CN115974949B

CN115974949B - 一种植物源脱氧胆酸中间体的制备方法

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Publication number: CN115974949B
Application number: CN202211315720.8A
Authority: CN
Inventors: 曾春玲; 李斌; 刘红; 羊向新; 许新华
Original assignee: Hunan Kerey Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Hunan Kerey Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2022-10-26
Filing date: 2022-10-26
Publication date: 2023-12-22
Anticipated expiration: 2042-10-26
Also published as: CN115974949A

Abstract

一种植物源脱氧胆酸中间体的制备方法，包括以下步骤：步骤1、以(20S)‑9‑羟基‑3‑酮基孕甾‑4‑烯‑20‑羧酸甲酯为起始原料，脱水合成化合物B1；步骤2、化合物B1加氢还原生成化合物A2；步骤3、化合物A2在3α‑羟基类固醇脱氢酶作用下还原酮基为化合物A3。本发明合成化合物B1过程中无△⁸ _, ⁹位双键的异构体。在对中间体B1加氢时，本发明通过控制氢气压力选择性还原△⁴ _, ⁵位氢，而△⁹ _, ¹¹位双键不受影响，选择合适的溶剂和温度减少5α‑H副产物生成。在对中间体A2的3‑酮基还原过程中，本发明所得产物A3无3β羟基异构体，整体路线的收得率较原工艺大幅度提高，便于工业化生产。

Description

一种植物源脱氧胆酸中间体的制备方法

技术领域

本发明属于化工技术领域，具体涉及到一种植物源脱氧胆酸中间体的制备方法。

背景技术

脱氧胆酸，化学式为C₂₄H₄₀O₄，化学名称为3α,12α-二羟基-5β-胆烷-24-酸，是次级胆汁酸之一，它是肠道细菌的代谢副产物，其结构式如下：

脱氧胆酸注射液是2015年4月29日由美国食品药品监督管理局(FDA)批准全球首个局部溶脂药，该药用于治疗和改善成人中度至重度颏下脂肪的凸起或丰满(双下巴)。

WO2017211820公开了以植物来源的植物甾醇发酵产物(20S)-9-羟基-3-酮基孕甾-4-烯-20-羧酸甲酯为起始原料制备脱氧胆酸的方法，路线如下所示：

但在实际制备中发现，从起始物开始制备A3的过程中存在以下问题：

1)、起始物SM在氢化反应制备A1时存在3，9位不能完全连接的物质及较大比例的5α位氢异构的杂质，结构如下：

2)、化合物A1在进行消除反应制备A2过程不可避免的生成△^8,9位双键的副产物，结构如下：

3)、化合物A2在进行化学还原反应制备A3过程中不可避免的生成3β羟基杂质，结构如下：

该路线的副产物杂质多，至少有三种异构体存在，纯化困难，若要获得高质量的中间体，则需要多次精制，从而导致收率降低，成本较高，也不利于工业化放大。

因此，本领域需要设计一种新的植物源脱氧胆酸中间体的制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物源脱氧胆酸中间体的制备方法，以解决背景技术中提出的以植物来源的植物甾醇发酵产物(20S)-9-羟基-3-酮基孕甾-4-烯-20-羧酸甲酯为起始原料制备脱氧胆酸的方法中，因副产物杂质多而导致收率降低、成本较高的问题。

本发明的技术方案是一种植物源脱氧胆酸中间体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、以(20S)-9-羟基-3-酮基孕甾-4-烯-20-羧酸甲酯为起始原料，在无机酸和冰醋酸的作用下，脱水合成化合物B1；

步骤2、化合物B1在反应溶剂的作用下加氢还原生成化合物A2；

步骤3、化合物A2在3α-羟基类固醇脱氢酶作用下还原酮基为化合物A3

在一种具体的实施方式中，所述步骤1中的无机酸包括硫酸和磷酸中的一种，优选无机酸为硫酸；所述步骤1中的反应温度为0～60℃，优选步骤1中的反应温度为30～40℃。

在一种具体的实施方式中，所述步骤2中的反应溶剂包括四氢呋喃、无水乙醇、甲醇和二氯甲烷中的一种或两种，优选反应溶剂为无水乙醇。

在一种具体的实施方式中，所述步骤2中还添加了有机碱，所述步骤2中的有机碱包括吡啶、1-甲基咪唑、三乙胺和4-二甲氨基吡啶中的一种或两种。

在一种具体的实施方式中，所述步骤2中的反应温度为0～40℃，优选步骤2中的反应温度为30～35℃；所述步骤2中的氢气压力为0～0.4Mpa，优选步骤2中的氢气压力为0.2～0.4MPa。

在一种具体的实施方式中，所述步骤3中的3α-羟基类固醇脱氢酶的使用形态为纯化酶或者细胞破碎后的酶液；所述步骤3中还原采用了助溶剂，助溶剂包括叔丁醇、异丙醇和二甲基亚砜中的一种。

在一种具体的实施方式中，所述步骤3中，反应溶液的PH值为6.5～8.0，反应温度为28～35℃，使用氢氧化钠水溶液调节pH值，氢氧化钠水溶液浓度为2％～10％。

在一种具体的实施方式中，所述步骤1具体包括：

在反应容器中加入无机酸、冰醋酸和起始物(9α,20S)-9-羟基-3-酮基孕甾-4-烯-20-羧酸甲酯，控温反应1～4h，TLC检测反应至完全；将反应液加入到冰水浴中，搅拌一段时间后过滤，用水淋洗至中性，将得到的滤饼湿品用二氯甲烷溶解，用氢氧化钠调PH值至中性，分液，收集有机层，减压浓缩，甲醇置换，最终浓缩至粘稠状态，过滤，滤饼干燥后得到化合物B1。

在一种具体的实施方式中，所述步骤2具体包括：在高压罐中加入反应溶剂，搅拌下加入起始物B1和钯碳，在氢气加压条件下反应一段时间，TLC检测反应至完全，过滤除钯碳，然后减压浓缩，用水置换，水析出料，水淋洗，滤饼干燥后得到化合物B1。

在一种具体的实施方式中，所述步骤3具体包括：

在反应瓶中加入水，搅拌下加入化合物A2和助溶剂，调节pH值，待化合物A2全部溶清后，调节反应温度，加入葡萄糖、3α-羟基类固醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、辅酶I；搅拌均匀后，调节pH后反应2～4小时，TLC监控化合物A2无明显剩余或不再减少；

将反应液进行真空浓缩至稠状，加入水，降温至5℃以下搅拌一段时间，过滤，得含蛋白的粗品；粗品用二氯甲烷和甲醇溶解，室温搅拌溶解，过滤，滤液浓缩至一定体积后用甲醇置换，降温至0～10℃，过滤，烘干得化合物3。

本发明的有益效果包括：

本发明以(20S)-9-羟基-3-酮基孕甾-4-烯-20-羧酸甲酯(SM)为起始原料，先进行9位α羟基消除，本路线反应过程中合成的化合物B1无△^8,9位双键的异构体，产品质量较好，收率较高，便于工业化放大。

在对中间体B1进行加氢反应时，本发明通过控制氢气压力选择性还原△^4,5位氢，而△^9,11位双键不受影响，同时选择合适的溶剂和温度减少5α-H副产物生成，进而主要生成5β-H的目标产物A2。

在对中间体A2的3-酮基还原过程中，本发明使用自构建的3α-羟基类固醇脱氢酶在适宜条件下，选择性地还原为3α-羟基，所得产物A3无3β羟基异构体，因此整体路线的收得率较原工艺大幅度提高，便于工业化生产。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明中产品化合物A3的核磁氢谱图。

图2为本发明中产品化合物A3的核磁碳谱图。

图3为本发明中产品化合物A3的HPLC图谱。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明中，起始原料(20S)-9-羟基-3-酮基孕甾-4-烯-20-羧酸甲酯(SM)购自湖南新合新生物医药有限公司，所述3α-羟基类固醇脱氢酶为自行构建的，来自睾酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)，所得酶的蛋白序列和基因序列见附录。葡萄糖脱氢酶，购自上海麦克林生化科技有限公司。辅酶I(NAD+)：氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，购自上海跃腾生物技术有限公司。其余试剂均为市售。

本发明中的反应投料比经常以重量体积比来表示反应比例，如无特别说明，该重量体积比是指反应原料的重量与反应试剂的重量或体积的比例。

起始原料(20S)-9-羟基-3-酮基孕甾-4-烯-20-羧酸甲酯为外购原料，其氢谱碳谱数据如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.83(d,J＝1.9Hz,1H),3.62(s,3H),2.47–2.35(m,5H),2.27(ddd,J＝15.2,5.1,1.9Hz,1H),1.88(tt,J＝11.3,5.6Hz,1H),1.80–1.62(m,5H),1.62–1.31(m,8H),1.29(s,3H),1.16(d,J＝6.9Hz,3H),1.14–0.98(m,1H),0.71(s,3H).¹³CNMR(101MHz,CDCl₃)δ199.10,177.09,168.96,126.70,76.26,52.59,51.39,48.97,44.32,42.39,42.29,37.39,34.79,34.03,31.80,28.45,27.04,26.70,25.30,24.08,19.88,17.07,11.27.

实施例1

化合物(20S)-3-酮基孕甾-4,9(11)-二烯-20-羧酸甲酯(B1)的制备

在洁净干燥的反应瓶中加入50.0ml水，冰水浴降温至0～10℃，搅拌下控温小于等于40℃，滴加368.0g浓硫酸，加入50.0ml冰醋酸和100.0g起始物(9α,20S)-9-羟基-3-酮基孕甾-4-烯-20-羧酸甲酯(即化合物SM)，将体系控温至35～40℃反应2h，TLC检测反应至完全。将体系加入到1500.0ml冰水浴中，加完后搅拌30分钟以上，过滤，用水淋洗至中性，将滤饼湿品用400.0ml二氯甲烷溶解，用氢氧化钠调PH至中性，分液，收集有机层，减压浓缩，甲醇置换，最终浓缩至粘稠状态，过滤，滤饼干燥至合格，得到92.4g化合物B1，纯度：99.8％。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.66(d,J＝1.8Hz,1H),5.43–5.36(m,1H),3.58(s,3H),2.56–2.32(m,4H),2.26(dt,J＝14.4,3.3Hz,1H),2.15–1.97(m,5H),1.92(dtd,J＝12.3,4.5,2.6Hz,1H),1.78–1.55(m,3H),1.26(s,3H),1.25–1.14(m,2H),1.12(d,J＝6.9Hz,3H),1.08–0.95(m,1H),0.60(s,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ199.18,177.06,169.90,144.60,123.87,118.72,52.81,52.33,51.34,42.40,41.51,40.86,40.81,37.24,34.21,33.71,32.84,32.10,27.44,26.06,25.26,16.69,11.64.

实施例2

化合物(5β,20S)-3-酮基孕甾-9(11)-烯-20-羧酸甲酯(A2)的制备

在洁净干燥的高压罐中加入100.0ml四氢呋喃，搅拌下加入10.0g起始物B1和1.0g的10％钯碳，在30～35℃用氢气加压至0.2Mpa反应16h，TLC检测反应至完全。将体系过滤除钯碳，然后减压浓缩，用水置换，水析出料，少量水淋洗，滤饼干燥至合格，得到9.8g化合物A2，核磁数据显示无△^9，11位加氢情况。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.47(dt,J＝5.0,2.3Hz,1H),3.61(s,3H),2.51(td,J＝14.3,5.6Hz,1H),2.45–2.33(m,2H),2.26(ddd,J＝14.3,5.9,2.5Hz,1H),2.19–2.06(m,3H),2.05–1.93(m,2H),1.93–1.81(m,2H),1.77–1.60(m,4H),1.52(td,J＝14.5,4.5Hz,1H),1.40–1.23(m,3H),1.15(d,J＝6.9Hz,3H),1.10(s,3H),0.59(s,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ213.30,177.16,139.54,119.33,53.02,52.91,51.33,44.60,43.73,42.44,41.62,41.05,38.82,38.22,37.45,36.30,28.87,27.48,26.46,26.38,25.30,16.71,11.78.

实施例3

化合物(5β,20S)-3-酮基孕甾-9(11)-烯-20-羧酸甲酯(A2)的制备

在洁净干燥的高压罐中加入100.0ml四氢呋喃，搅拌下加入10.0g起始物B1和1.0g的10％钯碳，在30～35℃用氢气加压至0.4Mpa反应9h，TLC检测反应至完全。将体系过滤除钯碳，然后减压浓缩，用水置换，水析出料，少量水淋洗，滤饼干燥至合格，得到9.8g化合物A2，核磁数据显示无△^9，11位加氢杂质。

通过调整氢气压力为0-0.4MPa，能使得反应过程只对化合物B1的△^4，5位双键加氢还原，而不会对△^9，11位双键有影响。

实施例4

化合物(5β,20S)-3-酮基孕甾-9(11)-烯-20-羧酸甲酯(A2)的制备

在洁净干燥的高压罐中加入100.0ml无水乙醇和100.0ml吡啶，搅拌下加入20.0g起始物B1和2.0g的10％钯碳，在30～35℃用氢气加压至0.4Mpa反应13h，TLC检测反应至完全。将体系过滤除钯碳，然后减压浓缩，用水置换，水析出料，少量水淋洗，滤饼干燥至合格，得到19.5g化合物A2，A2纯度：5α-H异构体纯度＝90.4：9.6。

实施例5

化合物(5β,20S)-3-酮基孕甾-9(11)-烯-20-羧酸甲酯(A2)的制备

在洁净干燥的高压罐中加入100.0ml无水乙醇、80.0ml吡啶和20.0ml的1-甲基咪唑，搅拌下加入20.0g起始物B1和2.0g的10％钯碳，在30～35℃用氢气加压至0.4Mpa反应16h，TLC检测反应至完全。将体系过滤除钯碳，然后减压浓缩，用水置换，水析出料，少量水淋洗，滤饼干燥至合格，得到19.3g化合物A2，A2纯度：5α-H异构体纯度＝92.5：7.5。

实施例6

化合物(5β,20S)-3-酮基孕甾-9(11)-烯-20-羧酸甲酯(A2)的制备

在洁净干燥的高压罐中加入100.0ml无水乙醇、100.0ml吡啶和2.0g的DMAP，搅拌下加入20.0g起始物B1和2.0g的10％钯碳，在30～35℃用氢气加压至0.4Mpa反应20h，TLC检测反应至完全。将体系过滤除钯碳，然后水析出料，少量水淋洗，滤饼干燥至合格，得到19.5g化合物A2，A2纯度：5α-H异构体纯度＝98.0：2.0。

项目	投料量(g)	产品干重(g)	A2纯度:5α异构体纯度	重量收率(％)
					实例4	20.0	19.5	90.4：9.6	97.5％
实例5	20.0	19.3	92.5：7.5	96.5％
					实例6	20.0	19.5	98.0：2.0	97.5％

通过对比确认：在0.4MPa氢气压力下，能只对△^4,5位双键加氢还原，不会对△^9,11位双键有影响。对比专利WO2017211820中制备的化合物A2纯度88％左右，异构体纯度5％左右，△^8,9位杂质4％左右；本发明中使用无水乙醇、吡啶和DMAP的组合方式能将5α-H异构体控制在2％左右，化合物A2纯度97％左右，也进一步说明了本发明获得的化合物A2纯度较高，杂质较小，收率较高，成本大大降低，有利于工业化稳定生产。

实施例7

化合物(3α,5β,20S)-3-酮基孕甾-9(11)-烯-20-羧酸甲酯(A3)的制备

在洁净的反应瓶中加入100ml水，搅拌下加入20.0g化合物A2(纯度：99.0％)和120.0ml叔丁醇，用2N氢氧化钠调节pH＝7.5～8.0，待化合物A2全部溶清后，调节反应温度30～35℃，加入40.0g葡萄糖、4.0g的3α-羟基类固醇脱氢酶液、10.0g葡萄糖脱氢酶、0.6g辅酶I(NAD+)。搅拌均匀后，用2N氢氧化钠溶液调节pH＝7～8反应，反应2～4小时，TLC监控化合物A2无明显剩余或不再减少(<0.5％)。

将反应液在80℃下进行真空浓缩至稠状，加入100ml水，降温至5℃下搅拌1小时，体系过滤，得含蛋白的粗品。粗品用20ml二氯甲烷和50ml甲醇溶解，室温搅拌溶解，加入1.0g活性炭40℃搅拌1小时，铺硅藻土过滤，滤液浓缩至小体积用甲醇置换2次，每次30ml，体系降温至0～10℃，过滤，烘干得白色固体17.7g，液相色谱纯度：98.8％。经过氢谱碳谱鉴别为目标化合物3。

¹H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.31(dt，J＝4.8，2.2Hz，1H)，3.66-3.59(m，1H)，3.64(s，3H)，2.42(dq，J＝10.4，6.8Hz，1H)，2.18-1.88(m，5H)，1.77-1.26(m，13H)，1.17(d，J＝6.8Hz，3H)，1.15-1.07(m，2H)，1.04(s，3H)，0.58(s，3H).¹³C NMR(101MHz，CDCl3)δ177.37，140.26，119.19，72.21，53.06，52.97，51.36，42.54，41.93，41.76，40.99，38.57，37.93，36.57，35.75，31.81，29.59，27.52，26.94，26.90，25.41，16.72，11.74.

下表为本发明中产品化合物A3的HPLC结果：

《峰表》

检测器ACh1

峰号	保留时间(min)	面积	高度	面积％	多离度(USP)	理论塔数(USH)	拖尾因子
								1	10.015	16702	557	0.942	--	2414	0.96
2	22.052	1751745	56664	98.790	14.71	11539	0.97
								3	23.913	4750	152	0.268	2.31	14711	1.39
总计		1773197	57372	100.000

自行构建的3α-羟基类固醇脱氢酶的基因序列为：

自行构建的3α-羟基类固醇脱氢酶的蛋白序列为：

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演和替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种植物源脱氧胆酸中间体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、以(20S)-9-羟基-3-酮基孕甾-4-烯-20-羧酸甲酯为起始原料，在无机酸和冰醋酸的作用下，脱水合成化合物B1；所述无机酸为硫酸；

步骤2、化合物B1在反应溶剂的作用下加氢还原生成化合物A2；所述反应溶剂包括四氢呋喃和无水乙醇中的一种；

2.根据权利要求1所述的植物源脱氧胆酸中间体的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的反应温度为0～60℃。

3.根据权利要求2所述的植物源脱氧胆酸中间体的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的反应温度为30～40℃。

4.根据权利要求1所述的植物源脱氧胆酸中间体的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的反应溶剂为无水乙醇。

5.根据权利要求1所述的植物源脱氧胆酸中间体的制备方法，其特征在于，所述步骤2中还添加了有机碱，所述步骤2中的有机碱包括吡啶、1-甲基咪唑、三乙胺和4-二甲氨基吡啶中的一种或两种。

6.根据权利要求1所述的植物源脱氧胆酸中间体的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的反应温度为0～40℃；所述步骤2中的氢气压力为0～0.4Mpa。

7.根据权利要求6所述的植物源脱氧胆酸中间体的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的反应温度为30～35℃；所述步骤2中的氢气压力为0.2～0.4MPa。

8.根据权利要求1所述的植物源脱氧胆酸中间体的制备方法，其特征在于，所述步骤3中的3α-羟基类固醇脱氢酶的使用形态为纯化酶或者细胞破碎后的酶液；所述步骤3中还原采用了助溶剂，助溶剂包括叔丁醇、异丙醇和二甲基亚砜中的一种。

9.根据权利要求1所述的植物源脱氧胆酸中间体的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，反应溶液的PH值为6.5～8.0，反应温度为28～35℃，使用氢氧化钠水溶液调节pH值，氢氧化钠水溶液浓度为2％～10％。

10.根据权利要求1所述的植物源脱氧胆酸中间体的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体包括：

11.根据权利要求1所述的植物源脱氧胆酸中间体的制备方法，其特征在于，所述步骤2具体包括：在高压罐中加入反应溶剂，搅拌下加入起始物B1和钯碳，在氢气加压条件下反应一段时间，TLC检测反应至完全，过滤除钯碳，然后减压浓缩，用水置换，水析出料，水淋洗，滤饼干燥后得到化合物B1。

12.根据权利要求1所述的植物源脱氧胆酸中间体的制备方法，其特征在于，所述步骤3具体包括：