CN111511755A - 脱氧胆酸的制备 - Google Patents

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CN111511755A CN201880083474.3A CN201880083474A CN111511755A CN 111511755 A CN111511755 A CN 111511755A CN 201880083474 A CN201880083474 A CN 201880083474A CN 111511755 A CN111511755 A CN 111511755A
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Abstract

本发明涉及用于制备脱氧胆酸(DCA)及其药学上可接受的盐的新的和改进的方法，以及DCA及其药学上可接受的盐，其碳原子部分或仅衍生自植物来源。

Description

脱氧胆酸的制备
技术领域
本发明涉及部分或仅衍生自植物来源的新型DCA产品及其药学上可接受的盐。本发明还涉及用于制备脱氧胆酸(DCA)及其药学上可接受的盐的新的和改进的方法。
背景技术
脱氧胆酸(DCA)是已知的药物化合物。DCA具有CAS号[83-44-3]，并且也被称为脱氧胆酸盐、胆酸和3α，12β-二羟基-5β-胆酸盐。纯DCA是白色至灰白色结晶粉末。
DCA是次级胆汁酸之一，其是肠道细菌的代谢副产物。
自发现以来，DCA已被用于人类医学的各个领域。在人体内，DCA被用于乳化脂肪以便在肠内吸收。另外，当注射到颏下脂肪中时，DCA有助于破坏脂肪细胞。在美国，DCA已被食品和药物管理局(FDA)批准用于减少颏下中度至重度脂肪，并以商标
Figure BDA0002552014940000011
上市。
Figure BDA0002552014940000012
由Kythera Biopharmaceuticals生产。
描述DCA减少脂肪性质的最近专利申请包括WO 2005/117900、WO 2005/112942、US2005/0261258、US 2005/0267080、US 2006/127468和US 2006/0154906。
含有胆汁酸的药物制剂可以以相当低的成本商购获得，因为胆汁酸容易从动物尸体(例如牛和羊)获得。
然而，从动物来源获得的胆汁酸可能含有病原体(例如朊病毒)或其它有害物质(例如毒素)。
来自动物来源的胆汁酸通常被纯化以排除杂质。实际上，这种纯化的组合物含有胆汁酸的混合物。例如，商购获得的动物来源的DCA组合物含有一些鹅去氧胆酸和胆酸。
因此，合成或从植物来源获得的胆汁酸(包括DCA)最近获得了越来越多的关注，因为上述与来自动物来源的胆汁酸相关的问题由此可以被消除。
因此，需要新的和有效的合成途径来制备胆汁酸(包括DCA)，其中起始化合物是植物来源的类固醇、甾醇或发酵的植物甾醇。
已知从通过分枝杆菌菌株发酵获得的植物甾醇起始制备DCA。例如，WO 2008/157635和WO 2013/044119描述了从9-羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮合成DCA:
Figure BDA0002552014940000021
然而，该方法涉及至少11个步骤和额外的纯化。此外，碳链(在位置17)在没有确定的立体化学的情况下产生。因此，总产率较低，这使得从工业角度来看该方法不太有吸引力。
WO 2008/157635和WO 2012/047495教导了从可的松和氢化可的松起始制备DCA。然而，这些方法涉及许多单独的步骤，并且此外，可的松和氢化可的松是相当昂贵的起始材料。
通过石油化学生产一些分子成本很高，例如，将氧结合到石化材料中的分子，其中化石-汽油的方式涉及相当大的金钱成本和生态成本。例如，丙二酸酯试剂，其中常见的起始材料是一氯乙酸，与廉价的、吨级可获得的并且提供真正有效的化学作用的多糖原材料相比，一氯乙酸不是廉价的起始材料。
从以上综述中可以理解，仍然需要提供以高产率和高纯度制备DCA的合成途径，并且其中起始化合物是植物来源的。此外，仍然需要提供从植物来源的起始化合物制备DCA的合成途径，其比现有技术中描述的那些更简单。
此外，需要部分或仅从植物来源制备DCA。
发明内容
在第一方面，本发明涉及式(DCA)的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐:
Figure BDA0002552014940000031
其中所述脱氧胆酸或其药学上可接受的盐包含小于3％的化石碳百分比，例如小于1％，例如小于0.1％，例如小于0.01％，并且其中所述脱氧胆酸的平均δ13C值在从-20‰至-40‰的范围内。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐的碳原子仅衍生自植物来源。
在另一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐的碳原子部分衍生自植物甾醇或植物甾醇衍生物。
在另一个实施方案中，脱氧胆酸的平均δ13C值在从-21‰到-35‰的范围内，例如从-20‰到-32‰，例如从-25‰到-28‰，例如大约-26‰。
在第二方面，本发明涉及式(DCA)的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002552014940000041
通过以下方式获得
i)提供通式Int A8的中间体：
Figure BDA0002552014940000042
和
ii)延长通式Int A8的化合物的碳链以获得脱氧胆酸(DCA):
Figure BDA0002552014940000043
其中所述化合物和中间体的所有碳原子都衍生自植物来源。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐包含小于3％的化石碳百分比，例如小于1％，例如小于0.1％，例如小于0.01％，和在从-20‰至-40‰范围内的平均δ13C值。
在另一个实施方案中，脱氧胆酸的平均δ13C值在从-21‰到-35‰的范围内，例如从-20‰到-32‰，例如从-25‰到-28‰，例如大约-26‰。
在另一个实施方案中，通式Int A8的化合物的碳链如下所述被延长为DCA：
i)将通式Int A8中的伯醇转化成离去基团(X)以获得通式Int A9的中间体：
Figure BDA0002552014940000051
其中X是OMs、OTs或卤素，优选Cl、Br或I；和
ii)延长通式Int A9的化合物的碳链以获得DCA：
Figure BDA0002552014940000052
在另一个实施方案中，通式Int A9的化合物被转化成Int A10，然后将Int A10转化成DCA。
Figure BDA0002552014940000053
其中R4为甲基或乙基。
在更进一步的实施方案中，Int A10被转化成Int A11，Int A11被转化成DCA。
Figure BDA0002552014940000061
在第三方面，本发明涉及通式Int A10的化合物
Figure BDA0002552014940000062
其中R4是甲基或乙基，并且其中化合物的碳原子仅衍生自植物来源。
在第四方面，本发明涉及通式Int A11的化合物
Figure BDA0002552014940000063
其中化合物的碳原子仅衍生自植物来源。
在第五方面，本发明涉及脱氧胆酸混合物，其包含如本文所述的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐和从动物来源获得的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐。
在第六方面，本发明涉及制备脱氧胆酸(DCA)或其药学上可接受的盐的方法，包括以下步骤：
i)提供通式SM-a的化合物：
Figure BDA0002552014940000064
ii)还原通式SM-a的化合物以获得通式Int A1的中间体:
Figure BDA0002552014940000071
iii)将通式Int A1的中间体转化成通式Int A2的中间体：
Figure BDA0002552014940000072
iv)将通式Int A2的中间体还原为通式Int A3的中间体：
Figure BDA0002552014940000073
v)将通式Int A3的中间体氧化成通式Int A5的中间体：
Figure BDA0002552014940000074
vi)将通式Int A5的中间体还原为通式Int A6的中间体：
Figure BDA0002552014940000081
vii)将通式Int A6的中间体还原为通式Int A7的中间体：
Figure BDA0002552014940000082
viii)将通式Int A7的化合物还原为通式Int A8的中间体：
Figure BDA0002552014940000083
ix)将通式Int A8中的伯醇转化成离去基团(X)以获得通式Int A9的中间体:
Figure BDA0002552014940000084
其中X是OMs、OTs或卤素，优选Cl、Br或I；
x)将通式Int A9的化合物转化成脱氧胆酸(DCA)：
Figure BDA0002552014940000091
通过途径P1的方法：
Pi)将通式Int A9的化合物转化成通式Int A10的化合物:
Figure BDA0002552014940000092
Pii)任选地，将通式Int A10的化合物转化成通式Int A11的化合物:
Figure BDA0002552014940000093
Piii)延长通式Int A10或Int A11的化合物的碳链以获得脱氧胆酸(DCA)或通过途径P2的方法：
Pi’)将通式Int A9转化成通式A10b的化合物
Figure BDA0002552014940000094
Pii’)水解通式Int A10b的化合物以得到脱氧胆酸(DCA)
x)任选地将脱氧胆酸转化成其药学上可接受的盐，
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
R3为H、R2或醇保护基团；
P为醇保护基团；
R4为甲基或乙基。
在一个实施方案中，使用丙二酸二乙酯将通式Int A9的化合物转化成通式IntA10的化合物，优选从植物来源(如糖发酵)获得。
在另一个实施方案中，乙腈由乙酸制备，所述乙酸是从植物来源(例如来自发酵过程)获得的。
在又一个实施方案中，通过回流氯化钠和通式Int A11的化合物的反应混合物来获得脱氧胆酸。
在又一个实施方案中，通过使通式Int A10的化合物与氢氧化钠反应获得脱氧胆酸。
在第七方面，本发明涉及通式Int A10的化合物
Figure BDA0002552014940000101
其中R5为甲基或乙基，并且
通过如本文所述的方法获得。
在第八方面，本发明涉及通式Int A11的化合物
Figure BDA0002552014940000102
通过如本文所述的方法获得。
在第九方面，本发明涉及通式Int A10b的化合物
Figure BDA0002552014940000111
通过如本文所述的方法获得；
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
P为醇保护基团；
R3为H、R2或醇保护基团2。
具体实施方式
定义
在本文中，通式I的化合物应理解为如下式Ia或Ib所示的化合物。
Figure BDA0002552014940000112
其中
R1是COOR2、CH2OP、CH2X、CH2CHO、CH2-CH2-OH、CH2-CH2OP或CH2-CH2X；
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
P是醇保护基团，条件是P不是Ac或Pv；
X是卤素原子；
Figure BDA0002552014940000121
是C-C键或C＝C键；
Figure BDA0002552014940000122
是＝O或
Figure BDA0002552014940000123
其中R3是P或R2；
OR4或者是OH或R4是A环中的C3碳；
在本文中，术语“C1-C6烷基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链饱和碳链。C1-C6烷基的具体实例为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基和异己基。优选的实例包括甲基、乙基、正丙基和异丙基，特别是甲基和乙基。最优选地，C1-C6烷基是甲基。
本文中，术语“C1-C6烷醇”是指具有1至6个碳原子的直链或支链饱和醇。C1-C6烷醇的具体实例是甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇、异戊醇、正己醇和异己醇。优选的实例包括甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇，特别是甲醇和乙醇。最优选地，C1-C6烷醇是甲醇。
术语“离去基团”旨在表示能够在杂合键裂解中带着一对电子离开分子的分子片段。离去基团的具体实例包括卤化物(例如氯化物、溴化物和碘化物)，以及磺酸酯(例如甲苯磺酸酯)。在本发明的优选实施方案中，所述离去基团是溴化物。
当在本文中使用时，术语“醇保护基团”意指可修饰并因此暂时掩蔽醇基团的特征化学性质的分子。醇保护基团的具体实例包括三甲基甲硅烷基醚(TMS)、三乙基甲硅烷基醚(TES)、三异丙基甲硅烷基醚(TIPS)、叔丁基二甲基甲硅烷基醚(TBS，TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基醚(TBDPS)、乙酰基(Ac，COCH3)、苯甲酰基(Bz)、苄基醚(Bn)、4-甲氧基苄基醚(PMB)、2-萘基甲基醚(Nap)、甲氧基甲基缩醛(MOM)、2-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、乙氧基乙基缩醛(EE)、甲氧基丙基缩醛(MOP)、苄氧基甲基乙缩醛(BOM)、四氢吡喃基乙缩醛(THP)、2,2,2-三氯乙基碳酸酯(Troc)、甲基醚、二甲氧基三苯甲基(DMT)、甲氧基三苯甲基(MMT)、甲硫基甲基醚、新戊酰基(Piv)、四氢吡喃基(THP)、三苯甲基(三苯甲基，Tr)和甲苯磺酰基(Ts)。在本发明的优选实施方案中，醇保护基为Ac，TBDMS和Ts，特别是Ac。
在本文中，“Ac”指乙酰基(COCH3)。
“药学上可接受的盐”是指所述盐是无毒的，并且适于施用于哺乳动物(特别是人类)。药学上可接受的盐的实例包括与碱的盐，例如与无机碱的盐(如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等)，或与有机碱的盐(如哌啶盐、吗啉盐、吡咯烷酮盐、精氨酸盐、赖氨酸盐等)。在本发明的优选实施方案中，药学上可接受的盐是钠盐。
“化石碳百分比”是指基于根据ASTM D6866-16的C14的测定值，从“合成”(石化)来源获得的碳百分比。
“生物基碳百分比”是指基于根据ASTM D6866-16的C14的测定值，从“天然”来源(如植物或动物副产品/来源)中获得的碳百分比。
“δ13C值”是指C13的δ标记的同位素测定值。δ13C值表示为与国际公认的PDB标准(来自南卡罗来纳州Pee Dee Belemnite地层中的碳酸盐)的每mil(％)偏差(例如每一千)。δ13C值使用以下公式确定:
Figure BDA0002552014940000131
“植物来源”意指任何可被定义为植物的来源，例如树、灌木、草本植物、草、蕨类、苔藓、花卉、蔬菜、杂草等，以及衍生自植物的化合物(例如植物甾醇和植物甾醇衍生物等)。
仅衍生自植物来源的碳原子是指化合物中的所有碳原子都衍生自如上定义的植物来源，而不是衍生自合成来源或动物来源。
部分衍生自植物来源的碳原子是指化合物中的至少一个碳原子不是衍生自如上定义的植物来源，而是衍生自例如合成来源或动物来源。
“非哺乳动物来源”是指可被定义为不是哺乳动物的任何来源。
“C3植物”是指没有光合适应性以减少光呼吸的植物。这包括例如水稻、小麦、大豆、大多数水果、大多数蔬菜和所有树木等植物。
“C4植物”是指光依赖反应和Calvin循环在物理上分离的植物，其中光依赖反应发生在叶肉细胞中，并且Calvin循环发生在束鞘细胞中。这包括例如马尾草、甘蔗、高粱和玉米等植物。
在整个文本中，脱氧胆酸和DCA可互换使用。
DCA的合成途径
本发明人已经提供了新的合成DCA的途径，其可以通过以下总反应方案来描述:
Figure BDA0002552014940000141
其中
R1是COOR2、CH2OH、CH2OP、CH2X、CH2CHO、CH2-CH2-OH、CH2-CH2OP或CH2-CH2X或CH2-CH2-CHO；
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
P为醇保护基团；
R3是P或R2；和
X是卤素原子；
下面更详细地公开了各个工艺步骤。
合成路径A
在本发明的优选实施方案中，制备脱氧胆酸(DCA)或其药学上可接受的盐的方法包括以下步骤：
i)提供通式SM-a的化合物：
Figure BDA0002552014940000151
ii)还原并任选地将醇保护基团加入到通式SM-a的化合物中以得到通式Int A1的中间体：
Figure BDA0002552014940000152
iii)将通式Int A1的中间体转化成通式Int A2的中间体：
Figure BDA0002552014940000153
iv)将通式Int A2的中间体还原为通式Int A3的中间体：
Figure BDA0002552014940000154
v)将通式Int A3的中间体氧化成通式Int A5的中间体：
Figure BDA0002552014940000161
vi)将通式Int A5的中间体还原为通式Int A6的中间体：
Figure BDA0002552014940000162
vii)将通式Int A6的中间体还原为通式Int A7的中间体：
Figure BDA0002552014940000163
viii)将通式Int A7的化合物还原为通式Int A8的中间体：
Figure BDA0002552014940000164
ix)延长通式Int A8的化合物的碳链以获得脱氧胆酸(DCA):
Figure BDA0002552014940000171
x)任选地将脱氧胆酸转化成其药学上可接受的盐，
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
R3为H、R2或醇保护基团。
步骤i)
所述起始化合物(中间体SM-a)，可以在合适的碳源存在下从偶然分支杆菌(Mycobacterium fortuitum)的发酵产物中获得(或容易地从获得的化合物中制备)。
例如，US 4,029,549显示了通过在谷甾醇(实施例2)或胆固醇、豆甾醇或菜油甾醇(实施例3)存在下发酵微生物偶然分枝杆菌NRRL B-8119来生产9α-OH BN酸、9α-OH BN醇和9α-OH BN甲酯。9α-OH BN酸的纯化和分离在US 4,029,549的实施例5中公开。
Figure BDA0002552014940000181
因此，在“合成途径A”中描述的步骤i)至vii)之前可以有一个步骤，该步骤包括在有氧条件下，在碳源存在下，在水性营养培养基中培养生产9α-OH BN酸的微生物。这比照适用于本文所述的其他合成途径，包括“合成途径C”、“合成途径D”、“合成途径E”和“合成途径F”。
所述生产9α-OH BN酸的微生物可以选自由如下组成的组：节杆菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、精蛋白杆菌属(Proaminobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、链霉菌属(Streptomyces)和分枝杆菌属(Mycobacterium)。在本发明的一个优选的实施方案中，所述生产9α-OH BN酸的微生物是分枝杆菌属，特别是偶然分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)。在本发明的最优选的实施方案中，所述生产9α-OH BN酸的微生物是偶然分枝杆菌NRRL B-8119。
碳源可以是类固醇，例如胆固醇、豆甾醇、菜油甾醇和谷甾醇或其全部的混合物，优选谷甾醇。
优选地，碳源可以是植物甾醇，例如谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇或混合物。在一个实施方案中，植物甾醇主要是大豆来源的。
可以理解，如果需要，9α-OH BN酸、9α-OH BN醇和9α-OH BN甲酯可以通过有机化学领域技术人员熟知的标准方法容易地转化成通式SM-a的化合物。
步骤ii)
步骤ii)涉及还原通式SM-a的化合物以获得通式Int A1的中间体。
该反应通常通过在50-90℃，优选约70℃的温度下，在钯/炭(Pd/C)存在下，将SM-a氢化1-24小时，优选8-16小时来进行。也可以使用其它过渡金属催化剂，例如Ni或Rh。
如果R3是H，则反应优选在极性非质子溶剂(如N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯(EtOAc)、丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈或二甲基亚砜(DMSO))中进行。在一个优选的实施方案中，所述极性非质子溶剂是DMF。
如果R3是C1-C6烷基，则反应在相应的醇中进行，即溶剂是C1-C6烷醇。在本发明的优选实施方案中，R3为甲基，且溶剂为甲醇。
步骤iii)
步骤iii)涉及转化通式Int A1的中间体以获得通式Int A2的中间体。
本领域技术人员将知晓合适的氧化剂，并且实例包括氧化铬(CrO3)和强酸(例如HI、HBr、HClO4、HCl、HClO3、H2SO4、HNO3，优选HCl或H2SO4，特别优选H2SO4)。反应通常在非极性溶剂(例如二氯甲烷(DCM))中进行，温度在0至90℃之间。
步骤iv)
步骤iv)涉及还原通式Int A2的中间体以获得通式Int A3的中间体。
本领域技术人员将知晓能够将酮还原成仲醇的合适的还原剂。优选地，还原剂是金属氢化物，例如LiAlH4、NaBH4、LiBH4或LiAlH(OtBu)3，特别是LiAlH(OtBu)3。
反应通常在极性非质子溶剂(例如N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯(EtOAc)、丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈或二甲基亚砜(DMSO)，特别是THF)中进行，温度在0至20℃之间。
步骤v)
步骤v)涉及氧化通式Int A3的中间体以获得通式Int A5的中间体。
本领域技术人员将知晓用于进行烯丙基氧化的合适的氧化剂，并且优选的实例包括氧化铬(CrO3)。其它合适的氧化剂包括叔丁基过氧化氢(t-BuO2H)、NaOCl、SeO2、氯铬酸吡啶盐(PCC)、BiCl3和V2O5。该反应通常在0至90℃的温度下在极性溶剂(如AcOH)中进行。
步骤vi)
步骤ii)涉及还原通式Int A5的中间体以获得通式Int A6的中间体。
该反应通常通过在50-90℃，优选约70℃的温度下，在钯/炭(Pd/C)存在下，将IntA5氢化1-24小时，优选8-16小时来进行。也可以使用其它过渡金属催化剂，例如Ni或Rh。
反应优选在极性非质子溶剂(如N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯(EtOAc)、丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈或二甲基亚砜(DMSO))中进行。在一个优选的实施方案中，极性非质子溶剂是EtOAc。
步骤viii)
步骤viii)涉及还原通式Int A7的中间体以获得通式Int A8的中间体。
本领域技术人员将知晓能够将羧酸或其酯还原为伯醇的合适的还原剂。优选地，还原剂是金属氢化物，例如LiAlH4、NaBH4、LiBH4或LiAlH(OtBu)3，特别是LiAlH4。
反应通常在极性非质子溶剂(例如N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃(THF)、乙酸乙酯(EtOAc)、丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈或二甲基亚砜(DMSO)，特别是THF)中进行，温度在0至50℃之间。
应该注意的是，可以以与下面步骤ix)中描述的类似方式，直接延长通式Int A7的中间体的碳链以获得通式Int B2的中间体。这可以通过“Reformatsky反应”来实现，即在合适的溶剂中，在Zn的存在下，通过使Int A7与Br-CH2-COOR2反应。
步骤ix)
步骤ix)涉及延长通式Int A8的化合物的碳链以获得DCA。
延长Int A8的碳链以获得DCA的不同合成途径是可能的:
用于延长Int A8的碳链以获得DCA的一种可能的途径包括步骤ix-a)和ix-b)：
ix-a)转化通式Int A8中的伯醇以获得通式Int A9的中间体:
Figure BDA0002552014940000211
其中X是OMs、OTs或卤素，优选Cl、Br或I，特别优选Br，
任选地，用二羧酸或二羧酸衍生物对Int A9进行酰化以获得Int A9a。
Figure BDA0002552014940000212
其中R3是-CO(CH2)nCOOH，其中n为从0至11的整数。在优选的实施方案中，n＝2，使得二羧酸为琥珀酸。Int A9中醇的酰化可以通过多种方式实现。例如，Int A9可以与酰卤、酸酐、酯反应，或与游离羧酸缩合。可选的，使用本领域已知的合适的偶联剂(例如DCC、DIC、EDAC·HCl、HATU、TBTU、BOP、PyBOP)，Int A9可以与羧酸偶联。该偶联可以在碱存在的情况下进行。
任选地，R3基团可以进一步被例如醇保护基团保护，或者R3可以是醇保护基团，以便获得Int A9、Int A9a或Int A9b的适当的延伸反应，从而获得有机化学领域技术人员已知的DCA。
任选地，Int A9a可进一步被保护以获得Int A9b。
Figure BDA0002552014940000221
其中P是如先前所定义的醇保护基团。
ix-b)延长通式Int A9、Int A9a或Int A9b的化合物的碳链以获得DCA:
Figure BDA0002552014940000222
可以通过卤化的方式将通式Int A8中伯醇转化成离去基团(X)。伯醇的卤化对于有机化学领域的技术人员是公知的，并且可以以各种方式实现。例如，通式Int A8的化合物可以用HX处理，其中X是Cl、Br或I，优选HBr。可选地，通式Int A8的化合物可以用CX4和三苯基膦(PPh3)处理，其中X是C1、Br或I，优选Br。在本发明的优选实施方案中，通过用CBr4和PPh3处理Int A8获得Int A9。
可选地，可以通过有机化学领域技术人员已知的方法进行通式Int A8的伯醇向离去基团(X)的转化，例如甲磺酰化或甲苯磺酰化。
用于获得DCA的Int A9、Int A9a或Int A9b的碳链的延长可以使用所谓的“丙二酸酯合成法”(参见Morrison和Boyd，Organic Chemistry，5th版,1987,pp.1060-1063)进行。在本发明的一个实施方案中，在碱，优选NaH的存在下，用丙二酸酯，优选丙二酸二乙酯处理Int A9、Int A9a或Int A9b，随后酸化以获得DCA。丙二酸酯优选得自天然来源，例如得自从糖发酵获得的丙二酸的酯化。因此，可以获得DCA，其中所有碳原子都是天然来源的并且仅来自植物来源。
作为实例，通过与丙二酸二乙酯进行酯化，Int A10可以被制备。
Figure BDA0002552014940000231
可选地，通过与丙二酸二甲酯进行酯化，导致与甲基(Me)而不是乙基(Et)的酯化，Int A10可以被制备。
在有效产生Int A11并且有机化学领域的技术人员已知的条件下，可以将Int A10进一步转化为Int A11，例如通过将Int A10与氢氧化钠反应。
Figure BDA0002552014940000232
在一个实施方案中，Int A9、Int A9a或Int A9b的碳链延长以获得DCA被定义为路径P1，其包括步骤Pi)，将通式Int A9、IntA9a或Int A9b的化合物转化为Int A10，任选步骤Pii)，将通式Int A10的化合物转化为Int A11，和步骤Piii)，将通式Int A10或Int A11的化合物转化为DCA。
在一个实施方案中，通式Int A10的化合物仅衍生自植物来源。在另一个实施方案中，通式Int A11的化合物仅从植物来源获得。
Int A10和Int A11都可以转化成DCA。可以通过本领域技术人员已知的各种方法来执行Int A11到DCA的转化，例如通过将氯化钠与Int A11的反应混合物回流。
可以使用其他方法来延长Int A9b中的碳链以获得DCA。在一个实施方案中，在碱存在的情况下，可以用乙腈(ACN)置换Int A9b中的离去基团X，以获得Int A10b。在另一个实施方案中，起始化合物可以是Int A9或Int A9a，而不是Int A9b。
Figure BDA0002552014940000241
ACN(pKa＝25)可以相当容易地去质子化，这是由于邻位腈对所得阴离子的感应和共振稳定作用。合适的碱包括但不限于NaH、KtOBu或NaNH2。乙腈可从乙酸中获得，如Bulletin of the Tomsk Polytechnic University.2007,vol.310,no.1,p.145-148中所述。
或者，可以如US 3,161,669中所述获得乙腈，其中反应器填充有10立方英尺的用25重量百分比的磷酸水溶液饱和的Harshaw Alumina 0104颗粒(1/4英寸大小)。氨和乙酸在450℃的温度下，以氨与乙酸的摩尔比为1.13:1进入反应室中。接触时间为4.5秒。每天进料5700磅乙酸和1820磅氨。乙腈的产量为每天3700磅或基于乙酸的95％产率。离开反应器的反应气体在水骤冷洗涤器中冷凝。将3700磅乙腈和4000磅水从洗涤器进料至蒸汽汽提塔，并从汽提塔底部除去3400磅水。在79℃从汽提塔抽取的塔顶馏出物包含3700磅乙腈和600磅水。将该塔顶物料进料至干燥塔，在那里使用苯作为分离剂，通过共沸蒸馏除去每天600磅的水。将来自干燥塔的干燥的乙腈塔底产物进料到蒸馏塔中，在那里低沸点杂质从塔顶除去。将来自该塔的乙腈塔底产物进料到最终的脱料塔中，最终纯化的乙腈产物从脱料塔塔顶馏出。纯化的乙腈具有81.3-83.1℃的ASTM沸程，10的APHA色度，0.016重量百分比的水含量，没有微量羰基或苯，并且通过色谱分析测定的总杂质小于0.1重量百分比。
乙酸容易从天然发酵获得，并且其可以被认为是天然来源，例如植物来源。在一个实施方案中，乙酸可以从丙酮中获得。丙酮可以例如使用来自梭菌类的菌株：丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)从葡萄糖或淀粉的细菌发酵中获得，例如由MarkR.Wilkins和Hasan Atiye(2012):“Fermentation”(In Nurhan Turgut Dunford.Food andIndustrial Bioproducts and Bioprocessing)描述的，通过与重铬酸钾和硫酸的氧化反应产生乙酸。
Int A10b中的腈可随后水解成游离羧酸，伴随或随后除去醇保护基团P以获得DCA。
Figure BDA0002552014940000251
在一个实施方案中，Int A9的碳链延长以获得DCA被定义为路径P2，其包括步骤Pi’)，将通式Int A9的化合物转化为Int A10b，和步骤Pii’)，将通式Int A10b的化合物转化为DCA。
为获得DCA，Int A9b中碳链延长的其它等同方式包括，用由乙酸酯(CH3COO-R)形成的烯醇化物取代Int A9b中的离去基团X，然后水解。可以使用衍生自乙酸的任何烯醇化物，例如乙酸酯和乙基酰胺的烯醇化物。乙酸优选从发酵过程中获得，即乙酸来自植物来源的天然来源。因此，可以获得DCA，其中所有碳原子都是天然来源的并且仅来自植物来源。
另一种延长Int A8碳链以获得DCA的可能路径包括步骤ix-c)至ix-e):
ix-c)氧化通式Int A8的化合物以获得通式Int B1的中间体:
Figure BDA0002552014940000252
ix-d)延长通式Int B1的化合物的碳链以获得通式Int B2的中间体:
Figure BDA0002552014940000261
其中R2为直链的或支链的C1-C6烷基；
ix-e)将通式Int B2的化合物转化成DCA。
关于步骤ix-c)，伯醇氧化成醛是有机化学领域的技术人员所熟知的，并且可以以各种方式实现。例如通过铬基试剂，例如Collins试剂、PDC或者PCC、或者通过NaOCl存在下的催化的TEMPO。
可以使用所谓的“Wittig反应”(参见Morrison和Boyd,Organic Chemistry,5th版,1987,pp.920-921)进行Int B1到Int B2的碳链延长(步骤ix-d)。可选地，碳延长步骤可以通过“Horner-Emmons烯化”、“Peterson烯化”或“Reformatsky反应”来实现，即在合适的溶剂中，在Zn的存在下，通过使Int B1与Br-CH2-COOR2反应。
将Int B2转化为DCA(步骤ix-e)可以通过对Int B2进行氢化，随后进行碱性水解来进行，或者反之亦然。
步骤x)
任选的步骤x)涉及将DCA转化为DCA的药学上可接受的盐。
药学上可接受的盐的实例包括与碱的盐，例如与无机碱的盐(如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐等)，或与有机碱的盐(如哌啶盐、吗啉盐、吡咯烷酮盐、精氨酸盐、赖氨酸盐等)。在本发明的优选实施方案中，药学上可接受的盐是钠盐。
在本发明的优选实施方案中，DCA的钠盐是通过DCA与NaOH反应获得的。
合成路径A’
在本发明的另一优选实施方案中，制备脱氧胆酸(DCA)或其药学上可接受的盐的方法包括以下步骤：
i)提供通式的化合物
Figure BDA0002552014940000271
ii)将通式Int A3的中间体氧化成通式Int A5的中间体：
Figure BDA0002552014940000272
iii)将通式Int A5的中间体还原为通式Int A6的中间体：
Figure BDA0002552014940000273
iv)将通式Int A6的中间体还原为通式Int A7的中间体：
Figure BDA0002552014940000281
v)将通式Int A7的化合物还原为通式Int A8的中间体：
Figure BDA0002552014940000282
vi)延长通式Int A8的化合物的碳链以获得脱氧胆酸(DCA):
Figure BDA0002552014940000283
vii)任选地将脱氧胆酸转化为其药学上可接受的盐，
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
R3为H、R2或醇保护基团。
上述步骤ii)至vii)完全对应于关于“合成路径A”讨论的步骤v)至x)。因此，关于“合成路径A”的步骤v)至x)提供的注释加以必要的修改适用于“合成路径A”的步骤ii)至vii)。
合成路径C
在本发明的另一个感兴趣的实施方案中，制备脱氧胆酸(DCA)或其药学上可接受的盐的方法包括以下步骤：
i)提供通式SM-a的化合物：
Figure BDA0002552014940000291
ii)将通式SM-a的化合物还原以获得通式Int A1的中间体:
Figure BDA0002552014940000292
iii)将通式Int A1的中间体转化成通式Int A2的中间体：
Figure BDA0002552014940000293
iv)将通式Int 2A的中间体氧化成通式Int C1的中间体：
Figure BDA0002552014940000294
v)将通式Int C1的中间体还原为通式Int C4的中间体：
Figure BDA0002552014940000301
vi)将通式Int C4的化合物还原为通式Int A8的中间体：
Figure BDA0002552014940000302
vii)延长通式Int A8的化合物的碳链以获得脱氧胆酸(DCA):
Figure BDA0002552014940000303
viii)任选地将脱氧胆酸转化为其药学上可接受的盐，
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
R3为H、R2或醇保护基团。
x)任选地将脱氧胆酸转化成其药学上可接受的盐，
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
合成路径D
在本发明的另一个感兴趣的实施方案中，制备脱氧胆酸(DCA)或其药学上可接受的盐的方法包括以下步骤：
i)提供通式SM-a的化合物：
Figure BDA0002552014940000311
ii)还原通式SM-a的化合物以获得通式Int A1的中间体:
Figure BDA0002552014940000312
iii)将通式A1的中间体转化成通式D1的中间体：
Figure BDA0002552014940000313
iv)将通式Int D1的中间体氧化成通式Int D2的中间体：
Figure BDA0002552014940000321
v)将通式Int D2的中间体还原为通式Int D3的中间体：
Figure BDA0002552014940000322
vi)将通式Int D3的中间体氧化成通式Int D5的中间体：
Figure BDA0002552014940000323
vii)将通式Int D5的中间体还原为通式Int D6的中间体：
Figure BDA0002552014940000324
viii)将通式Int D6的中间体还原为通式Int D7的中间体：
Figure BDA0002552014940000331
ix)将通式Int D7的化合物水解成通式Int D9的中间体：
Figure BDA0002552014940000332
x)延长通式Int D9的化合物的碳链以获得脱氧胆酸(DCA)：
Figure BDA0002552014940000333
xi)任选地将脱氧胆酸转化为其药学上可接受的盐，
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
R3为H、R2或醇保护基团；
且X为卤素原子。
合成路径D’
在本发明的另一个感兴趣的实施方案中，制备脱氧胆酸(DCA)或其药学上可接受的盐的方法包括以下步骤：
i)提供通式Int D3的化合物：
Figure BDA0002552014940000341
ii)将通式Int D3的中间体氧化成通式Int D5的中间体：
Figure BDA0002552014940000342
iii)将通式Int D5的中间体还原为通式Int D6的中间体：
Figure BDA0002552014940000343
iv)将通式Int D6的中间体还原为通式Int D7的中间体：
Figure BDA0002552014940000351
v)将通式Int D7的化合物水解成通式Int D9的中间体：
Figure BDA0002552014940000352
vi)延长通式Int D9的化合物的碳链以获得脱氧胆酸(DCA):
Figure BDA0002552014940000353
vii)任选地将脱氧胆酸转化为其药学上可接受的盐，
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
R3为H、R2或醇保护基团；
且X为卤素原子。
合成路径E
在本发明的另一个感兴趣的实施方案中，制备脱氧胆酸(DCA)或其药学上可接受的盐的方法包括以下步骤：
i)提供通式SM-a的化合物：
Figure BDA0002552014940000361
ii)将通式SM-a的化合物还原以获得通式SM-b的中间体：
Figure BDA0002552014940000362
iii)保护在位置22处的醇基以获得通式Int E1的中间体:
Figure BDA0002552014940000363
iv)将通式Int E1的化合物转化以获得通式Int E2的中间体：
Figure BDA0002552014940000364
v)将通式Int E2的中间体脱水成通式Int E3的中间体：
Figure BDA0002552014940000371
vi)将通式Int E3的中间体还原为通式Int E5的中间体：
Figure BDA0002552014940000372
vii)将通式Int E5的中间体氧化成通式Int E6的中间体：
Figure BDA0002552014940000373
viii)将通式Int E6的中间体还原为通式Int E7的中间体：
Figure BDA0002552014940000374
ix)将通式Int E7的中间体还原为通式Int E9的中间体：
Figure BDA0002552014940000381
x)延长通式Int E9的化合物的碳链以获得脱氧胆酸(DCA)：
Figure BDA0002552014940000382
x)任选地将脱氧胆酸转化成其药学上可接受的盐，
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
R3为H、R2或醇保护基团；并且
P是醇保护基团。
合成路径E’
在本发明的另一个感兴趣的实施方案中，制备脱氧胆酸(DCA)或其药学上可接受的盐的方法包括以下步骤：
i)提供通式Int E3的化合物：
Figure BDA0002552014940000383
ii)将通式Int E3的中间体还原为通式Int E5的中间体：
Figure BDA0002552014940000391
iii)将通式Int E5的中间体氧化成通式Int E6的中间体：
Figure BDA0002552014940000392
iv)将通式Int E6的中间体还原为通式Int E7的中间体：
Figure BDA0002552014940000393
v)将通式Int E7的中间体还原为通式Int E9的中间体：
Figure BDA0002552014940000394
vi)延长通式Int E9的化合物的碳链以获得脱氧胆酸(DCA):
Figure BDA0002552014940000401
vii)任选地将脱氧胆酸转化为其药学上可接受的盐，
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
R3为H、R2或醇保护基团；并且
P是醇保护基团。
合成路径F
在本发明的另一个感兴趣的实施方案中，制备脱氧胆酸(DCA)或其药学上可接受的盐的方法包括以下步骤：
i)提供通式SM-a的化合物：
Figure BDA0002552014940000402
ii)将通式SM-a的化合物还原以获得通式SM-b的中间体：
Figure BDA0002552014940000403
iii)保护在位置22处的醇基以获得通式Int E1的中间体:
Figure BDA0002552014940000411
iv)将通式Int E1的化合物转化为通式Int F2的中间体：
Figure BDA0002552014940000412
v)将通式Int F2的中间体还原为通式Int E3的中间体：
Figure BDA0002552014940000413
vi)将通式Int E3的中间体还原为通式Int E5的中间体：
Figure BDA0002552014940000414
vii)将通式Int E5的中间体氧化成通式Int E6的中间体：
Figure BDA0002552014940000421
viii)将通式Int E6的中间体还原为通式Int E7的中间体：
Figure BDA0002552014940000422
ix)将通式Int E7的中间体还原为通式Int E9的中间体：
Figure BDA0002552014940000423
x)延长通式Int E9的化合物的碳链以获得脱氧胆酸(DCA)：
Figure BDA0002552014940000424
x)任选地将脱氧胆酸转化成其药学上可接受的盐，
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
R3为H、R2或醇保护基团；并且
P是醇保护基团。
中间体化合物
起始化合物——通式SM的中间体
在另一方面，本发明涉及通式SM的化合物
Figure BDA0002552014940000431
其中
R1是COOR2、CH2OH、CH2X、CH2CHO、CH2-CH2-OH、CH2-CH2OP、CH2-CH2X或CH2-CH2-CHO；
R2是直链的或支链的C1-C6烷基，条件是R2不是CH3；
P是醇保护基团，条件是P不是Ac；并且
X是卤素原子；
在本发明的优选实施方案中，R1为COOR2或CH2X，其中R2选自由如下组成的组：乙基、正丙基和异丙基，特别是乙基，以及X选自由如下组成的组：C1、Br和I，特别是Br。
因此，在本发明的一个特别感兴趣的实施方案中，R1是COOC2H5，在本发明的另一个特别感兴趣的实施方案中R2是CH2Br。
这种化合物可以在合适的碳源存在下从偶然分枝杆菌的发酵产物中获得(或容易地从获得的化合物中制备)。
例如，US 4，029，549显示了通过在谷甾醇(实施例2)或胆固醇、豆甾醇或菜油甾醇(实施例3)存在下发酵微生物偶然分枝杆菌NRRL B-8119来生产9α-OH BN酸、9α-OH BN醇和9α-OH BN甲酯。9α-OH BN酸的纯化和分离在US 4,029,549的实施例5中公开。
Figure BDA0002552014940000441
因此，本文所述的步骤I)至VI)之前可以有一个步骤，该步骤包括在有氧条件下，在碳源存在下，在水性营养培养基中培养生产9α-OH BN酸的微生物。
所述生产9α-OH BN酸的微生物可以选自由如下组成的组：节杆菌属(Arthrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、精蛋白杆菌属(Proaminobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、链霉菌属(Streptomyces)和分枝杆菌属(Mycobacterium)。在本发明的优选实施方案中，所述生产9α-OH BN酸的微生物是分枝杆菌属，特别是偶然分枝杆菌。在本发明的最优选的实施方案中，所述生产9α-OH BN酸的微生物是偶然分枝杆菌NRRL B-8119。
碳源可以是类固醇，例如胆固醇、豆甾醇、菜油甾醇和谷甾醇，优选谷甾醇。
可以理解，如果需要，9α-OH BN酸、9α-OH BN醇和9α-OH BN甲酯可以通过有机化学领域技术人员熟知的标准方法容易地转化成通式SM的化合物。
通式INT 1的中间体
在又进一步的方面，本发明涉及通式INT 1的化合物
Figure BDA0002552014940000451
其中
R1是COOR2、CH2OH、CH2OP、CH2X、CH2CHO、CH2-CH2-OH、CH2-CH2OP或CH2-CH2X或CH2-CH2-CHO；
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
P为醇保护基团；
R3是P或R2；和
X是卤素原子；
在本发明的一个优选实施方案中，R1为COOR2、CH2X、CH2OH或CH2OP，其中R2为H或选自由如下组成的组：甲基、乙基、正丙基和异丙基，特别是H或甲基，并且X选自由如下组成的组：C1、Br和I，特别是Br。
在本发明的一个更优选的实施方案中，R1为COOR2、CH2X、CH2OH或CH2OP，其中R2为H或甲基，并且X为Br。
在本发明的一个更优选的实施方案中，R1为COOR2，其中R2为H或选自由如下组成的组：甲基、乙基、正丙基和异丙基，特别是H或甲基，并且X选自由如下组成的组：C1、Br和I，特别是Br。
因此，在本发明的一个特别感兴趣的实施方案中，R1是COOH或COOCH3，和R3是H或CH3CO。具体的实例包括其中R1是COOH且R3是H、其中R1是COOCH3且R3是H、其中R1是COOH且R3是CH3CO、以及其中R1是COOCH3且R3是CH3CO的实施方案。
在本发明的另一个高度优选的实施方案中，R1是CH2OH且R3是H或CH3CO。
在本发明的一个进一步高度优选的实施方案中，R1是CH2X且R3是H或CH3CO，并且X选自由如下组成的组：C1、Br和I，特别是Br。具体的实例包括其中R1是CH2Br且R3是H、和其中R1是CH2Br且R3是CH3CO的实施方案。
在本发明的一个更进一步高度优选的实施方案中，R1是CH2OP且R3是H或CH3CO，其中P选自由如下组成的组：三甲基甲硅烷基醚(TMS)、三乙基甲硅烷基醚(TES)、三异丙基甲硅烷基醚(TIPS)、叔丁基二甲基甲硅烷基醚(TBS，TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基醚(TBDPS)、乙酰基(Ac，COCH3)、苯甲酰基(Bz)、苄基醚(Bn)、4-甲氧基苄基醚(PMB)、2-萘基甲基醚(Nap)、甲氧基甲基缩醛(MOM)、2-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、乙氧基乙基缩醛(EE)、甲氧基丙基缩醛(MOP)、苄氧基甲基乙缩醛(BOM)、四氢吡喃基乙缩醛(THP)、2,2,2-三氯乙基碳酸酯(Troc)、甲基醚、二甲氧基三苯甲基(DMT)、甲氧基三苯甲基(MMT)、甲硫基甲基醚、新戊酰基(Piv)、四氢吡喃基(THP)、三苯甲基(三苯甲基，Tr)，和甲苯磺酰基(Ts)，特别是Ac、TBDMS和Ts。因此，具体实施方式包括其中R1是CH2OAc且R3是H、其中R1是CH2OAc且R3是CH3CO、其中R1是CH2OTBDMS且R3是H、其中R1是CH2OTBDMS且R3是CH3CO、其中R1是CH2OT且R3是H、和其中R1是CH2OT且R3是CH3CO的实例。
如本文所述，通过有机化学领域技术人员熟知的方法，通式INT 1的化合物可以通过还原通式SM的化合物而容易地制备。
通式INT 2的中间体
在又进一步的方面，本发明涉及通式INT 2的化合物
Figure BDA0002552014940000461
其中
R1是COOR2、CH2OH、CH2OP、CH2X、CH2CHO、CH2-CH2-OH、CH2-CH2OP、CH2-CH2X或CH2-CH2-CHO；
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
P是醇保护基团；并且
X是卤素原子。
在本发明的优选实施方案中，R1为COOR2、CH2X、CH2OH或CH2OP，其中R2为H或选自由如下组成的组：甲基、乙基、正丙基和异丙基，特别是甲基，并且X选自由如下组成的组：C1、Br和I，特别是Br。
在本发明的一个更优选的实施方案中，R1为COOR2、CH2X、CH2OH或CH2OP，其中R2为甲基，并且X为Br。
因此，在本发明的一个特别感兴趣的实施方案中，R1是COOCH3。在本发明的另一个特别感兴趣的实施方案中，R1是CH2Br。在本发明的一个进一步特别感兴趣的实施方案中，R1是CH2OH。
在本发明的一个进一步高度优选的实施方案中，R1是CH2OP，其中P选自由如下组成的组：三甲基甲硅烷基醚(TMS)、三乙基甲硅烷基醚(TES)、三异丙基甲硅烷基醚(TIPS)、叔丁基二甲基甲硅烷基醚(TBS，TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基醚(TBDPS)、乙酰基(Ac，COCH3)、苯甲酰基(Bz)、苄基醚(Bn)、4-甲氧基苄基醚(PMB)、2-萘基甲基醚(Nap)、甲氧基甲基缩醛(MOM)、2-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、乙氧基乙基缩醛(EE)、甲氧基丙基缩醛(MOP)、苄氧基甲基乙缩醛(BOM)、四氢吡喃基乙缩醛(THP)、2,2,2-三氯乙基碳酸酯(Troc)、甲基醚、二甲氧基三苯甲基(DMT)、甲氧基三苯甲基(MMT)、甲硫基甲基醚、新戊酰基(Piv)、四氢吡喃基(THP)、三苯甲基(三苯甲基，Tr)，和甲苯磺酰基(Ts)，特别是Ac、TBDMS和Ts。因此，具体实施方案包括其中R1是CH2OAc、其中R1是CH2OTBDMS、和其中R1是CH2OTs的实施例。
如本文所述，通过有机化学领域技术人员熟知的方法，通式INT 2的化合物可以通过氧化通式INT 1的化合物而容易地制备。
通式INT 3的中间体
在更进一步的方面，本发明涉及通式INT 3的化合物
Figure BDA0002552014940000481
其中
R1是COOR2、CH2OH、CH2OP、CH2X、CH2CHO、CH2-CH2-OH、CH2-CH2OP、CH2-CH2X或CH2-CH2-CHO；
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
P为醇保护基团；
R3是P或R2；和
X是卤素原子；
条件是，当R3是H时，R1不是CH2-CH2-OH；当R3是Ac时，R1不是CH2-CH2OAc；和当R3是Ac时，R1不是COOCH3。
在本发明的一个优选实施方案中，R1为COOR2、CH2X、CH2OH或CH2OP，其中R2选自由如下组成的组：乙基、正丙基和异丙基，特别是乙基，并且X选自由如下组成的组：C1、Br和I，特别是Br。
在本发明的一个特别感兴趣的实施方案中，R1是COOCH3，和R3是H。
在本发明的另一个感兴趣的实施方案中，R1为CH2X，其中X选自由如下组成的组：Cl、Br和I，并且R3为H或Ac。具体的实例是其中X为Br且R3为H，和其中X为Br且R3为Ac。
在本发明的另一个感兴趣的实施方案中，R1是CH2OP且R3是H或CH3CO，其中P选自由如下组成的组：三甲基甲硅烷基醚(TMS)、三乙基甲硅烷基醚(TES)、三异丙基甲硅烷基醚(TIPS)、叔丁基二甲基甲硅烷基醚(TBS，TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基醚(TBDPS)、乙酰基(Ac，COCH3)、苯甲酰基(Bz)、苄基醚(Bn)、4-甲氧基苄基醚(PMB)、2-萘基甲基醚(Nap)、甲氧基甲基缩醛(MOM)、2-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、乙氧基乙基缩醛(EE)、甲氧基丙基缩醛(MOP)、苄氧基甲基乙缩醛(BOM)、四氢吡喃基乙缩醛(THP)、2,2,2-三氯乙基碳酸酯(Troc)、甲基醚、二甲氧基三苯甲基(DMT)、甲氧基三苯甲基(MMT)、甲硫基甲基醚、新戊酰基(Piv)、四氢吡喃基(THP)、三苯甲基(三苯甲基，Tr)，和甲苯磺酰基(Ts)，特别是Ac、TBDMS和Ts。因此，具体实施方式包括其中R1是CH2OAc且R3是H、其中R1是CH2OAc且R3是CH3CO、其中R1是CH2OTBDMS且R3是H、其中R1是CH2OTBDMS且R3是CH3CO、其中R1是CH2OT且R3是H、和其中R1是CH2OT且R3是CH3CO的实例。
如本文所述，通过有机化学领域技术人员熟知的方法，通式INT 3的化合物可以通过还原通式INT 2的化合物而容易地制备。
可以理解，本文公开的中间体可用于制备DCA及其药学上可接受的盐。由于本文所述的合成路径允许在位置12中引入-OH基团，可以预期的是，相同的中间体也适合于制备其它胆汁酸，所述胆汁酸在位置7中包括-OH基团。这种胆汁盐的具体实例包括胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸或其药学上可接受的盐。
来自植物来源的生物基DCA
由上述方法制备的DCA可以优选为生物基DCA，其中DCA的原子来自植物来源。这可以通过提供植物来源的式SM-a的化合物，并通过使用仅从植物来源获得的化合物来修饰和延长该化合物来获得。在一个实施方案中，用于将式SM-a的化合物修饰成DCA的化合物来自加工植物产品获得的废物，例如来自糖发酵的多糖。
在一个实施方案中，DCA或DCA的药学上可接受的盐的碳原子仅来自植物来源。因此，DCA或DCA的药学上可接受的盐的所有碳原子都衍生自植物。
在另一个实施方案中，DCA或DCA的药学上可接受的盐的碳原子部分源自C3植物的植物来源。在另一个实施方案中，DCA或DCA的药学上可接受的盐的碳原子主要源自为C3植物的植物来源。在进一步的实施方案中,DCA或DCA的药学上可接受的盐的碳原子仅源自为C3植物的植物来源，即DCA或DCA的药学上可接受的盐的所有碳原子都衍生自C3植物。
在另一个实施方案中，DCA或DCA的药学上可接受的盐的碳原子部分源自植物甾醇或植物甾醇衍生物。
在进一步的实施方案中，DCA或DCA的药学上可接受的盐的碳原子部分源自植物甾醇、植物甾醇衍生物和C3植物。在进一步的实施方案中，DCA或DCA的药学上可接受的盐的碳原子主要源自植物甾醇、植物甾醇衍生物和C3植物。在进一步的实施方案中,DCA或DCA的药学上可接受的盐的碳原子仅源自植物甾醇、植物甾醇衍生物和C3植物，即DCA或DCA的药学上可接受的盐的所有碳原子都衍生自植物甾醇、植物甾醇衍生物和C3植物。
在另一个实施方案中，DCA或DCA的药学上可接受的盐的碳原子部分源自非哺乳动物来源。在进一步的实施方案中，DCA或DCA的药学上可接受的盐的碳原子主要源自非哺乳动物来源。在进一步的实施方案中,DCA或DCA的药学上可接受的盐的碳原子仅源自非哺乳动物来源，即DCA或DCA的药学上可接受的盐的所有碳原子都不衍生自哺乳动物。
化合物的来源可以根据化合物中C14和C13的含量来确定。碳原子天然存在于三种不同的同位素中：C12、C13和C14。C12占99％，C13占1％，C14以微量存在。C12和C13都是稳定的，而C14是碳的放射性同位素。
C14可用于证明源自“天然”(植物或动物副产品)来源(即生物基碳),或“合成”(石化)来源(即化石碳)的碳原子的百分比。因此，化石碳百分比是衍生自“合成”来源的碳原子占碳原子总数的百分比，而生物基碳百分比是衍生自“天然”来源的碳原子占碳原子总数的百分比。因此，化石碳百分比和生物基碳百分比的总和将是100％。
与同在US 8,242,294B2中描述的ppt测定相比，将C14区分为由百分比定义的“天然”或“合成”来源是一种常见的表征方式。此外，使用ASTM D6866方法的C14含量的测定将仅以百分比而不是以ppt来显示C14含量。
在本发明的一个方面，生物基DCA将是DCA分子，其中至少90％的碳原子衍生自天然来源。在进一步的实施方案中，生物基DCA将是DCA分子，其中至少95％的碳原子衍生自天然来源。在进一步的实施方案中，生物基DCA将是DCA分子，其中至少97％的碳原子衍生自天然来源。在进一步的实施方案中，生物基DCA是DCA分子，其中至少99％的碳原子衍生自天然来源。在进一步的实施方案中，生物基DCA是DCA分子，其中基本上所有的碳原子都衍生自天然来源。在进一步的实施方案中，生物基DCA是DCA分子，其中所有碳原子都衍生自天然来源。
在本发明的进一步的方面中，来自植物来源的生物基DCA将是DCA分子，其中至少90％的碳原子衍生自为植物的天然来源。在本发明的进一步的方面中，来自植物来源的生物基DCA将是DCA分子，其中至少95％的碳原子衍生自为植物的天然来源。在本发明的进一步的方面中，来自植物来源的生物基DCA将是DCA分子，其中至少97％的碳原子衍生自植物的天然来源。在本发明的进一步的方面中，来自植物来源的生物基DCA将是DCA分子，其中至少99％的碳原子衍生自为植物的天然来源。在本发明的进一步的方面中，来自植物来源的生物基DCA将是DCA分子，其中基本上所有的碳原子都衍生自为植物的天然来源。在本发明的进一步的方面中，来自植物来源的生物基DCA将是DCA分子，其中所有碳原子衍生自为植物的天然来源。
在本发明的进一步的方面中，来自非哺乳动物来源的生物基DCA将是DCA分子，其中至少90％的碳原子衍生自为非哺乳动物的天然来源。在本发明的进一步的方面中，来自非哺乳动物来源的生物基DCA将是DCA分子，其中至少95％的碳原子衍生自为非哺乳动物的天然来源。在本发明的进一步的方面中，来自非哺乳动物来源的生物基DCA将是DCA分子，其中至少97％的碳原子衍生自为非哺乳动物的天然来源。在本发明的进一步的方面中，来自非哺乳动物来源的生物基DCA将是DCA分子，其中至少99％的碳原子衍生自为非哺乳动物的天然来源。在本发明的进一步的方面中，来自非哺乳动物来源的生物基DCA将是DCA分子，其中基本上所有的碳原子都衍生自为非哺乳动物的天然来源。在本发明的进一步的方面中，来自非哺乳动物来源的生物基DCA将是DCA分子，其中所有碳原子衍生自为非哺乳动物的天然来源。
区分“天然”和“合成”来源的一种方法是使用根据ASTM D6866-16方法B(AMS)测定的生物基碳含量％(％Biobased Carbon Content)。已经开发了其它标准，但是用于使用不同标准测定放射性碳含量的分析过程是相同的。唯一的差异是报告格式。通常使用标准化术语“生物基碳％”来报告结果。当结果代表所有存在的碳(总碳)而不仅仅是有机碳(总有机碳)时，只有ASTM D6866使用术语“生物源碳％(％biogenic carbon)”。
100％生物基碳或生物源碳的值表示100％的碳来自生活在天然环境中的植物或动物副产品(生物质)，而0％的值表示所有的碳都衍生自石化产品、煤和其他化石来源。0-100％之间的值表示化石碳和生物基碳的混合物。该值越高，生物基碳(即材料中天然来源的成分)的比例就越大。
在一个实施方案中，脱氧胆酸中的化石碳百分比小于10％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸中的化石碳百分比小于9％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸中的化石碳百分比小于8％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸中的化石碳百分比小于7％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸中的化石碳百分比小于6％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸中的化石碳百分比小于5％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸中的化石碳百分比小于4％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸中的化石碳百分比小于3％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸中的化石碳百分比小于2％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸中的化石碳百分比小于1％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸中的化石碳百分比小于0.1％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸中的化石碳百分比小于0.01％。
在一个实施方案中，脱氧胆酸的药学上可接受的盐中的化石碳百分比小于10％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸的药学上可接受的盐中的化石碳百分比小于9％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸的药学上可接受的盐中的化石碳百分比小于8％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸的药学上可接受的盐中的化石碳百分比小于7％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸的药学上可接受的盐中的化石碳百分比小于6％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸的药学上可接受的盐中的化石碳百分比小于5％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸的药学上可接受的盐中的化石碳百分比小于4％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸的药学上可接受的盐中的化石碳百分比小于3％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸的药学上可接受的盐中的化石碳百分比小于2％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸的药学上可接受的盐中的化石碳百分比小于1％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸的药学上可接受的盐中的化石碳百分比小于0.1％。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸的药学上可接受的盐中的化石碳百分比小于0.01％。
C14的量也可以用于脱氧胆酸和其药学上可接受的盐的表征。该测定可以使用标准技术和可能的气体电离检测器来执行。
通过测定δ13C值甚至可以进一步区分碳原子的来源，例如在US 8,076,156和D.M.O’Brien的“Stable Isotope Ratios as biomarkers of diet for healthresearch”,Annual Reviews(www.annualreviews.org),2015中所公开的。所述δ-值的出现是因为C13是相对于一种基于白垩纪海洋化石的Pee Dee Belemnite标准来测定的，这种化石具有异常高的C13。
生化反应排斥13C，这就是为什么生物材料中12C的浓度增加的原因。以这种方式，可以使用纯化合物作为参考值来区分不同来源(例如植物和动物)，如来自Guibert et al.的Thermo Scientific:“Detection of Squalene and Squalane Origin with FlashElemental Analyzer and Delta V Isotope Ratio Mass Spectrometer”(2013)的Application Note 30276中所述。
由于植物的光合生理不同，植物的δ13C值也可能不同。这可以通过C3植物(如小麦、水稻、豆类、大多数水果和蔬菜)显示出比C4植物(如玉米、甘蔗和高粱)更高的δ13C值来观察(D.M.O’Brien的“Stable Isotope Ratios as biomarkers of diet for healthresearch”,Annual Reviews(www.annualreviews.org),2015)。
在一个实施方案中，脱氧胆酸显示出不同于从动物来源获得的脱氧胆酸的δ13C值的δ13C值。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸显示出不同于从哺乳动物来源获得的脱氧胆酸的δ13C值的δ13C值。动物来源可以是牛和羊。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐具有在-20‰至-40‰范围内的平均δ13C值。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐具有在-21‰至-35‰范围内的平均δ13C值。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐具有在-20‰至32‰范围内的平均δ13C值。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐具有在-25‰至-28‰范围内的平均δ13C值。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐具有约-26‰的平均δ13C值。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐具有不同于约-12‰的平均δ13C值的平均δ13C值。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐具有不同于在-10‰至-14‰范围内的平均δ13C值的平均δ13C值。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐不包含动物来源的杂质。在进一步的实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐不包含其他胆酸。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐仅衍生自植物来源，包含小于3％的化石碳百分比，并且具有不同于从动物来源获得的脱氧胆酸的平均δ13C值的平均δ13C值。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐仅衍生自植物来源，包含小于1％的化石碳百分比，并且具有不同于从动物来源获得的脱氧胆酸的平均δ13C值的平均δ13C值。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐仅衍生自植物来源，包含小于0.1％的化石碳百分比，并且具有不同于从动物来源获得的脱氧胆酸的平均δ13C值的平均δ13C值。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐仅衍生自植物来源，包含小于0.01％的化石碳百分比，并且具有不同于从动物来源获得的脱氧胆酸的平均δ13C值的平均δ13C值。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐衍生自植物甾醇或植物甾醇衍生物，包含小于3％的化石碳百分比，并且具有在-21‰至-35‰范围内的平均δ13C值。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐衍生自植物甾醇或植物甾醇衍生物，包含小于1％的化石碳百分比，并且具有在-21‰至-35‰范围内的平均δ13C值。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐衍生自植物甾醇或植物甾醇衍生物，包含小于0.1％的化石碳百分比，并且具有在-21‰至-35‰范围内的平均δ13C值。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐衍生自植物甾醇或植物甾醇衍生物，包含小于0.01％的化石碳百分比，并且具有在-21‰至-35‰范围内的平均δ13C值。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐衍生自植物甾醇或植物甾醇衍生物，包含小于3％的化石碳百分比，并且具有不同于从动物来源获得的脱氧胆酸的平均δ13C值的平均δ13C值。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐衍生自植物甾醇或植物甾醇衍生物，包含小于1％的化石碳百分比，并且具有不同于从动物来源获得的脱氧胆酸的平均δ13C值的平均δ13C值。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐仅衍生自植物甾醇或植物甾醇衍生物，包含小于0.1％的化石碳百分比，并且具有不同于从动物来源获得的脱氧胆酸的平均δ13C值的平均δ13C值。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐仅衍生自植物甾醇或植物甾醇衍生物，包含小于0.01％的化石碳百分比，并且具有不同于从动物来源获得的脱氧胆酸的平均δ13C值的平均δ13C值。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐仅衍生自植物来源，包含小于3％的化石碳百分比，并且具有在-21‰至-35‰范围内的平均δ13C值。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐仅衍生自植物来源，包含小于1％的化石碳百分比，并且具有不同于在-21‰至-35‰范围内的平均δ13C值的平均δ13C值。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐仅衍生自植物来源，包括小于0.1％的化石碳百分比，并且具有在-21‰至-35‰范围内的平均δ13C值。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐仅衍生自植物来源，包含小于0.01％的化石碳百分比，并且具有不同于在-21‰至-35‰范围内的平均δ13C值的平均δ13C值。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐衍生自植物甾醇或植物甾醇衍生物，包含小于1％的化石碳百分比，具有不同于从动物来源获得的脱氧胆酸的平均δ13C值的平均δ13C值，并且不包含动物来源的杂质。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐仅衍生自植物甾醇或植物甾醇衍生物，包含小于0.1％的化石碳百分比，具有不同于从动物来源获得的脱氧胆酸的平均δ13C值的平均δ13C值，并且不包含动物来源的杂质。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐仅衍生自植物来源，包含小于1％的化石碳百分比，具有不同于在-21‰至-35‰范围内的平均δ13C值的平均δ13C值，并且不包含动物来源的杂质。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐仅衍生自植物来源，包含小于0.1％的化石碳百分比，具有在-21‰至-35‰范围内的平均δ13C值，并且不包含动物来源的杂质。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐衍生自植物甾醇或植物甾醇衍生物，包含小于1％的化石碳百分比，具有不同于从动物来源获得的脱氧胆酸的平均δ13C值的平均δ13C值，并且不包含其他胆酸。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐仅衍生自植物甾醇或植物甾醇衍生物，包含小于0.1％的化石碳百分比，具有不同于从动物来源获得的脱氧胆酸的平均δ13C值的平均δ13C值，并且不包含其他胆酸。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐仅衍生自植物来源，包含小于1％的化石碳百分比，具有不同于在-21‰至-35‰范围内的平均δ13C值的平均δ13C值，并且不包含其他胆酸。
在一个实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐仅衍生自植物来源，包括小于0.1％的化石碳百分比，具有在-210‰至-35‰范围内的平均δ13C值，并且不包含其他胆酸。
在又一个进一步的实施方案中，脱氧胆酸或其药学上可接受的盐可以进一步与衍生自动物来源的脱氧胆酸区分开来。脱氧胆酸或其药学上可接受的盐可以通过其它天然存在的同位素(如氢同位素)的差异来区分，其模式可能不同于衍生自动物来源的DCA和部分或仅从植物来源合成的DCA。
在进一步的实施方案中，衍生自动物来源的DCA和部分或仅从植物来源合成的DCA可以通过其他适用的标记物来区分。
可以使用PCR(聚合酶链式反应)来表征潜在的适用标记物，例如通过检测从动物来源获得的DCA中可能的杂质。
实施例
实施例1
Figure BDA0002552014940000571
将40g化合物SM1(106.80mmol)悬浮在150ml DMF中，然后加入2.77g干燥的10％Pd/C。将反应混合物在70℃下搅拌并氢化(3.5atm)过夜。通过
Figure BDA0002552014940000572
过滤混合物。然后，将混合物倒入水中形成沉淀。将沉淀滤出为白色固体，用水洗涤并在真空下干燥，由此产生39.3g化合物A1。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.56(s,3H)；2.30(m,1H)；1.10(d,3H)；0.87(s,3H)；0.62(s,3H).
实施例2
Figure BDA0002552014940000581
将20g化合物SM1(53.40mmol)悬浮在150ml MeOH中，然后加入1.4g干燥的10％Pd/C。将反应混合物在70℃下搅拌并氢化(1.0atm)过夜。加入1.0g p-TsOH(10％摩尔，5.3mmol)并搅拌8小时。通过
Figure BDA0002552014940000583
过滤混合物。将溶剂在真空下挥发。将固体在60mLEtOH中重结晶。滤出固体并在真空下干燥，产生18.8g化合物A1.1。
实施例3
Figure BDA0002552014940000582
在惰性气氛中混合LiAliH4(1.88g,49.63mmol,1.3eq.)和THF(20ml)。滴加A1.1(14.0g)和40mL THF的混合物。将混合物在室温下搅拌过夜直到反应完全。然后将混合物在0-5℃下冷却，并通过滴加Na2SO4·10H2O(16.20g)和THF(50mL)的水溶液猝灭。
滤出沉淀物，减压蒸发溶剂。将固体在150mL EtOH中重结晶。滤出固体并在真空下干燥，由此产生10.15g D1。
实施例4
Figure BDA0002552014940000591
将39.3g A1(104.37mmol)溶解于DCM(100mL)中并在室温下搅拌。在10℃下加入硫酸(9.29g，0.9当量)，然后将混合物搅拌过夜。通过用水和NaHCO3洗涤来处理反应混合物，并分离有机层。浓缩有机层，随后进行柱层析以产生28.8g A2。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.50(s,1H)；3.57(s,3H)；1.15(d,3H)；1.09(s,3H)；0.59(s,3H)。
实施例5
Figure BDA0002552014940000592
在惰性气氛下，在THF(100ml)中将28.6g A2(79.87mmol)溶解并搅拌。将溶液在0-5℃下冷却，并缓慢加入LiAlH(OtBu)3(22.34g，1.1当量)(放热反应)。将混合物在室温下搅拌直至反应完全。将混合物在0-5℃下冷却，并用1M HCl溶液缓慢水解。用EtOAc萃取水相，并用NaHCO3溶液洗涤有机相。减压蒸发溶剂，产生27.62g A3。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.59(s,3H)；1.05(s,3H)；1.18(d,3H)；2.43(m,2H)；3.65(s,3H)；3.65(m,1H)；5.32(dd,1H)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.29(s,1H)；3.57(s,3H)；3.39(m,1H)；1.11(d,3H)；1.01(s,3H)；0.55(s,3H。
实施例6
Figure BDA0002552014940000601
在室温下,将A3 27.62g(76.61mmol)(10g)溶解于DCM(70mL)中。然后，加入三乙胺50mL(6.66当量)、乙酸酐8.85g(3.33当量)和DMAP(3.40g)，保持温度低于10℃。搅拌混合物直至反应完全。减压浓缩有机相，将固体悬浮在60mL DCM中，然后用1M HCl溶液洗涤。减压蒸发溶剂，由此产生32.29g A4。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.58(s,3H)；1.04(s,3H)；1.16(d,3H)；1.99(s,3H)；2.41(m,2H)；3.63(s,3H)；4.71(m,1H)；5.31(dd,1H)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.31(s,1H)；3.60(s,3H)；2.00(m,3H)；1.17(d,3H)；0.59(s,3H。
实施例7
Figure BDA0002552014940000602
将27g化合物A4(64.5mmol)悬浮在300mL AcOH中，然后加入无水CrO3(27.73g，4.30当量)。将悬浮液在60℃加热。将反应混合物搅拌0.5小时，直至反应完全。然后，将混合物倒入250ml水中，形成沉淀。用水洗涤有机相。将该操作再重复两次。浓缩有机相，直至获得油状残余物。将残余物在硅胶上纯化，产生13.05g纯的A5。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.84(s,3H)；1.17(s,3H)；1.30(d,3H)；1.98(s,3H)；3.63(s,3H)；4.72(m,1H)；5.72(s,1H)。
实施例8
Figure BDA0002552014940000611
将11g A5(28.31mmol)溶解于65ml AcOEt中，随后加入2.75g干燥的10％Pd/C(25％重量)。将反应混合物在70℃下搅拌并氢化(4.1atm)过夜。将混合物通过
Figure BDA0002552014940000613
过滤，并在真空下蒸发溶剂，由此产生11.02g A6(白色固体)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.97(s,3H)；1.00(s,3H)；1.15(d,3H)；2.00(s,3H)；2.46(m,2H)；3.63(s,3H)；4.68(m,1H)。
实施例9
Figure BDA0002552014940000612
在惰性气氛下,在THF(40mL)中将11.02g A6(26.30mmol)溶解并搅拌。将溶液在0-5℃下冷却。滴加LiAlH(OtBu)3(1.5当量,10.0g,39.45mmol)(放热反应)。将混合物在室温下搅拌直至反应完全。将混合物在0-5℃下冷却，然后通过加入1M HCl水溶液猝灭。用EtOAc萃取水相，并用NaHCO3溶液洗涤有机相。减压蒸发溶剂，由此产生11.16g A7。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.66(s,3H)；0.89(s,3H)；1.20(d,3H)；2.00(s,3H)；3.62(s,3H)；3.92(m,1H)；4.72(m,1H)。
实施例10
Figure BDA0002552014940000621
在室温下,在惰性气氛下,在THF(30mL)和MeOH(30mL)的混合物中将3.00g A7(7.13mmol)溶解并搅拌。加入LiOH(4M，30mL)。将溶液在60℃加热。搅拌该混合物直至反应完全(6小时)。混合物在室温下冷却。溶剂被蒸发，并通过加入2N HCl水溶液至酸性pH而被淬灭。将沉淀滤出为淡黄色固体，用水和EtOAc洗涤，然后在真空下干燥产生2.53g A7A。
实施例11
Figure BDA0002552014940000622
在惰性气氛下,在干燥的THF(7mL)中将0.3g A7(0.71mmol)溶解并搅拌。将溶液在0-5℃下冷却。滴加LiAlH4(0.06g,1.49mmol)(放热反应)。将混合物在室温下搅拌直至反应完全。将混合物在0-5℃下冷却，并通过加入Na2SO4·10H2O猝灭。滤出沉淀并用THF洗涤。减压蒸发溶剂，用EtOAc洗涤获得的固体，由此产生0.198g A8。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.95(t,J＝2.8Hz,1H),3.56(dd,J＝10.5,3.4Hz,1H),3.50(td,J＝11.1,5.5Hz,1H),3.21(dd,J＝10.5,7.7Hz,1H),1.95–1.70(m,6H),1.66–1.22(m,16H),1.19–1.10(m,2H),1.07(d,J＝6.6Hz,3H),1.02–0.94(m,1H),0.92(s,3H),0.72(s,3H)。
实施例12
Figure BDA0002552014940000631
在DCM(2mL)中将0.025g A8(0.078mmol)溶解并搅拌。加入CBr4(2.4当量,0.062g,0.09mmol)和三苯基膦(PPh3,2.5当量,0.051g,2.5mmol)。将溶液回流加热。搅拌该混合物直至反应完全。混合物在室温下冷却。将残余物在硅胶上纯化产生0.05g A9。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.93(t,J＝2.8Hz,1H),3.63–3.52(m,1H),3.48(dt,J＝5.9,2.9Hz,1H),3.29(dd,J＝9.7,6.5Hz,1H),1.90–1.15(m,23H),1.11(d,J＝6.5Hz,3H),0.94(ddd,J＝12.6,9.9,2.5Hz,1H),0.87(s,3H),0.67(s,3H)。
实施例13
Figure BDA0002552014940000632
在惰性气氛下,在干燥的DMF(10mL)中将0.5g 60％NaH(12.5mmol)溶解并搅拌。滴加溶解在3.0mL DMF中的丙二酸二乙酯(2.0g，12.48mmol)。将溶液加热并搅拌直至混合物变澄清。在40℃下冷却混合物。将溶解在3.0mL DMF中的A9(5.12g，12.4mmol)加入。将溶液在60℃加热。通过加入水(15mL)猝灭混合物。用EtOAc提取水相。减压蒸发溶剂，将残余物悬浮在2.8M KOH(10.0mL)水溶液中。将溶液回流加热。加入水(10mL)，并减压蒸发有机溶剂。通过加入2N HCl酸化水相，并用EtOAc萃取。减压蒸发溶剂，将残余物悬浮在二噁烷(5mL)和12N HCl(10mL)的混合物中。将该混合物回流加热24小时。将混合物在室温下冷却，并用EtOAc萃取。将有机相混合并减压蒸发。将残余物在硅胶上纯化由此产生3.1g DCA。
实施例14
Figure BDA0002552014940000641
在THF(8mL)中将0.42g B2.1(0.92mmol)溶解并搅拌。加入水(8mL)并在室温下搅拌。加入LiOH 4M(2.0ml)溶液。将混合物在50℃下加热并搅拌过夜。将混合物倒入在水中。用EtOAc提取水相。用2N HCl水溶液洗涤有机相。用EtOAc萃取水相，并减压蒸发合并的有机层，由此产生0.38g DCA。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.94(t,J＝2.7Hz,1H),3.58–3.45(m,1H),2.41–2.11(m,2H),1.99–1.71(m,7H),1.67–1.04(m,19H),0,99(d,J＝6,4Hz,3H),0.92(s,3H),0.70(s,3H)。
实施例15
Figure BDA0002552014940000651
在惰性气氛下,在THF(137mL)中将10.5g A6(24.0mmol)溶解并搅拌。将溶液在-40℃冷却。滴加LiAl(OtBu)3H(1.1eq,6.6g,26.0mmol)(放热反应)。将混合物在-20℃下搅拌直至反应完全。减压蒸发溶剂，然后将混合物在0/5℃下冷却。滤出固体，用水洗涤并干燥，得到10.55g化合物A7。
实施例16
Figure BDA0002552014940000652
在惰性气氛下,在干燥的DMF(0.5mL)中将1.6g 60％NaH(39.5mmol)溶解并搅拌。滴加溶解在0.5mL DMF中的丙二酸二乙酯(6.2mL，4.02mmol)。滴加在1.0mL DMF中的类固醇中间体(6.1g，9.8mmol)悬浮液。在60℃下加热并搅拌溶液。通过加入水(15mL)将混合物猝灭。用EtOAc提取水相。减压蒸发溶剂。残余物通过硅胶色谱纯化。
实施例17
Figure BDA0002552014940000653
将A11(1.8g，4.12mmol)悬浮在108mL Xiylene中。回流下加热悬浮液。将混合物在20/25℃下缓慢冷却。加入水(54mL)和EtOAc(270mL)。水相在10℃下冷却，并通过加入HCl2N酸化。搅拌混合物，滤出固体，用水洗涤并干燥，得到1.04g脱氧胆酸。
实施例18
Figure BDA0002552014940000661
在室温下在惰性气氛下,在MeOH(150mL)中将4.00g A5(9.6mmol)溶解并搅拌。加入20％NaOH(40mL，22毫摩尔)。将溶液回流加热。搅拌该混合物直至反应完全(3小时)。混合物在室温下冷却。溶剂被蒸发，并通过加入6N HCl水溶液至酸性pH而被淬灭。将沉淀滤出为固体，用水和EtOH洗涤，然后在真空下干燥产生3.4g(95％)A5.1。
1H-RMN(400MHz,DMSO-d6)δ＝0,57(s,3H)；0,81(s,3H)；1,09(d,J＝6Hz,3H)；3,71(m,1H)。
实施例19
Figure BDA0002552014940000662
在惰性气氛下，在THF(75ml)中将3.0g A7(7.14mmol)溶解并搅拌。将溶液在0-5℃下冷却，并缓慢加入LiAlH4(1.1g,28.6mmol)(放热反应)。将混合物在室温下搅拌，然后回流加热直至反应完全。将混合物在室温下冷却，并用水(1.1mL)、1.1mL NaOH(20％)和水(3.3mL)的溶液缓慢水解。滤出获得的白色固体并用THF(150mL)洗涤。将有机相用无水硫酸钠干燥。减压蒸发溶剂，产生2.3g(92％)A8。
实施例20
Figure BDA0002552014940000671
在惰性气氛下,将0.2g化合物A8(0.57mmol)悬浮于DCM(6.0mL)和ACN(6.0mL)的混合物中，然后加入Dess-Martin Periodinane试剂(0.24g,0.57mmol)和4-甲基吗啉4-氧化物(11mg，0.07mmol)。将悬浮液在室温下搅拌直至反应完全。然后，加入Na2S2O3(1M,50mL)溶液。水相用DCM(3x50mL)萃取，然后用盐水洗涤。浓缩有机相直至获得固体，产生0.25gA8.1。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.7(d,1H)；9,5(d,1H)；3.6(m,1H)；3.4(bs,1H)；2.3(qd,J＝9Hz,1H)。
实施例21
Figure BDA0002552014940000672
在室温下在惰性气氛下,在MeOH(100mL)中将2.00g A7(4.76mmol)溶解并搅拌。加入20％NaOH(20mL)。将溶液在80℃加热。搅拌该混合物直至反应完全(3小时)。混合物在室温下冷却。蒸发溶剂，并通过加入6N HCl水溶液直至酸性pH猝灭混合物。将沉淀滤出为固体，用水和MeOH洗涤，然后在真空下干燥产生1.4g(80％)酸性中间体。
在惰性气氛下,将9.0g中间体酸性化合物(25mmol)、DCC(6.2g，30mmol)、DMAP(3.7g，30mmol)和N,O-二甲基羟胺盐酸盐(4.9g，50mmol)溶解于DCM(250mL)中。加入Et3N(10mL)，并将悬浮液在室温下搅拌直至反应完全。然后，用盐水洗涤有机相。浓缩有机相，直至获得固体。通过柱色谱(AcOEt/庚烷)纯化固体，产生5.9g A8.2。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.9(bs,1H)；3.66(s,3H)；3.61(m,1H)；3.15(s,3H)；2.4(q,J＝9Hz,1H)。
实施例22
Figure BDA0002552014940000681
在惰性气氛下，在THF(25ml)中将2.5g A8.2(6.14mmol)溶解并搅拌。将溶液在0-5℃下冷却,并缓慢添加(放热反应)至LiAlH4(0.36g,9.2mmol)的THF(75mL)溶液中。将混合物在0-5℃下搅拌直至反应完全。用水(0.25mL)、NaOH(20％)0.25mL和水(0.75mL)的溶液缓慢水解该混合物。滤出获得的白色固体并且用THF(100mL)洗涤。浓缩有机相，并通过柱色谱(AcOEt/庚烷)纯化产生85％的A8.2。
实施例23
Figure BDA0002552014940000682
在惰性气氛下,将0.26g Zn(4.1mmol)悬浮于THF中。加入三甲基氯硅烷(0.1mmol)。将悬浮液回流加热下搅拌1小时。然后，加入0.2g A8.1(0.57mmol)和0.3mL溴乙酸乙酯(2.85mmol)的THF(20mL)溶液。将混合物回流加热下搅拌直至反应完全。混合物在室温下冷却。蒸发溶剂，并通过加入NH4Cl饱和水溶液(50mL)猝灭混合物。加入EtOAc(75mL)。用NaCl的饱和水溶液洗涤有机相。浓缩有机相，通过柱色谱(EtOAc/庚烷)纯化固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.35(dt,J＝9Hz,J＝3Hz,1H)；4.55(q,J＝7.5Hz,2H)；3.35(m,1H)；2.7(dd,J＝17Hz,J＝9Hz,1H)；2.75(dd,J＝17Hz,J＝3Hz,1H)。
实施例24
Figure BDA0002552014940000691
在惰性气氛下,在EtOH(2mL)中将0.41g EtONa(0.60mmol)溶解并搅拌，并在0℃下冷却。向混合物中加入丙二酸二乙酯(0.97g，0.60mmol)。将混合物在室温下加热并加入A9(0.20g，0.48mmol)。将溶液在90℃加热。通过加入水(5mL)猝灭混合物。用EtOAc萃取水相。减压蒸发有机相。将残余物在硅胶上纯化，由此得到0.12g的A10。
实施例25
Figure BDA0002552014940000692
在惰性气氛下,在DMF(2mL)中将0.15g NaH 60％(3.87mmol)溶解并搅拌，并在0℃下冷却。向混合物中加入丙二酸二乙酯(0.59mL，3.87mmol)。将混合物在室温下加热并加入A9(0.40g，0.96mmol)。将溶液在60℃加热。将混合物倒入20％NaCl(30mL)溶液中。用EtOAc萃取水相。减压蒸发有机相。将残余物在硅胶上纯化，由此产生0.76g A10。
实施例26
Figure BDA0002552014940000693
在0℃冷却的惰性气氛下，在干燥DMF(75mL)中将5.86g 60％NaH(146.4mmol)溶解并搅拌。滴加丙二酸二乙酯(23.4g，146.4mmol)。搅拌该溶液直至混合物变澄清。将A9(15.13g，36.6mmol)溶解在75.0mL DMF中。将溶液在60℃加热。将混合物用20％NaCl(1200mL)溶液猝灭。用EtOAc萃取水相。减压浓缩溶剂，并将混合物在室温下冷却并搅拌直至固体沉淀。滤出固体并干燥，得到25.3g A11。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.95-3.93(m,1H),3.57–3.46(m,1H),3.39(dd,J＝11.1,3.5Hz,1H),2.12(t,J＝11.4Hz,1H),1.96–1.04(m,25H),1.00(d,J＝7.5Hz,3H),0.91(s,3H),0.68(s,3H)。
实施例27
Figure BDA0002552014940000701
将A11(3.0g，0.76mmol)悬浮在90.0mL 20％NaCl中。回流加热悬浮液60小时。冷却混合物至室温。滤出固体并干燥产生2.48g DCA。
实施例28
Figure BDA0002552014940000702
将A11(0.3g，0.076mmol)悬浮在9.0mL NaH2PO3水溶液(pH 4.55)中。回流加热悬浮液70小时。混合物在室温下冷却。滤出固体并干燥产生0.22g DCA。
实施例29
Figure BDA0002552014940000703
将A11(0.3g，0.076mmol)悬浮在压力容器中的9.0mL水中并关闭。回流加热悬浮液80小时。冷却混合物至室温。滤出固体并干燥产生0.23g DCA。
实施例30
Figure BDA0002552014940000711
在ACN(1mL)中将0.05g A8(0.14mmol)溶解并搅拌，将混合物在0℃冷却。滴加PPh3Br2(0.105g,0.24mmol)的ACN(1mL)溶液。搅拌该混合物直至反应完全。混合物在室温下冷却。将残余物在硅胶上纯化产生0.04g A9。
实施例31
Figure BDA0002552014940000712
在惰性气氛下，在DCM(2mL)中将0.05g A8(0.14mmol)溶解并搅拌，并冷却至-40℃。滴加0.4mL TPP(0.077g，1.75当量)的DCM(8mL)溶液。滴加0.4mL Br2(0.04g,1.75当量)的DCM(8mL)溶液。搅拌该混合物直至反应完全。使混合物达到室温。将残余物在硅胶上纯化产生0.05g A9。
实施例32
Figure BDA0002552014940000713
将0.05g A8(0.14mmol)溶解并在ACN(1mL)中搅拌，并冷却至0℃。滴加PPh3Br2(0.105g,0.24mmol)的ACN(1mL)溶液。搅拌该混合物直至反应完全。将混合物升温至室温。将残余物在硅胶上纯化产生0.04g A9。
实施例33
Figure BDA0002552014940000721
将5.0g A10(10.15mmol)溶解于EtOH(25mL)中，并在室温下搅拌。加入NaOH 4M(40mL)并搅拌混合物。减压浓缩有机溶剂。滴加水(30mL)并得到固体。用DCM(150ml)洗涤水相。用HCl 2N酸化水相(直到pH 1)。将混合物在室温下搅拌并获得固体。滤出固体并干燥产生3.5g A11。
实施例34
Figure BDA0002552014940000722
将5.0g A10(10.15mmol)溶解于EtOH(25mL)中，并在室温下搅拌。加入LiOH 4M(40mL)，并在40℃下搅拌混合物直至反应完全。减压浓缩有机溶剂。加入水(500mL)和DCM(150mL)。分离水相，并用2N HCl酸化(直到pH 1)。将混合物在室温下搅拌并获得固体。滤出固体并干燥产生4.3g A11。
实施例35
Figure BDA0002552014940000723
在DCM(1mL)中将0.05g A8(0.14mmol)溶解并搅拌，将混合物在0℃冷却。加入TsCl(0.05g，0.28mmol)和DMAP(0.03g，0.28mmol)。搅拌悬浮液直至反应完全。使混合物达到室温。将残余物在硅胶上纯化产生0.04g A9.2。
实施例36：二乙基丙二酸酯的制备
Figure BDA0002552014940000731
在三颈250mL圆底烧瓶中，加入丙二酸(20g，0.192mol)、无水乙醇(70mL，1.2mol)和浓硫酸(0.8mL，0.08mmol)。圆底烧瓶配备有冷凝器以在大气压下进行共沸蒸馏。通过蒸馏除去的乙醇量用乙醇蒸汽流代替，该乙醇蒸汽流源自用作蒸发器的分离的500mL圆底烧瓶。乙醇/水蒸汽以50mL/h的速度蒸发和冷凝。
反应条件在7h内未改变。通过Karl-Fischer滴定检测的水量的定量来跟踪反应。当检测到的水量与无水乙醇的原始含量相似时，反应结束。将反应冷却至室温，加入100mL5％w/v的氢氧化钠溶液(根据文献可使用碳酸钠)。用二氯甲烷(3x50mL)萃取水相，并用50mL水洗涤合并的有机相。旋转蒸发有机溶液，得到18.43g(115mmol)丙二酸乙酯(60％摩尔收率)。最终产物的水含量为0.06％，并且通过使用GC检查丙二酸不存在。
可以通过使用GC，添加足够的三乙胺以达到中性pH来进行IPC。使用以下GC方法：
内部气相色谱方法:
GC仪器：Agilent。
进样器：分流/不分流
柱：HP-FFAP，长度：30m，内径：0.32mm，膜：0.25μm。固定相：硝基对苯二甲酸改性的聚乙二醇。
注射：自动/手动
检测器：FID
气体流量：
-氮气：载体(9psi，60kPa)
-空气：300-400mL/min
-氢气：30-40mL/min
-分流：28mL/min
-辅助气体(N2)：6.25mL/min
-隔膜吹扫：1.8mL/min
GC温度：进样器(250℃)；检测器(300℃)，范围：3；色谱柱温度：3分钟内80℃，以20℃/min的速度升温至220℃，并保持1分钟。
注射体积：1μL；
色谱时间：10分钟
实施例37：从植物来源制备生物基DCA
Figure BDA0002552014940000741
在惰性气氛下的三颈250mL圆底烧瓶中，加入49mL无水乙醇。然后加入乙醇钠(4.6g，68.2mmol)。滴加丙二酸二乙酯(10.92g，10.4mL，68.2mmol)。将溶液(或轻悬浮液)搅拌30分钟，然后加入A9-琥珀酸酯(10.9g，68.2mmol)和35mL无水乙醇。将悬浮液回流加热过夜。
在7.5小时后，使用TLC硅胶板和甲苯/乙腈1/1的混合物进行过程中控制(IPC)。反应结束并冷却至30℃。滴加4M氢氧化钠溶液15min，而不达到50℃。将混合物在40℃下加热2h。或者，反应可在室温下搅拌过夜进行。
一旦反应结束，在150mbar和40℃下蒸馏出乙醇。然后，加入350mL水。可以观察到白色固体的形成。在这种情况下，这些固体需要在真空下通过过滤除去，并用20mL水洗涤滤饼。含有盐形式产物的水相用二氯甲烷(210mL)洗涤三次。二氯甲烷总量的去除是一个关键参数，因此，在150mbar和25℃下进行蒸馏。将溶液冷却至0/5℃，并且在10分钟内滴加147mL的硫酸2N溶液，产生白色固体。最终pH为1.7-2.0。将悬浮液以5℃/10min的速率加热至75℃。在60/65℃下，注意到固体形态的变化。保持条件20分钟，将悬浮液冷却至15℃，持续1小时。悬浮液在15℃下保持30分钟，然后真空过滤。将滤饼用70mL水洗涤两次。两个步骤的最终产率为73.7％摩尔。
最终产物可在强制空气干燥箱中在50℃下干燥过夜。
DCA合成：
Figure BDA0002552014940000751
在三颈250mL圆底烧瓶中，将4.4g的A11(10mmol)悬浮在130ml水中。将悬浮液回流加热3天。
一旦起始材料已经转变成最终产物，将悬浮液冷却至室温并真空过滤。将湿滤饼用20mL水洗涤三次。将产物在强制空气干燥箱中在50℃下干燥过夜。最终产率为90-99％摩尔。
或者，使用N-甲基吡咯烷酮、N,N’-二甲基乙酰胺、N,N’-二甲基甲酰胺、二甲苯或二甘醇单甲醚作为溶剂，可以在更高的温度(130℃)下更快地进行该反应。使用这些溶剂，反应在1和3小时之间完成。然后，可以添加40V的水以沉淀产物。在A11上进行的TGA实验表明，该反应可以在不涉及其他热事件的情况下进行到200℃。
使用25体积的二氯甲烷纯化湿滤饼，然后加入甲醇直到滤饼溶解(通常为4-5体积)。通过在大气压下蒸馏除去溶剂。再次加入25体积的二氯甲烷，然后蒸馏。重复这一过程3次。最后，除去有机溶剂需要将滤饼悬浮在30体积的水中，加热回流至少5/10分钟，冷却至室温，然后过滤。湿滤饼用5体积的水洗涤两次。纯化的产率为90％。
实施例38：来自植物来源的DCA的生物基含量分析
根据ASTM D6866-16方法B(AMS)在来自实施例37的DCA产物上测定％生物基碳含量。这一结果是使用放射性碳同位素(也称为碳-14、C-14或14C)获得的，碳是一种天然存在的碳同位素，具有放射性，并且其衰变的方式使得其在植物或动物死亡后的大约45,000年后完全消失。还开发了一个工业应用程序，以确定消费品和二氧化碳排放是来自植物/生物质，还是来自石油或煤(化石基)等材料。到2003年，对在监管环境中应用碳14测试的标准化方法的需求越来越大。这些标准中的第一个是ASTM D6866-04，其在β分析的帮助下编写。由于ASTM在很大程度上被视为美国标准，所以欧洲利益相关者很快开始要求等效CEN标准，而全球利益相关者要求ISO标准化。
使用不同标准测定放射性碳含量的分析过程是相同的。唯一的差异是报告格式。通常使用标准化术语“生物基碳％”来报告结果。当结果代表所有存在的碳(总碳)而不仅仅是有机碳(总有机碳)时，只有ASTM D6866使用术语“生物碳％(％biogenic carbon)”。
所述结果是通过测定材料中的放射性碳相对于National Institute ofStandards and Technology(NIST)现代参考标准(SRM 4990C)的比率而获得的。该比率以百分比计算，并以现代碳百分比(pMC)报告。相对于NIST标准获得的值被归一化到公元1950年，因此需要调整以计算相对于今天的碳源值。该因素在报告表上作为术语“REF”列出。
100％生物基碳或生物源碳的值表示100％的碳来自生活在天然环境中的植物或动物副产品(生物质)，而0％的值表示所有的碳都衍生自石化产品、煤和其他化石来源。0-100％之间的值表示混合物。该值越高，材料中天然来源组分的比例就越大。
分析测定被称为“现代碳百分比(pMC)”。这是样品中C14相对于现代参考标准(NIST 4990C)的百分比。在当今的空气中，通过对二氧化碳中的C14应用小的调节因子，由PMC计算“％生物基碳”。
“％生物基碳”＝pMC/1.010
报告结果已通过ISO/IEC 17025:2005测试认证的PJLA#59423标准认证，并且所有化学方法均在佛罗里达州迈阿密的Beta Analytic，Inc.进行。
结果：100％生物基碳含量(作为总有机碳的分数)
现代碳百分比(pMC)：103.39+/-0.29pMC
大气调节因子(REF)：101.0；＝pMC/1.010
实施例39：分析来自动物来源、合成来源和植物来源的DCA的δ13C含量
使用IRMS(同位素比率质谱)并根据US 8,076,156和D.M.O’Brien的“StableIsotope Ratios as biomarkers of diet for health research”,Annual Reviews(www.annualreviews.org),2015中所述的方法，对动物来源的DCA样品和植物甾醇来源的DCA(即衍生自植物来源)进行了测定。所述δ-值的出现是因为C13是相对于一种基于白垩纪海洋化石的Pee Dee Belemnite标准来测定的，这种化石具有异常高的C13。
值表示为与国际公认的PDB标准(来自南卡罗来纳州Pee Dee Belemnite地层中的碳酸盐)的每mil(％)偏差(例如每一千)。
Figure BDA0002552014940000771
Figure BDA0002552014940000781
上表中描述的结果显示了通过对不同样品进行测定获得的结果。DCA样品测定如下：
动物来源是从动物来源纯化的DCA，即传统获得的DCA。
植物来源(植物甾醇)是从来自植物的植物甾醇开始并根据本发明生产的DCA，其中添加的附加碳原子仅衍生自植物来源。
组合植物来源和合成来源：DCA包含来自合成来源(化石衍生的起始材料)的两个碳原子，和来自植物来源的剩余碳原子(由植物甾醇起始材料产生)。DCA如本文所述制备，但使用来自合成来源的二乙基/丙二酸二甲酯、乙酸和乙腈。
这些结果表明，DCA的起源可通过其是从动物还是部分或仅从植物来源获得来区分。
实施例40：生物基碳含量和DCA的δ13C含量的测定
根据实施例38中所述的方法，在不同来源的DCA样品中测定了以14C计的生物基碳含量，提供了以下测定值：
“％生物基碳”＝pMC/1.010
现代碳百分比(pMC)
大气调节系数(REF)。
报告结果已通过ISO/IEC 17025:2005测试认证的PJLA#59423标准认证，并且所有化学方法均在佛罗里达州迈阿密的Beta Analytic，Inc.进行。
如实施例39中所述测定相同样品的δ13C含量。
测试的DCA从以下来源获得：
动物来源是从动物来源纯化的DCA，即传统获得的DCA。
植物来源(植物甾醇)是从来自植物的植物甾醇开始并根据本发明生产的DCA，其中添加的附加碳原子仅衍生自植物来源。
组合植物来源和合成来源：DCA包含来自合成来源(化石来源的起始材料)的两个碳原子，和来自植物来源的剩余碳原子(由植物甾醇起始材料产生)。DCA如本文所述制备，但使用来自合成来源的二乙基/丙二酸二甲酯、乙酸和乙腈。
Figure BDA0002552014940000791
Figure BDA0002552014940000801
该表表明衍生自植物甾醇和仅衍生自植物来源的DCA保持了100％的生物基水平和-27.1‰或-29.7‰的δ13C。来自动物来源的DCA也是100％的生物基，但相比之下，δ13C相当高，即-12.1‰。
当将起始材料为来自植物来源的DCA与合成来源的试剂组合时，由于来自合成来源的含量较低，因此生物基含量降低，但是δ13C与从植物来源获得的DCA大约相同。
因此，生物基碳原子的％和δ13C的水平的测定使得能够区分不同来源的DCA。
实施例41：使用Bradford测定蛋白质含量
Bradford测定(Bradford MM.:A a rapid and sensitive method for thequantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle ofprotein-dye binding.Anal Biochem 1976；72:248–54)是推荐用于一般用途的快速且准确的方法，特别是用于测定样品的总蛋白质浓度。Bradford测定已经成为许多实验室用于定量蛋白质的优选方法。Bradford测定依赖于染料考马斯蓝G250与蛋白质的结合，并且观察到考马斯亮蓝G-250的酸性溶液的最大吸光度在与蛋白质结合时从465nm移动到595nm。由于染料-白蛋白复合物溶液的消光系数在10倍的浓度范围内是恒定的，所以该测定是有用的。
方法：
通过比色蛋白质测定法Bradford确定蛋白质的存在。该方法涉及考马斯亮蓝G-250染料与蛋白质的结合。在酸性条件下，染料主要是双重质子化的红色阳离子形式(Amax＝470nm)。然而，当染料与蛋白质结合时，其转化为稳定的未质子化蓝色形式(Amax＝595nm)。因此，用分光光度计测定的蓝色外观表明蛋白质的存在。
样品制备：
向1g样品中加入1mL水。将混合物摇匀并超声处理20分钟。然后，将混合物静置10分钟。上层液体通过Bradford测试分析。
牛血清白蛋白(BSA)(一种衍生自牛的血清白蛋白)经常用作蛋白质浓度标准，在一些问题样品中掺入2.5μg的已知量(10μL的0.25μg/μL的基质溶液)作为阳性对照。
通过在0.5至10μg范围内的BSA的不同浓度绘制校准曲线。
Bradford测定：
使用不同量的问题样品根据标准程序(Bradford，1976)进行测定。对每个样品进行了3次测定。
i)1μL样品
ii)5μL样品
iii)阳性对照：5μL样品加2.5mg BSA。
Bradford法测定蛋白质存在/不存在的结果:
Figure BDA0002552014940000811
阴性是指在任何情况下，蛋白质的潜在量(如果有的话)都低于装置检测的最小阈值。
测试的DCA从以下来源获得：
动物来源是从动物来源纯化的DCA，即传统获得的DCA。
植物来源(植物甾醇)是从来自植物的植物甾醇开始并根据本发明生产的DCA，其中添加的附加碳原子仅衍生自植物来源。
组合的植物来源和合成来源：DCA包含来自合成来源(化石来源的材料材料)的两个碳原子，和来自植物来源的剩余碳原子(由植物甾醇起始材料产生)。DCA如本文所述制备，但使用来自合成来源的二乙基/丙二酸二甲酯、乙酸和乙腈。
Bradford法是蛋白质定量的常见技术。然而，Bradford法没有检测到任何DCA样品中的任何蛋白质，无论是动物来源的、来自植物来源的和根据本发明衍生的，还是作为植物来源和合成来源组合的DCA。因此，Bradford法不能用于区分DCA的不同来源，如在本文所述的区分14C和δ13C的水平。
本发明的实施方案
A.一种制备脱氧胆酸(DCA)或其药学上可接受的盐的方法，其包括以下步骤：
I)提供通式SM的化合物：
Figure BDA0002552014940000821
II)还原通式SM的化合物以获得通式INT 1的中间体:
Figure BDA0002552014940000822
III)将通式INT 1的中间体转化成通式INT 2的中间体:
Figure BDA0002552014940000823
IVa)将通式INT 2的中间体还原成通式INT 3的中间体:
Figure BDA0002552014940000831
接着将通式INT 3的中间体转化成通式INT B的中间体：
Figure BDA0002552014940000832
或
IVb)将通式INT 2的中间体转化成具有通式INT B的中间体：
Figure BDA0002552014940000833
V)将通式INT B的中间体转化成脱氧胆酸(DCA)：
Figure BDA0002552014940000834
VI)任选地将脱氧胆酸转化成其药学上可接受的盐，
其中
R1是COOR2、CH2OH、CH2OP、CH2X、CH2CHO、CH2-CH2-OH、CH2-CH2OP或CH2-CH2X或CH2-CH2-CHO；
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
P为醇保护基团；
R3是P或R2；和
X是卤素原子；
B.根据实施方案A的方法，其包括以下步骤：
i)提供通式SM-a的化合物：
Figure BDA0002552014940000841
ii)还原通式SM-a的化合物以获得通式Int A1的中间体:
Figure BDA0002552014940000842
iii)将通式Int A1的中间体转化成通式Int A2的中间体：
Figure BDA0002552014940000851
iv)将通式Int A2的中间体还原为通式Int A3的中间体：
Figure BDA0002552014940000852
v)将通式Int A3的中间体氧化成通式Int A5的中间体：
Figure BDA0002552014940000853
vi)将通式Int A5的中间体还原为通式Int A6的中间体：
Figure BDA0002552014940000854
vii)将通式Int A6的中间体还原为通式Int A7的中间体：
Figure BDA0002552014940000861
viii)将通式Int A7的化合物还原为通式Int A8的中间体：
Figure BDA0002552014940000862
ix)延长通式Int A8的化合物的碳链以获得脱氧胆酸(DCA):
Figure BDA0002552014940000863
x)任选地将脱氧胆酸转化成其药学上可接受的盐，
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
R3为H、R2或醇保护基团。
C.根据实施方案A或B的方法，其中R2选自由如下组成的组：甲基、乙基、正丙基和异丙基。
D.根据实施方案C的方法，其中R2为甲基或乙基。
E.根据实施方案D的方法，其中R2为甲基。
F.根据前述任一实施方案的方法，其中R3选自由如下组成的组：三甲基甲硅烷基醚(TMS)、三乙基甲硅烷基醚(TES)、三异丙基甲硅烷基醚(TIPS)、叔丁基二甲基甲硅烷基醚(TBS，TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基醚(TBDPS)、乙酰基(Ac，COCH3)、苯甲酰基(Bz)、苄基醚(Bn)、4-甲氧基苄基醚(PMB)、2-萘基甲基醚(Nap)、甲氧基甲基缩醛(MOM)、2-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、乙氧基乙基缩醛(EE)、甲氧基丙基缩醛(MOP)、苄氧基甲基乙缩醛(BOM)、四氢吡喃基乙缩醛(THP)、2,2,2-三氯乙基碳酸酯(Troc)、甲基醚、二甲氧基三苯甲基(DMT)、甲氧基三苯甲基(MMT)、甲硫基甲基醚、新戊酰基(Piv)、四氢吡喃基(THP)、三苯甲基(三苯甲基，Tr)，和甲苯磺酰基(Ts)。
G.根据实施方案F的方法，其中R3选自由如下组成的组：Ac、TBDMS和Ts。
H.根据实施方案G的方法，其中R3为Ac。
I.根据实施方案A或B的方法，其中R2为甲基且R3为Ac。
J.根据实施方案J的方法，其中R3是R2，并且R2如实施方案B-D中任一项所定义。
K.一种制备脱氧胆酸(DCA)或其药学上可接受的盐的方法，其包括以下步骤：
I)提供通式INT 3的化合物:
Figure BDA0002552014940000871
II)将通式INT 3的中间体转化成通式INT B的中间体:
Figure BDA0002552014940000881
III)将通式INT B的中间体转化成脱氧胆酸(DCA)：
Figure BDA0002552014940000882
IV)任选地将脱氧胆酸转化成其药学上可接受的盐，
其中
R1是COOR2、CH2OH、CH2OP、CH2X、CH2CHO、CH2-CH2-OH、CH2-CH2OP或CH2-CH2X或CH2-CH2-CHO；
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
P为醇保护基团；
R3是P或R2；和
X是卤素原子；
L.根据实施方案K的方法，其中INT 3由实施方案A的步骤IVa)中定义的INT 2提供。
M.根据实施方案L的方法，其中INT 2由实施方案A的步骤III)中定义的INT 1提供。
N.根据实施方案M的方法，其中INT 1从实施方案A的步骤II)中定义的SM获得。
O.根据实施方案K的方法，其包括以下步骤：
i)提供通式Int A3的化合物：
Figure BDA0002552014940000891
ii)将通式Int A3的中间体氧化成通式Int A5的中间体：
Figure BDA0002552014940000892
iii)将通式Int A5的中间体还原为通式Int A6的中间体：
Figure BDA0002552014940000893
iv)将通式Int A6的中间体还原为通式Int A7的中间体：
Figure BDA0002552014940000901
v)将通式Int A7的化合物还原为通式Int A8的中间体：
Figure BDA0002552014940000902
vi)延长通式Int A8的化合物的碳链以获得脱氧胆酸(DCA):
Figure BDA0002552014940000903
vii)任选地将脱氧胆酸转化为其药学上可接受的盐，
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
R3为H、R2或醇保护基团。
P.根据实施方案O的方法，其中INT A3由实施方式B的步骤iv)中定义的INT A2提供。
Q.根据实施方案P的方法，其中INT A2由实施方案B的步骤iii)中定义的INT A1提供。
R.根据实施方案Q的方法，其中INT A1由实施方案B的步骤ii)中定义的SM-a提供。
S.根据实施方案K-R中任一项的方法，其中R2和R3是实施方案B-J中的任一项定义的。
T.通式I的化合物
Figure BDA0002552014940000911
其中
R1是COOR2、CH2OH、CH2OP、CH2X、CH2CHO、CH2-CH2-OH、CH2-CH2OP、CH2-CH2X或CH2-CH2-CHO；
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
P为醇保护基团；
X是卤素原子；
Figure BDA0002552014940000912
是C-C键或C＝C键；
Figure BDA0002552014940000913
是＝O或
Figure BDA0002552014940000915
其中R3是P或R2；
OR4是OH，或者R4是A环中的C3碳；和
条件是式I不是
Figure BDA0002552014940000914
Figure BDA0002552014940000921
Figure BDA0002552014940000931
T1.实施方案T的化合物，其中
R1是COOR2、CH2OP、CH2X、CH2CHO、CH2-CH2-OH、CH2-CH2OP或CH2-CH2X；
P是醇保护基团，条件是p不是Ac或Pv；
条件是式I不是
Figure BDA0002552014940000932
其中，R是H或Me；
Figure BDA0002552014940000933
其中，R是H或Me；
Figure BDA0002552014940000941
U.根据实施方案T或T1的化合物具有通式SM
Figure BDA0002552014940000942
其中
R1是COOR2、CH2OP、CH2X、CH2CHO、CH2-CH2-OH、CH2-CH2OP或CH2-CH2X；
R2是直链的或支链的C1-C6烷基，条件是R2不是CH3；
P是醇保护基团，条件是P不是Ac；并且
X是卤素原子；
V.根据实施方案T或T1的化合物具有通式INT 1
Figure BDA0002552014940000951
其中
R1是COOR2、CH2OH、CH2OP、CH2X、CH2CHO、CH2-CH2-OH、CH2-CH2OP、CH2-CH2X或CH2-CH2-CHO；
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
P为醇保护基团；
R3是P或R2；和
X是卤素原子；
W.根据实施方案T或T1的化合物具有通式INT 2
Figure BDA0002552014940000952
其中
R1是COOR2、CH2OP、CH2X、CH2CHO、CH2-CH2-OH、CH2-CH2OP或CH2-CH2X；
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
P是醇保护基团；并且
X是卤素原子；
X.根据实施方案T或T1的化合物具有通式INT 3
Figure BDA0002552014940000961
其中
R1是COOR2、CH2OP、CH2X、CH2CHO、CH2-CH2-OH、CH2-CH2OP或CH2-CH2X；
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
P为醇保护基团；
R3是P或R2；和
X是卤素原子；
Y.根据实施方案U-X中任一项的化合物，其中R1为COOR2、CH2OP或CH2X，其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
P为醇保护基团；
R3是P或R2；和
X是卤素原子。
Z.根据实施方案U-Y中任一项的化合物，其中R2选自由如下组成的组：甲基、乙基、正丙基和异丙基。
AA.根据实施方案Z的化合物，其中R2为甲基或乙基。
AB.根据实施方案AA的化合物，其中R2为甲基。
AC.根据实施方案AA的化合物，其中R2为乙基。
AD.根据实施方案U-Y中任一项的化合物，其中R2为H。
AE.根据实施方案U-Y中任一项的化合物，其中X选自由如下组成的组：Cl、Br和I。
AF.根据实施方案AE所述的化合物，其中X为Br。
AG.根据实施方案U-Y中任一项的化合物，其中P选自由如下组成的组：三甲基甲硅烷基醚(TMS)、三乙基甲硅烷基醚(TES)、三异丙基甲硅烷基醚(TIPS)、叔丁基二甲基甲硅烷基醚(TBS，TBDMS)、叔丁基二苯基甲硅烷基醚(TBDPS)、乙酰基(Ac，COCH3)、苯甲酰基(Bz)、苄基醚(Bn)、4-甲氧基苄基醚(PMB)、2-萘基甲基醚(Nap)、甲氧基甲基缩醛(MOM)、2-甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)、乙氧基乙基缩醛(EE)、甲氧基丙基缩醛(MOP)、苄氧基甲基乙缩醛(BOM)、四氢吡喃基乙缩醛(THP)、2,2,2-三氯乙基碳酸酯(Troc)、甲基醚、二甲氧基三苯甲基(DMT)、甲氧基三苯甲基(MMT)、甲硫基甲基醚、新戊酰基(Piv)、四氢吡喃基(THP)、三苯甲基(三苯甲基，Tr)，和甲苯磺酰基(Ts)。
AH.根据实施方案AG的化合物，其中P选自由如下组成的组：Ac、TBDMS和Ts。
AI.根据实施方案U-AH中任一项的化合物，其中R3为H。
AJ.根据实施方案U-AH中任一项的化合物，其中R3是R2，并且R2如实施方案Z-AC中任一项所定义。
AK.根据实施方案U-AH中任一项的化合物，其中R3为P，且P如实施方案AG或AH中所定义。
AL.根据实施方案AK的化合物，其中R3为Ac。
AM.通式I化合物的用途
Figure BDA0002552014940000971
其中
R1是COOR2、CH2OH、CH2OP、CH2X、CH2CHO、CH2-CH2-OH、CH2-CH2OP、CH2-CH2X或CH2-CH2-CHO；
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
P为醇保护基团；
X是卤素原子；
Figure BDA0002552014940000981
是C-C键或C＝C键；
Figure BDA0002552014940000982
是＝O或
Figure BDA0002552014940000987
其中R3是P或R2；和
OR4或者是OH或R4是A环中的C3碳；
用于制备脱氧胆酸(DCA)、胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸或其药学上可接受的盐。
AM1.通式I化合物的用途
Figure BDA0002552014940000983
其中
R1是COOR2、CH2OH、CH2OP、CH2X、CH2CHO、CH2-CH2-OH、CH2-CH2OP、CH2-CH2X或CH2-CH2-CHO；
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
P为醇保护基团；
X是卤素原子；
Figure BDA0002552014940000984
是C-C键或C＝C键；
Figure BDA0002552014940000985
是＝O或
Figure BDA0002552014940000986
其中R3是P或R2；和
OR4或者是OH或R4是A环中的C3碳；
用于制备通式II的化合物或其药学上可接受的盐。
Figure BDA0002552014940000991
其中
R1是OH、NHCH2CH2SO3H或NHCH2COOH；
R2和R3是H或OH。
AN.根据权利要求AM1的用途，其中通式II的化合物是脱氧胆酸(DCA)、胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸或其药学上可接受的盐。
AO.根据实施方式AM-AN的用途，其中通式I的化合物如实施方式U-AL中任一项所定义。
BA.式(DCA)的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002552014940000992
其中所述脱氧胆酸或其药学上可接受的盐包含小于10％的化石碳百分比，并且其中所述脱氧胆酸或其药学上可接受的盐的碳原子至少部分衍生自植物来源。
BB.根据实施方案BA的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中化石碳百分比小于8％，例如小于5％，如小于3％，例如小于1％，如小于0.1％，例如小于0.01％。
BC.根据实施方案BA-BB中任一项的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中脱氧胆酸或其药学上可接受的盐的碳原子仅衍生自植物来源。
BD.式(DCA)的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002552014940001001
其中所述脱氧胆酸具有与从动物来源获得(优选获自哺乳动物来源)的脱氧胆酸的平均δ13C值不同的平均δ13C。
BE.根据实施方案BD的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中脱氧胆酸或其药学上可接受的盐的碳原子仅或部分衍生自植物来源。
BF.根据实施方案BD-BE中任一项的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中脱氧胆酸或其药学上可接受的盐的碳原子仅或部分衍生自植物甾醇或植物甾醇衍生物。
BG.根据实施方案BD-BF中任一项的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中脱氧胆酸的平均δ13C值在-20‰至-40‰的范围内，例如-21‰至-35‰，如-20‰至-32‰，例如-25‰至-28‰，如约-26‰。
BH.根据实施方式BD-BG中任一项的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中所述植物来源部分或仅衍生自C3植物。
BI.根据实施方案BD-BH中任一项的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中脱氧胆酸或其药学上可接受的盐还包含小于10％的化石碳百分比，如小于8％，如小于5％，如小于3％，例如小于1％，如小于0.1％，例如小于0.01％。
BJ.根据实施方案BD-BI中任一项的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中脱氧胆酸或其药学上可接受的盐包含小于1％的化石碳百分比，具有仅衍生自植物来源的碳原子，并且具有不同于从动物来源获得的脱氧胆酸的平均δ13C值的平均δ13C值。
BK.式(DCA)的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002552014940001011
通过以下方式获得
i)提供通式Int A8的中间体：
Figure BDA0002552014940001012
和
ii)延长通式Int A8的化合物的碳链以获得脱氧胆酸(DCA):
Figure BDA0002552014940001013
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
R3为H、R2或醇保护基团；并且
其中所述化合物和中间体的所有碳原子都衍生自植物来源。
BL.根据实施方案BK的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中脱氧胆酸或其药学上可接受的盐包含小于10％的化石碳百分比，如小于8％，例如小于5％，如小于3％，如小于1％，如小于0.1％，例如小于0.01％。
BM.根据实施方案BK-BL中任一项的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中脱氧胆酸或其药学上可接受的盐具有与从动物来源，优选哺乳动物来源，获得的脱氧胆酸的平均δ13C值不同的平均δ13C值。
BN.根据实施方案BK-BM中任一项的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中脱氧胆酸的平均δ13C值在-20‰至-40‰的范围内，例如-21‰至-35‰，如-20‰至-32‰，例如-25‰至-28‰，如约-26‰。
BO.根据实施方案BK-BN中任一项的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中脱氧胆酸或其药学上可接受的盐包含小于1％的化石碳百分比和不同于从动物来源获得的脱氧胆酸的平均δ13C值的平均δ13C值。
BP.根据实施方案BK-BO中任一项的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中通式Int A8的化合物的碳链如下所述延长为DCA：
i)将通式Int A8中的伯醇转化成离去基团(X)以获得通式Int A9的中间体：
Figure BDA0002552014940001021
其中X是OMs、OTs或卤素，优选Cl、Br或I；和
ii)延长通式Int A9的化合物的碳链以获得DCA：
Figure BDA0002552014940001022
BQ.根据实施方案BP的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中通式Int A9的化合物被转化为通式Int A10的化合物，然后将Int A10转化为DCA。
Figure BDA0002552014940001031
BR.根据实施方案BQ的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中通式Int A10的化合物被转化为通式Int A11的化合物，然后将Int A11转化为DCA。
Figure BDA0002552014940001032
BS.根据实施方案BQ的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中使用丙二酸二乙酯(优选从植物来源例如糖发酵获得)将通式Int A9的化合物转化成通式Int A10的化合物。
BT.根据实施方式BP的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中通式Int A9的化合物通过用乙腈替代离去基团X，随后水解而被转化为DCA。
BU.根据实施方案BT的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中所述乙腈由乙酸制备，所述乙酸从植物来源获得(例如来自发酵过程)。
BV.根据实施方案BR的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中所述脱氧胆酸是通过回流氯化钠和通式INT A11的化合物的反应混合物而获得的。
BW.根据实施方案BQ的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中所述脱氧胆酸是通过使通式Int A10的化合物与氢氧化钠反应获得的。
BX.根据实施方案BK-BW中任一项的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其进一步包含以下步骤：
i)提供通式Int 7的中间体：
Figure BDA0002552014940001041
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；和
R3为H、R2或醇保护基团。
ii)将通式Int A7的中间体还原成通式Int A8的中间体。
BY.根据实施方案BX的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其进一步包含以下步骤：
i)提供通式Int 6的中间体：
Figure BDA0002552014940001042
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；和
R3为H、R2或醇保护基团。
ii)将通式Int A6的中间体还原成通式Int A7的中间体。
BZ.根据实施方案BY的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其进一步包含以下步骤：
i)提供通式Int A5的中间体：
Figure BDA0002552014940001051
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；和
R3为H、R2或醇保护基团。
ii)将通式Int A5的中间体还原成通式Int A6的中间体。
CA.根据实施方案BZ的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其进一步包含以下步骤：
i)提供通式Int A3的中间体：
Figure BDA0002552014940001052
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；和
R3为H、R2或醇保护基团。
ii)将通式Int A3的中间体氧化成通式Int A5的中间体。
CB.根据实施方案CA的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其进一步包含以下步骤：
i)提供通式Int A2的中间体：
Figure BDA0002552014940001061
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
ii)将通式Int A2的中间体还原成通式Int A3的中间体。
CC.根据实施方案CB的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其进一步包含以下步骤：
i)提供通式Int A1的中间体：
Figure BDA0002552014940001062
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；和
R3为H、R2或醇保护基团。
ii)将通式Int A1的中间体转化成通式Int A2的中间体。
CD.根据实施方案CC的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其进一步包含以下步骤：
i)提供通式SM-a的化合物：
Figure BDA0002552014940001071
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
ii)还原，并任选地将醇保护基团加入到通式SM-a的化合物中以得到通式Int A1的中间体：
CE.根据前述实施方案BA-CD中任一项的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中脱氧胆酸或其药学上可接受的盐可通过氢同位素或其它天然存在的同位素或其它适用的标记的差异进一步与动物来源的脱氧胆酸相区别。
CF.通式Int A10的化合物
Figure BDA0002552014940001072
其中R5为甲基或乙基；并且
其中化合物的碳原子仅衍生自植物来源。
CG.通式Int A11的化合物
Figure BDA0002552014940001073
其中化合物的碳原子仅衍生自植物来源。
CH.脱氧胆酸混合物，其包含如根据实施方案BA-CE中任一项所述的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，和从动物来源获得的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐。
CI.一种制备脱氧胆酸(DCA)或其药学上可接受的盐的方法，其包括以下步骤：
i)提供通式SM-a的化合物：
Figure BDA0002552014940001081
ii)还原通式SM-a的化合物以获得通式Int A1的中间体:
Figure BDA0002552014940001082
iii)将通式Int A1的中间体转化成通式Int A2的中间体：
Figure BDA0002552014940001083
iv)将通式Int A2的中间体还原为通式Int A3的中间体：
Figure BDA0002552014940001091
v)将通式Int A3的中间体氧化成通式Int A5的中间体：
Figure BDA0002552014940001092
vi)将通式Int A5的中间体还原为通式Int A6的中间体：
Figure BDA0002552014940001093
vii)将通式Int A6的中间体还原为通式Int A7的中间体：
Figure BDA0002552014940001094
viii)将通式Int A7的化合物还原为通式Int A8的中间体：
Figure BDA0002552014940001101
ix)将通式Int A8中的伯醇转化成离去基团(X)以获得通式Int A9的中间体:
Figure BDA0002552014940001102
其中X是OMs、OTs或卤素，优选Cl、Br或I；
x)将通式Int A9的化合物转化成脱氧胆酸(DCA)：
Figure BDA0002552014940001103
通过途径P1的方法：
Pi)将通式Int A9的化合物转化成通式Int A10的化合物:
Figure BDA0002552014940001104
Pii)任选地，将通式Int A10的化合物转化成通式Int A11的化合物:
Figure BDA0002552014940001111
Piii)延长通式Int A10或Int A11的化合物的碳链以获得脱氧胆酸(DCA)或通过途径P2：
Pi’)将通式Int A9转化成通式A10b的化合物
Figure BDA0002552014940001112
Pii’)水解通式Int A10b的化合物以得到脱氧胆酸(DCA)
x)任选地将脱氧胆酸转化成其药学上可接受的盐，
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
P为醇保护基团；
R3为H、R2或醇保护基团；
R5为甲基或乙基。
CJ.根据权利要求13所述的方法，其中使用丙二酸二乙酯(优选从植物来源(例如糖发酵)获得)将通式Int A9的化合物转化为通式Int A10的化合物。
CK.根据权利要求13所述的方法，其中所述乙腈是由乙酸制备的，所述乙酸是从植物来源获得的(例如来自发酵过程)。
CL.根据权利要求13-14中任一项所述的方法，其中所述脱氧胆酸是通过回流氯化钠和通式Int A11的化合物的反应混合物而获得的。
CM.根据权利要求13-14和16中任一项所述的方法，其中所述脱氧胆酸是通过使通式Int A10的化合物与氢氧化钠反应获得的。
CN.通式Int A10的化合物
Figure BDA0002552014940001121
其中R5为甲基或乙基。
通过实施方案CI-CM中任一项所述的方法获得。
CO.通式Int A11的化合物
Figure BDA0002552014940001122
通过实施方案CI-CM中任一项所述的方法获得。
CP.通式Int A10b的化合物
Figure BDA0002552014940001123
通过实施方案CI-CM中任一项所述的方法获得，并且
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
P是醇保护基团；并且
R3为H、R2或醇保护基团。

Claims (21)

1.式(DCA)的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0002552014930000011
其中所述脱氧胆酸或其药学上可接受的盐包含小于3％的化石碳百分比，例如小于1％，例如小于0.1％，例如小于0.01％，并且其中所述脱氧胆酸具有在-20‰至-40‰范围内的平均δ13C值。
2.根据权利要求1所述的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中所述脱氧胆酸或其药学上可接受的盐的碳原子仅衍生自植物来源。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中所述脱氧胆酸或其药学上可接受的盐的碳原子仅或部分衍生自植物来源，例如部分衍生自植物甾醇或植物甾醇衍生物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中所述脱氧胆酸具有在-21‰至-35‰范围内的平均δ13C值，如-20‰至-32‰，如-25‰至-28‰，如约-26‰。
5.式(DCA)的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0002552014930000012
通过以下方式获得
i)提供通式Int A8的中间体：
Figure FDA0002552014930000021
和
ii)延长通式Int A8的化合物的碳链以获得脱氧胆酸(DCA):
Figure FDA0002552014930000022
其中所述化合物和中间体的所有碳原子都衍生自植物来源。
6.根据权利要求5所述的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中所述脱氧胆酸或其药学上可接受的盐包含小于3％的化石碳百分比，例如小于1％，如小于0.1％，例如小于0.01％，并且其中所述脱氧胆酸具有在-20‰至-40‰范围内的平均δ13C值。
7.根据权利要求6所述的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中所述脱氧胆酸具有在-21‰至-35‰范围内的平均δ13C值，如-20‰至-32‰，如-25‰至-28‰，如约-26‰。
8.根据权利要求6-7中任一项所述的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中如下所述将通式Int A8的化合物的碳链延长为DCA:
i)将通式Int A8中的伯醇转化成离去基团(X)以获得通式Int A9的中间体：
Figure FDA0002552014930000031
其中X是OMs、OTs或卤素，优选Cl、Br或I；和
ii)延长通式Int A9的化合物的碳链以获得DCA：
Figure FDA0002552014930000032
9.根据权利要求8的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中将通式Int A9的化合物转化为Int A10，然后将Int A10转化为DCA。
Figure FDA0002552014930000033
其中R5为甲基或乙基。
10.根据权利要求9所述的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐，其中将Int A10转化为IntA11，将Int A11转化为DCA。
Figure FDA0002552014930000034
11.通式Int A10的化合物
Figure FDA0002552014930000041
其中R5为甲基或乙基；并且
其中化合物的碳原子仅衍生自植物来源。
12.通式Int A11的化合物
Figure FDA0002552014930000042
其中化合物的碳原子仅衍生自植物来源。
13.脱氧胆酸混合物，其包含如权利要求1-10中任一项所述的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐和从动物来源获得的脱氧胆酸或其药学上可接受的盐。
14.制备脱氧胆酸(DCA)或其药学上可接受的盐的方法，包括以下步骤：
i)提供通式SM-a的化合物：
Figure FDA0002552014930000043
ii)还原通式SM-a的化合物以获得通式Int A1的中间体:
Figure FDA0002552014930000051
iii)将通式Int A1的中间体转化成通式Int A2的中间体：
Figure FDA0002552014930000052
iv)将通式Int A2的中间体还原为通式Int A3的中间体：
Figure FDA0002552014930000053
v)将通式Int A3的中间体氧化成通式Int A5的中间体：
Figure FDA0002552014930000054
vi)将通式Int A5的中间体还原为通式Int A6的中间体：
Figure FDA0002552014930000061
vi)将通式Int A6的中间体还原为通式Int A7的中间体：
Figure FDA0002552014930000062
viii)将通式Int A7的化合物还原为通式Int A8的中间体：
Figure FDA0002552014930000063
ix)将通式Int A8中的伯醇转化成离去基团(X)以获得通式Int A9的中间体:
Figure FDA0002552014930000064
其中X是OMs、OTs或卤素，优选Cl、Br或I；
x)将通式Int A9的化合物转化成脱氧胆酸(DCA)：
Figure FDA0002552014930000071
通过途径P1的方法：
Pi)将通式Int A9的化合物转化成通式Int A10的化合物：
Figure FDA0002552014930000072
Pii)任选地，将通式Int A10的化合物转化成通式Int A11的化合物：
Figure FDA0002552014930000073
Piii)延长通式Int A10或Int A11的化合物的碳链以获得脱氧胆酸(DCA)或通过途径P2的方法：
Pi’)将通式Int A9转化成通式A10b的化合物
Figure FDA0002552014930000074
Pii’)水解通式Int A10b的化合物以得到脱氧胆酸(DCA)
x)任选地将脱氧胆酸转化成其药学上可接受的盐，
其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
P为醇保护基团；
R3为H、R2或醇保护基团；并且
R5为甲基或乙基。
15.根据权利要求14所述的方法，其中使用丙二酸二乙酯(优选从植物来源(例如糖发酵)获得)将通式Int A9的化合物转化为通式Int A10的化合物。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述乙腈是由乙酸制备的，所述乙酸是从植物来源(例如从发酵过程)获得的。
17.根据权利要求14-15中任一项所述的方法，其中所述脱氧胆酸是通过回流氯化钠和通式Int A11的化合物的反应混合物而获得的。
18.根据权利要求14-15和权利要求17中任一项所述的方法，其中所述脱氧胆酸是通过使通式Int A10的化合物与氢氧化钠反应获得的。
19.通式Int A10的化合物
Figure FDA0002552014930000081
其中R5为甲基或乙基；并且
通过如权利要求14-18中任一项所述的方法获得。
20.通式Int A11的化合物
Figure FDA0002552014930000091
通过如权利要求14-18中任一项所述的方法获得。
21.通式Int A10b的化合物
Figure FDA0002552014930000092
通过如权利要求14-18中任一项所述的方法获得，并且其中
R2为H或直链的或支链的C1-C6烷基；
P为醇保护基团；
R3为H、R2或醇保护基团。
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