如NAD带电荷和极性极为相近，无法将其中的类似物杂质完全去除，所以目前的纯化方法获得的产品纯度只有40％左右，收率只有30％，效率低下。
发明内容：
本发明正是针对上述效率低下、成本高昂等问题，提供了一种β -烟酰胺单核苷酸溶液的制备及纯化方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案，先用烟酰胺核糖盐通过磷酸化反应得到烟酰胺单核苷酸盐，然后在酸性条件下酸化得到β-烟酰胺单核苷酸溶液；将经过预处理的上述溶液用膜浓缩设备先后进行微滤和纳滤，然后将获得的初步产物pH值调至3～7，进样上反相高效液相色谱制备柱，固定相为硅胶，流动相A为盐酸或醋酸，流动相B为乙醇，进行梯度洗脱纯化，得到纯化产物；将纯化产物用膜浓缩设备进行纳滤后，用真空冷冻机冻干，获得纯化的烟酰胺单核苷酸。
具体的步骤为，
1、在pH 7.5～10的碱性水溶液中，反应体系温度为35～40℃条件下，将摩尔比为1:1～1.5的烟酰胺核糖盐与偏磷酸盐进行磷酸化反应2～2.5h，得到烟酰胺单核苷酸盐；
2、向烟酰胺单核苷酸盐中加酸，调节pH值至1～4，将烟酰胺单核苷酸盐酸化形成β-烟酰胺单核苷酸溶液；
3、将上述β-烟酰胺单核苷酸溶液用膜浓缩设备先后进行微滤和纳滤，用于微滤的中空纤维膜孔径为0.02μm～0.1μm，用于纳滤的纳滤膜孔径为0.1～0.5nm，收集所得溶液；
4、将收集的溶液pH值调至1～5，进样上反相高效液相色谱制备柱，固定相为四十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A为盐酸或醋酸，流动相B为乙醇，进行梯度洗脱纯化，得到纯化的β-烟酰胺单核苷酸溶液；
5、将纯化的β-烟酰胺单核苷酸溶液溶液用膜浓缩设备进行纳滤后，用真空冷冻干燥机冻干，获得纯化的β-烟酰胺单核苷酸。
本发明的有益效果：
本发明是在目前已有的工艺路线基础上做出改进，对所选物料和试剂、物料量的控制等方面做出优化，相对于原有制备工艺，本发明所涉及的原料主要为碱性或酸性溶液，成本低，工艺条件稳定，且纯化过程操作简单，其生产效率也比其它工艺提高了5倍以上，有效解决了现有技术中磷酸根残留不易解决的问题。
用于微滤的中空纤维膜孔径控制为0.02-0.1μm，用于纳滤的纳滤膜孔径控制为0.1-0.5nm；经多步处理(如梯度洗脱纯化等操作)，经以上优化后杂质残留到β-烟酰胺单核苷酸中的可能性极低。溶剂选用避免一类高风险溶剂1,2-二氯乙烷和基因毒性杂质溶剂1,4-二氧六环等，而是选用了盐酸、醋酸和乙醇等，不涉及有机溶剂残留。
本发明保证了多个连续步骤在一个反应容器中进行，避免了分离中间体的步骤，因此避免了中间体在分离过程中发生损失的情况，保证了最终产物的高收率，并且处理时间比较短，操作效率高，适合大规模化生产。
附图说明：
图1为实施例1-3制备的β-烟酰胺单核苷酸的核磁共振图。
具体实施方式：
实施例1
在5000mL的三口烧瓶中加入100g(0.344mol)的烟酰胺核糖氯化物，加入2000mLpH＝9的氢氧化钠水溶液，再加入110.48g(0.361mol) 的三偏磷酸钠(STMP)，将反应温度控制在35℃，混合液搅拌反应2.5 小时，得到烟酰胺单核苷酸盐；将反应体系降温至10℃，加入1000ml 盐酸溶液，调节反应体系pH值至1，将烟酰胺单核苷酸盐酸化形成β-烟酰胺单核苷酸溶液；将上述β-烟酰胺单核苷酸溶液用膜浓缩设备先后进行微滤和纳滤，用孔径为0.03μm的中空纤维膜微滤除掉微生物，纳滤采用截留分子量100的0.1nm的中空纤维膜将溶液浓缩 20-25g/L；将浓缩后的溶液用盐酸溶液调pH至3，进样上反相高效液相色谱制备柱(柱子直径和长度为5cm*30cm)，固定相为四十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A为pH为7的盐酸溶液，流动相B为40wt％乙醇，流速为2500ml/min，检测波长为260nm，梯度为B％： 4％，上样量为8g，进行40min梯度洗脱纯化，收集目的峰，得到纯化的β-烟酰胺单核苷酸溶液；将纯化的β-烟酰胺单核苷酸溶液溶液用膜浓缩设备(截留分子量100的中空纤维膜)进行纳滤后，然后用真空冷冻干燥机冻干，得到纯度大于98％的β-烟酰胺单核苷酸，总收率可以达到92.3％。
将终产物用高效液相色谱法测试，见图1。由图1可知， 1HNMR(D2O,400MHz)：δ9.36(s,1H),9.18(d,1H,J＝6.4Hz)，8.87(d,1H,J ＝8.0Hz)，8.19(t,1H,J＝8.0Hz)，6.11(d,1H,J＝5.6Hz)，4.54(s,1H，H-1’)， 4.46(t,1H,J＝5.2Hz)，4.45-4.33(m,1H),4.23-4.03(m,2H)。
实施例2
在5000mL的三口烧瓶中加入100g(0.344mol)的烟酰胺核糖氯化物，加入2000mLpH＝9的氢氧化钠水溶液，再加入110.48g(0.361mol) 的三偏磷酸钠(STMP)，将反应温度控制在35℃，混合液搅拌反应2.5 小时，得到烟酰胺单核苷酸盐；将反应体系降温至10℃，加入1000ml 盐酸溶液，调节反应体系pH值至1，将烟酰胺单核苷酸盐酸化形成β-烟酰胺单核苷酸溶液；将上述β-烟酰胺单核苷酸溶液用膜浓缩设备先后进行微滤和纳滤，用孔径为0.02μm的中空纤维膜微滤除掉微生物，用孔径为0.5nm、分子量为100的中空纤维膜的中空纤维膜将溶液纳滤浓缩至20-25g/L。将浓缩后的溶液用盐酸溶液调pH至4，进样上反相高效液相色谱制备柱(柱子直径和长度为5cm*30cm)，固定相为四十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A为pH为7的盐酸溶液，流动相B为40wt％乙醇，流速为3000ml/min，检测波长为 260nm，梯度为B％：8％，上样量为10g，进行40min梯度洗脱纯化，收集目的峰，得到纯化的β-烟酰胺单核苷酸溶液；将纯化的β-烟酰胺单核苷酸溶液溶液用膜浓缩设备(截留分子量100的中空纤维膜)进行纳滤后，然后用真空冷冻干燥机冻干，得到纯度大于 98％的β-烟酰胺单核苷酸，总收率可以达到94.3％。
将终产物用核磁氢谱测试，见图1。从图1可见， 1HNMR(D2O,400MHz)：δ9.36(s,1H),9.18(d,1H,J＝6.4Hz)，8.87(d,1H,J ＝8.0Hz)，8.19(t,1H,J＝8.0Hz)，6.11(d,1H,J＝5.6Hz)，4.54(s,1H，H-1’)， 4.46(t,1H,J＝5.2Hz)，4.45-4.33(m,1H),4.23-4.03(m,2H)。
实施例3
在5000mL的三口烧瓶中加入100g(0.344mol)的烟酰胺核糖氯化物，加入2000mLpH＝9的氢氧化钠水溶液再加入110.48g(0.361mol) 的三偏磷酸钠(STMP)，将反应温度控制在35℃，混合液搅拌反应2.5 小时，得到烟酰胺单核苷酸盐；将反应体系降温至10℃，加入1000ml 盐酸溶液，调节反应体系pH值至1，将烟酰胺单核苷酸盐酸化形成β-烟酰胺单核苷酸溶液；将上述β-烟酰胺单核苷酸溶液用膜浓缩设备先后进行微滤和纳滤，用孔径为0.02μm的中空纤维膜微滤除掉微生物，用孔径为0.5nm、分子量为100的中空纤维膜的中空纤维膜将溶液纳滤浓缩至20-25g/L；将获得的溶液用磷酸溶液将pH值调至3，进样上反相高效液相色谱制备柱(柱子直径和长度为30cm*30cm)，固定相为四十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A为pH为7的盐酸溶液，流动相B为55wt％乙醇，流速为3000ml/min，检测波长为 260nm，梯度为B％：12％，上样量为35g，进行40min梯度洗脱纯化，收集目的峰，得到纯化的β-烟酰胺单核苷酸溶液；将纯化的β-烟酰胺单核苷酸溶液溶液用膜浓缩设备(截留分子量200的中空纤维膜)进行纳滤后，得到纯度大于98％的β-烟酰胺单核苷酸，总收率可以达到97.9％。
将终产物用核磁氢谱测试，见图1。从图1可见， 1HNMR(D2O,400MHz)：δ9.36(s,1H),9.18(d,1H,J＝6.4Hz)，8.87(d,1H,J ＝8.0Hz)，8.19(t,1H,J＝8.0Hz)，6.11(d,1H,J＝5.6Hz)，4.54(s,1H，H-1’)， 4.46(t,1H,J＝5.2Hz)，4.45-4.33(m,1H),4.23-4.03(m,2H)。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种β-烟酰胺单核苷酸溶液的制备及纯化方法，其特征在于，用烟酰胺核糖盐通过磷酸化反应得到烟酰胺单核苷酸盐，然后在酸性条件下酸化得到β-烟酰胺单核苷酸溶液；将经过预处理的上述溶液用膜浓缩设备先后进行微滤和纳滤，然后将获得的初步产物pH值调至3～7，进样上反相高效液相色谱制备柱，固定相为硅胶，流动相A为盐酸或醋酸，流动相B为乙醇，进行梯度洗脱纯化，得到纯化产物；将纯化产物用膜浓缩设备进行纳滤后，用真空冷冻机冻干，获得纯化的烟酰胺单核苷酸。
2.根据权利要求1所述的β-烟酰胺单核苷酸溶液的制备及纯化方法，其特征在于，具体的步骤为，
(1)在pH 7.5～10的碱性水溶液中，反应体系温度为35～40℃条件下，将摩尔比为1:1～1.5的烟酰胺核糖盐与偏磷酸盐进行磷酸化反应2～2.5h，得到烟酰胺单核苷酸盐；
(2)向烟酰胺单核苷酸盐中加酸，调节pH值至1～4，将烟酰胺单核苷酸盐酸化形成β-烟酰胺单核苷酸溶液；
(3)将上述β-烟酰胺单核苷酸溶液用膜浓缩设备先后进行微滤和纳滤，用于微滤的中空纤维膜孔径为0.02μm～0.1μm，用于纳滤的纳滤膜孔径为0.1～0.5nm，收集所得溶液；
(4)将收集的溶液pH值调至1～5，进样上反相高效液相色谱制备柱，固定相为四十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A为盐酸或醋酸，流动相B为乙醇，进行梯度洗脱纯化，得到纯化的β-烟酰胺单核苷酸溶液；
(5)将纯化的β-烟酰胺单核苷酸溶液溶液用膜浓缩设备进行纳滤后，用真空冷冻干燥机冻干，获得纯化的β-烟酰胺单核苷酸。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114317643A (zh) * 2022-01-18 2022-04-12 宝莱福健康科技研究(中山)有限公司 一种烟酰胺单核苷酸的制备方法
CN117304238A (zh) * 2023-11-29 2023-12-29 天津奥利芙生物技术有限公司 一种核苷酸纯化方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104817604A (zh) * 2015-03-16 2015-08-05 邦泰生物工程(深圳)有限公司 一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法
US20180291054A1 (en) * 2015-03-27 2018-10-11 Cornell University Efficient synthesis of nicotinamide mononucleotide
CN111377983A (zh) * 2020-03-26 2020-07-07 音芙医药科技(上海)有限公司 一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104817604A (zh) * 2015-03-16 2015-08-05 邦泰生物工程(深圳)有限公司 一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法
US20180291054A1 (en) * 2015-03-27 2018-10-11 Cornell University Efficient synthesis of nicotinamide mononucleotide
CN111377983A (zh) * 2020-03-26 2020-07-07 音芙医药科技(上海)有限公司 一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114317643A (zh) * 2022-01-18 2022-04-12 宝莱福健康科技研究(中山)有限公司 一种烟酰胺单核苷酸的制备方法
CN117304238A (zh) * 2023-11-29 2023-12-29 天津奥利芙生物技术有限公司 一种核苷酸纯化方法

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