CN113135971B - 一种失碳胆甾醛及其制备方法和用途 - Google Patents

一种失碳胆甾醛及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种失碳胆甾醛及其制备方法和用途。该失碳胆甾醛是如式(I)所示的化合物、或其盐、或其立体异构体。其中，R1、R2分别独立选择氢、C1～C6烷基、卤素、羟基、羧基、醛基、氨基或硝基。本发明失碳胆甾醛具有良好的抑菌活性，特别是对于艰难梭菌具有良好的抑制效果，可以用于制备抑制艰难梭菌的药物。同时，以本发明失碳胆甾醛为起始原料可以制备失碳鹅去氧胆酸、失碳胆甾醇和鹅去氧胆酸，并且收率高，优于现有技术。此外，本发明提供了多种失碳胆甾醛的制备方法，该制备方法收率和纯度高，且该制备方法使用的原料鸭胆酸来源广、成本低，开辟了将一种工业废料鸭胆酸废物利用的工业化方法，使得制备方法工业化更加可行。

Description

一种失碳胆甾醛及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种失碳胆甾醛及其制备方法和用途。
背景技术
天然来源的胆酸类化合物属于胆甾醇类化合物，一般都含有24个碳原子。如果其侧链降解1个CH2，末端仍为羧基，则为失碳类胆酸衍生物。失碳胆酸不仅具有不同的生理活性，并且可以作为起始原料，衍生出各种不同用途的失碳化合物。例如熊去氧胆酸侧链降解1个CH2，则为失碳熊去氧胆酸。后者在治疗胆淤型肝硬化方面相比前者更具有优势。
Figure BDA0002376491520000011
鹅去氧胆酸侧链降解1个碳的失碳鹅去氧胆酸，其作为起始原料，衍生出的化合物已经在脂肪肝治疗等领域有潜在应用。
Figure BDA0002376491520000012
如果降解一个CH2单元，但末端羧基被还原为羟基，则为失碳胆甾醇类化合物。文献Synthesis of sulfonate analogs of bile acids(Kenji Kihira,Takahiro Mikami,Seiichiro lkawa等.Steroids,1992,57(4):193-198.)以及文献Modification onUrsodeoxycholic Acid(UDCA)Scaffold.Discovery of Bile Acid Derivatives AsSelective Agonists of Cell-Surface G-Protein Coupled Bile Acid Receptor 1(GP-BAR1)(Sepe Valentina,Renga Barbara,Festa Carmen等.Journal of MedicinalChemistry.2014,57(18):7687-7701.)分别报道了一种失碳胆甾醇，分别为3α,7α-dihydroxy-24-nor-5β-cholan-23-ol以及3α,7β-dihydroxy-24-nor-5β-cholan-23-ol，如下结构：
Figure BDA0002376491520000021
上述文献中，以前者为原料制备了一些具有不同活性的胆甾醇衍生物，而后者的衍生物也报道具有G蛋白偶联受体激动活性。并且上述失碳胆甾醇均采用了用对应的失碳胆酸还原羧基为羟基的方法制备得到。
失碳胆酸以及胆甾醇的合成一般采用天然来源可获得的胆酸为起始原料进行半合成，但这种方法颇具挑战，原因在于胆酸结构中含有的羟基对反应常常造成干扰。例如失碳鹅去氧胆酸的合成方法文献采用了鹅去氧胆酸降解法，即以鹅去氧胆酸为原料，采用保护和脱保护共3步反应获得。
鸭胆酸是一种天然胆酸，存在与鸭胆胆汁中，来源比较丰富，其结构相比鹅去氧胆酸在侧链上多了一个取代羟基。Klinot Jiri等的文献(Collection of CzechoslovakChemical Communications.1986,51(8):1722-1730)采用以鸭胆酸为原料，高锰酸钾降解法获得了失碳鹅去氧胆酸，但由于高锰酸钾反应活性太强，反应产物比较复杂，采用柱层析结合重结晶，总收率在50％左右，反应如下所示：
Figure BDA0002376491520000022
迄今为止，尚未见到失碳胆甾醛的报道。并且上述合成失碳鹅去氧胆酸的方法也需要优化，提高收率，使之更利于工业化。
发明内容
本发明的目的是提供了一种失碳胆甾醛及其制备方法和用途。
本发明提供了式(I)所示的化合物、或其盐、或其立体异构体：
Figure BDA0002376491520000031
其中，R1、R2分别独立选择氢、C1～C6烷基、卤素、羟基、羧基、醛基、氨基或硝基。
进一步地，所述化合物为式(II)所示：
Figure BDA0002376491520000032
其中，R1、R2分别独立选择氢、C1～C3烷基、卤素、羟基或羧基。
进一步地，所述化合物的结构如式(III)所示：
Figure BDA0002376491520000033
本发明还提供了一种制备前述的化合物的方法，它包括如下步骤：
以鸭胆酸为起始原料，加入氢氧化钠溶液，溶解后加入溶剂、降解剂次氯酸钠溶液，反应，即得；
优选地，所述鸭胆酸、氢氧化钠溶液、次氯酸钠溶液的当量比为1：(1～3)：(1～3)；所述鸭胆酸和溶剂的质量比为1：(1～5)；
和/或，所述氢氧化钠溶液的浓度为5％；
和/或，所述溶解的条件为45-50℃搅拌；
和/或，所述溶剂为乙酸丁酯、乙酸乙酯或乙酸仲丁酯；
和/或，所述次氯酸钠溶液的浓度为10％；
和/或，所述反应的条件为45-60℃，搅拌30-40分钟；
和/或，所述反应后还要提纯，所述提纯方法为：将反应后得到的反应液静置分层，将溶剂层洗涤、干燥、减压浓度，即可；
更优选地，所述鸭胆酸、氢氧化钠溶液、氯酸钠溶液的当量比为1:2:2.5；所述鸭胆酸和溶剂的质量比为1:2～4；
和/或，所述溶剂为乙酸丁酯；
和/或，所述洗涤为依次用5％亚硫酸钠溶液、5％氢氧化钠溶液、饱和食盐水洗涤。
本发明还提供了一种制备前述的化合物的方法，它包括如下步骤：
(1)以鸭胆酸为起始原料，加入甲醇溶解，再加入浓硫酸，反应，得鸭胆酸甲酯甲醇溶液；
(2)鸭胆酸甲酯甲醇溶液中加入甲醇钠，调节pH，加入硼氢化钠，反应，反应后丙酮萃灭，减压浓缩，乙酸丁酯和水混合溶液萃取，将乙酸丁酯层洗涤，得乙酸丁酯层溶液；
(3)在乙酸丁酯层溶液中加水、浓硫酸、高碘酸盐，反应，即得；
优选地，所述鸭胆酸、步骤(1)中的浓硫酸、甲醇钠、硼氢化钠、高碘酸盐的当量比为1：(0.01～0.1)：(0.01～0.1)：(1～2)：(1～2)；所述鸭胆酸、甲醇、水、步骤(3)中的浓硫酸的质量比为1：(1～5)：(1～5)：(0.01～0.1)；
和/或，步骤(1)中，所述反应为加热回流2-3小时；
和/或，步骤(2)中，所述加入甲醇钠时，温度为10～15℃；
和/或，步骤(2)中，所述调节pH为调节pH至7～8；
和/或，步骤(2)中，所述加入硼氢化钠时，温度为10～20℃，分批加入；
和/或，步骤(2)中，所述反应为15～20℃，搅拌反应5～5.5小时；
和/或，步骤(2)中，所述乙酸丁酯和水混合溶液中乙酸丁酯和水的质量比为1：(1～3)；
和/或，步骤(2)中，所述洗涤为依次用5％氢氧化钠溶液、饱和食盐水洗涤；
和/或，步骤(3)中，所述高碘酸盐为高碘酸钠或高碘酸钾；
和/或，步骤(3)中，所述反应为室温搅拌1.5-2小时；
和/或，步骤(3)中，所述反应后还要提纯，所述提纯方法为：将反应后得到的反应液静置分层，将乙酸丁酯层洗涤、干燥、减压浓度，即可；
更优选地，所述鸭胆酸、步骤(1)中的浓硫酸、甲醇钠、硼氢化钠、高碘酸盐的当量比为1:0.05:0.05:1.1:1.1；所述鸭胆酸、甲醇、水、步骤(3)中的浓硫酸的质量比1:3:1:0.05；
和/或，步骤(3)中，所述洗涤为依次用5％亚硫酸钠溶液、5％氢氧化钠溶液、饱和食盐水洗涤。
本发明还提供了一种制备前述的化合物的方法，它包括如下步骤：
以鸭胆酸为起始原料，加入溶剂溶解，然后加入高碘酸盐，反应，乙二醇淬灭反应，即得；
优选地，所述鸭胆酸和高碘酸盐的当量比为1：(1～5)；所述鸭胆酸和溶剂的质量比为1:(1～5)；
和/或，所述溶剂为醋酸水溶液；
和/或，所述高碘酸盐为高碘酸钠或高碘酸钾；
和/或，所述反应为室温下搅拌2-3小时；
和/或，所述淬灭反应后还要提纯，所述提纯方法为：将淬灭反应得到的反应液减压浓缩，乙酸乙酯和水混合溶液萃取，将乙酸乙酯层洗涤，干燥减压后将产物经硅胶柱层析，即可；
更优选地，所述鸭胆酸和高碘酸盐的当量比为1:2；所述鸭胆酸和溶剂的质量比为1:3；
和/或，所述醋酸水溶液的浓度为30％；
和/或，所述乙酸乙酯和水混合溶液中乙酸乙酯和水的质量比为1：(1～3)；
和/或，所述洗涤为采用亚硫酸钠洗涤。
本发明还提供了前述的化合物、或其盐、或其立体异构体在制备抗菌药物中的用途；优选地，所述药物是抗艰难梭菌的药物。
本发明还提供了前述的化合物在制备失碳鹅去氧胆酸中的用途。
进一步地，所述制备失碳鹅去氧胆酸的方法包括如下步骤：
取前述化合物，使用溶剂溶解，加入氧化剂，反应，反应完后，过滤，滤液中加入氢氧化钠溶液，第二次反应，即得；
优选地，所述前述化合物、氧化剂的当量比为1：(1～2)；所述前述化合物、溶剂、氢氧化钠溶液的质量比为5：(10～20)：(1～5)；
和/或，所述溶剂为甲醇；
和/或，所述氧化剂为过氧单磺酸钾或过氧单磺酸钠；
和/或，所述加入氧化剂的温度为0～40℃；
和/或，所述反应为65～70℃反应2～3小时；
和/或，所述氢氧化钠溶液的浓度为10％；
和/或，所述第二次反应为室温搅拌3-4小时；
和/或，所述第二次反应后还要提纯，所述提纯方法为：将反应后的反应液减压浓缩除去溶剂，加水稀释，调节pH至1～2，析出固体，过滤得粗品，将粗品用丙酮打浆1～2次，真空减压干燥，即可；
更优选地，所述前述化合物、氧化剂的当量比为1:1；所述前述化合物、溶剂、氢氧化钠溶液的质量比为5:14:5；
和/或，所述调节pH使用5％盐酸调节。
本发明还提供了前述的化合物在制备鹅去氧胆酸中的用途。
进一步地，所述制备鹅去氧胆酸的方法包括如下步骤：
1)取前述的化合物，使用溶剂溶解，依次加入海因、碱，反应，得中间缩合物；
2)以水为溶剂，氢氧化物和双氧水反应，得过氧化物混悬溶液；
3)在过氧化物混悬溶液中加入步骤1)所得中间缩合物，反应，即得；
优选地，所述前述的化合物、海因、碱、氢氧化物、双氧水的当量比为1：(1～2)：(1～2)：(1～5)：(1～5)；所述前述的化合物与步骤1)所述溶剂的质量比为1：(1～5)；所述前述的化合物与步骤2)所述的水的质量比为1：(1～5)；
和/或，步骤1)中，所述溶剂为95％乙醇；
和/或，步骤1)中，所述碱为哌啶、乙二醇胺或碳酸氢钠；
和/或，步骤1)中，所述反应为加热回流20～25小时；
和/或，步骤2)中，所述氢氧化物为八水氢氧化钡、氢氧化钙或氢氧化镁；
和/或，步骤2)中，所述反应为在氢氧化物水溶液中搅拌滴加双氧水；
和/或，步骤3)中，所述加入步骤1)所得中间缩合物时温度为40～60℃；
和/或，步骤3)中，所述反应为加热回流20～25小时；
和/或，步骤3)中，所述反应后还要提纯，所述提纯方法为：将反应后得到的反应液减压浓缩，加入乙酸丁酯和酸水混合溶液，分层后水层用乙酸丁酯萃取，乙酸丁酯层盐水洗涤，结晶，即可；
更优选地，所述前述的化合物、海因、碱、氢氧化物、双氧水的当量比为1:1.3:1.3:2:2；所述前述的化合物与步骤1)所述溶剂的质量比为1:3；所述前述的化合物与步骤2)所述的水的质量比为1:3；
和/或，步骤3)中，所述加入步骤1)所得中间缩合物时温度为50℃；
和/或，步骤3)中，所述乙酸丁酯和酸水混合溶液中，乙酸丁酯和酸水的质量比为(5～10)：(1～5)；所述酸水为浓盐酸。
本发明还提供了前述的化合物在制备失碳胆甾醇中的用途。
进一步地，所述制备失碳胆甾醇的方法包括如下步骤：
取前述化合物，加入溶剂溶解，加入硼氢化钠，反应，萃灭反应，即得；
优选地，所述前述化合物和硼氢化钠的当量比为1：(1～2)；所述前述化合物和溶剂的质量比为5：(10～20)；
和/或，所述溶剂为甲醇和水的混合溶液；
和/或，加入硼氢化钠时，温度为0～4℃，分批次加入；
和/或，所述反应为0～4℃反应1～2小时；
和/或，所述萃灭反应为使用丙酮萃灭；
和/或，所述萃灭反应还要提纯，所述提纯方法为：将萃灭反应后的反应液减压浓缩后，用乙酸乙酯萃取，洗涤、干燥、浓缩，即可；
更优选地，所述前述化合物和硼氢化钠的当量比为1:1.1；所述前述化合物和溶剂的质量比为5:14；
和/或，所述甲醇和水的混合溶液中，甲醇和水的质量比为2:1。
本发明还提供了一种药物，它是以前述的化合物、或其盐、或其立体异构体为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
本发明中，碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀(Ca～Cb)烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。因此，例如，C1～C6烷基是指包含1～6个碳原子的直链或支链烷基。
本发明中，卤素为氟、氯、溴或碘。
本发明中室温为25±5℃，过夜为12±2h。
本发明提供了一种失碳胆甾醛，该失碳胆甾醛具有良好的抑菌活性，特别是对于艰难梭菌具有良好的抑制效果，可以用于制备抑制艰难梭菌的药物。同时，以本发明失碳胆甾醛为起始原料可以制备失碳鹅去氧胆酸、失碳胆甾醇和鹅去氧胆酸，并且收率高，优于现有技术。此外，本发明提供了多种失碳胆甾醛的制备方法，该制备方法收率和纯度高，且该制备方法使用的原料鸭胆酸来源广、成本低，开辟了将一种工业废料鸭胆酸废物利用的工业化方法，使得制备方法工业化更加可行。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1、本发明失碳胆甾醛的制备
使用次氯酸钠降解高含量鸭胆酸原料，制备本发明失碳胆甾醛。具体方法如下：
鸭胆酸100g(含量95％，233mmol，1eq)与373g 5％氢氧化钠溶液(466mmol，2eq)混合，45-50℃搅拌溶清，加入400g乙酸丁酯，加入434g10％次氯酸钠溶液(583mmol，2.5eq)，维持反应温度45-60℃，持续剧烈搅拌30-40分钟。静置分层，水层中尚未氧化完的鸭胆酸回收或继续二次反应。乙酸丁酯层依次用5％亚硫酸钠溶液、5％氢氧化钠溶液、饱和食盐水洗涤后干燥，减压浓缩得到白色膏状固体(本发明失碳胆甾醛)，HPLC纯度>95％。扣除回收鸭胆酸后计算反应收率为91％。
上述其它条件不变，溶剂乙酸丁酯换用乙醚，反应几乎不发生。采用乙酸乙酯或乙酸仲丁酯作为溶剂，收率分别为45％、67％，因此优选乙酸丁酯。
制备得到的失碳胆甾醛结构如下：
Figure BDA0002376491520000081
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ9.80-74(m,1H),3.87(q,J＝3.0Hz,1H),2.48(dd,J＝16.0,3.4Hz,1H),2.32–2.13(m,2H),2.13–1.94(m,5H),1.96–1.86(m,1H),1.87(s,2H),1.88–1.79(m,2H),1.75–1.62(m,3H),1.55–1.45(m,2H),1.48–1.38(m,1H),1.42–1.29(m,1H),1.33–1.10(m,3H),1.04(d,J＝6.6Hz,3H),1.03-0.95(m,1H),0.92(s,3H),0.73(s,3H).
ESI-MS m/z:361.22[M-1]-
实施例2、本发明失碳胆甾醛的制备
使用次氯酸钠降解低含量鸭胆酸原料，制备本发明失碳胆甾醛。具体方法如下：
市售鸭胆膏100g(鸭胆汁粗提物，其中鸭胆酸含量为35％，86mmol，1eq)与138g5％氢氧化钠溶液(172mmol，2eq)混合，45-50℃搅拌溶清，加入200g乙酸丁酯，加入160g10％次氯酸钠溶液(215mmol，2.5eq)，维持反应温度45-60℃，持续剧烈搅拌30-40分钟。静置分层，水层中尚未氧化完的鸭胆酸回收或继续二次反应。乙酸丁酯层依次用5％亚硫酸钠溶液、5％氢氧化钠溶液、饱和食盐水洗涤后干燥，减压浓缩得到白色膏状固体(经检测，为本发明失碳胆甾醛)，HPLC纯度>95％。扣除回收鸭胆酸后计算反应收率为89％。
实施例3、本发明失碳胆甾醛的制备
使用高碘酸盐(高碘酸钠或高碘酸钾)三步降解高含量鸭胆酸原料，制备本发明失碳胆甾醛。具体方法如下：
步骤1：鸭胆酸100克(含量95％，233mmol，1eq)，300克甲醇溶解，加入浓硫酸1.1g(11mmol，0.05eq)，加热回流2-3小时，至鸭胆酸反应完全。得到鸭胆酸甲酯甲醇溶液，不用处理，直接进行下步反应。
步骤2：鸭胆酸甲酯甲醇溶液，温度降低至10-15℃；缓慢加入甲醇钠0.6g(11mmol，0.05eq)，调节pH＝7-8；控制物料温度在10-20℃，搅拌下分批加入硼氢化钠9.7g(256mmol，1.1eq)，硼氢化钠加料结束后，保持温度15-20℃，搅拌反应5-5.5小时，点板监测反应，至鸭胆酸甲酯反应完全。加入丙酮萃灭，减压浓缩后，用乙酸丁酯和水的混合溶液(混合溶液中乙酸丁酯为100g，水为100g)进行萃取，分出乙酸丁酯层，依次用5％氢氧化钠溶液、饱和食盐水洗涤，得到乙酸丁酯层溶液直接用于下步反应。
步骤3：在上步乙酸丁酯层溶液中加入水100g，加入浓硫酸5g，搅拌下分批次加入高碘酸钠54.8g(256mmol，1.1eq)，室温搅拌1.5-2小时，至反应完全。静置分去水层，水层回收高碘酸钠。乙酸丁酯层依次用5％亚硫酸钠溶液、5％氢氧化钠溶液、饱和食盐水洗涤后干燥，减压浓缩得到白色膏状固体(经检测，为本发明失碳胆甾醛)，HPLC纯度>95％，三步收率86％。
实施例4、本发明失碳胆甾醛的制备
使用高碘酸盐(高碘酸钠或高碘酸钾)一步降解高含量鸭胆酸原料，制备本发明失碳胆甾醛。具体方法如下：
鸭胆酸100克(含量95％，233mmol，1eq)，300g 30％醋酸水溶液溶解，加入2当量高碘酸钠或高碘酸钾，室温搅拌2小时直至鸭胆酸反应完全，乙二醇淬灭反应。减压浓缩后采用乙酸乙酯和水的混合溶液(混合溶液中乙酸乙酯为300g，水为100g)进行萃取分配，乙酸乙酯层采用亚硫酸钠洗涤后，干燥减压浓缩得到淡红膏状物，硅胶柱层析得到失碳胆甾醛。反应收率65％。
实施例5、以本发明失碳胆甾醛为原料制备失碳鹅去氧胆酸
上述实施例1制备得到的失碳胆甾醛500g(1374mmol，1.0eq)，加入1400g甲醇溶解，用冷水控温，保持40℃以下，分批次加入过氧单磺酸钾844g(1374mmol，1eq)。加完后，升温65-70℃反应2-3小时，薄层层析点板确认失碳胆甾醛消耗完全。反应物料降至室温，过滤除去无机盐，滤液加入500g10％氢氧化钠溶液，室温搅拌3-4小时。反应完全后，减压浓缩除去甲醇，剩余油状物加入500g水稀释，搅拌下用5％盐酸调pH1-2，析出固体，过滤得失碳鹅去氧胆酸粗品，粗品用丙酮加热打浆1-2次，真空减压干燥后得到失碳鹅去氧胆酸466克，收率为89％。本发明以鸭胆酸为原料两步制备得到失碳鹅去氧胆酸总收率为80.1％。
实施例6、以本发明失碳胆甾醛为原料制备失碳胆甾醇
上述实施例1制备得到的失碳胆甾醛500g(1374mmol，1.0eq)，加入1400g甲醇和水混合溶液(甲醇和水的体积比为2:1)溶解，冷却至0℃左右，搅拌下分批次加入硼氢化钠57g(1507mmol，1.1eq)，保温反应1-2小时，点板确认原料消耗完全。加入丙酮萃灭，减压浓缩后，用乙酸乙酯分次萃取水层，洗涤干燥浓缩得到失碳胆甾醇490克，收率为97％。
实施例7、以本发明失碳胆甾醛为原料制备鹅去氧胆酸
步骤1：按实施例1制备得到的失碳胆甾醛500克(1374mmol，1.0eq)，1500克95％乙醇溶解，依次加入海因179g(1790mmol，1.3eq)，哌啶152g(1790mmol，1.3eq)，加热回流20～25小时，至失碳胆甾醛反应完全。得到中间缩合物乙醇溶液，不用精制，直接进行下步反应。
步骤2：在5000ml反应瓶中加入八水氢氧化钡866g(2748mmol，2.0eq)、水1500g，搅拌下滴入双氧水346g(含量27％，2748mmol，2.0eq)，得到过氧化钡混悬溶液，步骤1得到的中间缩合物乙醇溶液控制在内温50℃左右滴入，混合物加热回流24小时，直至中间缩合物反应完全。减压浓缩乙醇后加入乙酸丁酯和浓盐酸的混合溶液(混合溶液中，乙酸丁酯为500g，浓盐酸为100g)萃取分层，水层再用500克乙酸丁酯分多次萃取，乙酸丁酯层盐水洗涤，结晶，析出白色粉末状固体，过滤干燥后得到鹅去氧胆酸409克，两步收率76％。本发明以鸭胆酸为原料，按实施例1方法制备失碳醛后再按本实施例7制备得到鹅去氧胆酸，总收率为69.2％。
上述其他条件不变，用氢氧化钙和氢氧化镁分别替代八水氢氧化钡与双氧水进行反应，即降解剂分别为过氧化镁或过氧化钙，其也可得到鹅去氧胆酸，总收率分别为49.8％和53.4％。
实施例8、本发明失碳胆甾醛抑菌效果研究
1、实验方法
实验选取ATCC BBA1870、ATCC 700057、ATCC 630共3种艰难梭菌菌株，以添加补充剂的布式琼脂培养基测试。-80℃甘油冻存的菌株接到固体琼脂培养基上。放置37℃培养箱厌氧培养24～48h。本发明化合物的测试范围为128μg/ml-0.0625μg/ml，共11个两倍稀释浓度梯度；失碳鹅去氧胆酸作为对照化合物。本发明化合物分别配置成一百倍测试浓度的高浓度工作液，当天使用，溶剂为100％DMSO。对于每个稀释浓度琼脂板的准备，20μl高浓度工作液与2ml的熔化的、添加补充剂的布氏琼脂(45-55℃)混合并加入到六孔板里，待凝固。1％的DMSO作为生长控制。实验当天，挑取适量单菌落悬浮于生理盐水，使用浊度仪将菌液浊度调节至OD600＝0.2，含约1×108cfu/ml。将此2μl菌液直接点在化合物固体稀释琼脂板中。因此六孔板每个孔含约105cfu艰难梭菌。此为测试板。将准备好的所有测试板置于35±2℃厌氧培养48h。培养48h后，通过肉眼观察，完全或显著抑制菌体生长的最低药物浓度为MIC。
2、实验结果
实验结果记录如下表1所示。结果表明，与失碳鹅去氧胆酸相比，失碳醛对3种艰难梭菌菌体的抑制作用明显更高。
表1.本发明化合物抑制艰难梭菌菌体活性MIC值(μg/mL)
Figure BDA0002376491520000111
综上，本发明提供了一种失碳胆甾醛，该失碳胆甾醛具有良好的抑菌活性，特别是对于艰难梭菌具有良好的抑制效果，可以用于制备抑制艰难梭菌的药物。同时，以本发明失碳胆甾醛为起始原料可以制备失碳鹅去氧胆酸、失碳胆甾醇和鹅去氧胆酸，并且收率高，优于现有技术。此外，本发明提供了多种失碳胆甾醛的制备方法，该制备方法收率和纯度高，且该制备方法使用的原料鸭胆酸来源广、成本低，开辟了将一种工业废料鸭胆酸废物利用的工业化方法，使得制备方法工业化更加可行。

Claims (14)

1.式(III)所示的化合物、或其盐：
Figure FDA0004236156920000011
2.一种制备权利要求1所述的化合物的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
以鸭胆酸为起始原料，加入氢氧化钠溶液，溶解后加入溶剂、降解剂次氯酸钠溶液，反应，即得。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述鸭胆酸、氢氧化钠溶液、次氯酸钠溶液的当量比为1：(1～3)：(1～3)；所述鸭胆酸和溶剂的质量比为1：(1～5)；
和/或，所述氢氧化钠溶液的浓度为5％；
和/或，所述溶解的条件为45-50℃搅拌；
和/或，所述溶剂为乙酸丁酯或乙酸乙酯；
和/或，所述次氯酸钠溶液的浓度为10％；
和/或，所述反应的条件为45-60℃，搅拌30-40分钟；
和/或，所述反应后还要提纯，所述提纯方法为：将反应后得到的反应液静置分层，将溶剂层洗涤、干燥、减压浓度，即可。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述鸭胆酸、氢氧化钠溶液、氯酸钠溶液的当量比为1:2:2.5；所述鸭胆酸和溶剂的质量比为1:2～4；
和/或，所述溶剂为乙酸丁酯；
和/或，所述洗涤为依次用5％亚硫酸钠溶液、5％氢氧化钠溶液、饱和食盐水洗涤。
5.一种制备权利要求1所述的化合物的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(1)以鸭胆酸为起始原料，加入甲醇溶解，再加入浓硫酸，反应，得鸭胆酸甲酯甲醇溶液；
(2)鸭胆酸甲酯甲醇溶液中加入甲醇钠，调节pH，加入硼氢化钠，反应，反应后丙酮萃灭，减压浓缩，乙酸丁酯和水混合溶液萃取，将乙酸丁酯层洗涤，得乙酸丁酯层溶液；
(3)在乙酸丁酯层溶液中加水、浓硫酸、高碘酸盐，反应，即得。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述鸭胆酸、步骤(1)中的浓硫酸、甲醇钠、硼氢化钠、高碘酸盐的当量比为1：(0.01～0.1)：(0.01～0.1)：(1～2)：(1～2)；所述鸭胆酸、甲醇、水、步骤(3)中的浓硫酸的质量比为1：(1～5)：(1～5)：(0.01～0.1)；
和/或，步骤(1)中，所述反应为加热回流2-3小时；
和/或，步骤(2)中，所述加入甲醇钠时，温度为10～15℃；
和/或，步骤(2)中，所述调节pH为调节pH至7～8；
和/或，步骤(2)中，所述加入硼氢化钠时，温度为10～20℃，分批加入；
和/或，步骤(2)中，所述反应为15～20℃，搅拌反应5～5.5小时；
和/或，步骤(2)中，所述乙酸丁酯和水混合溶液中乙酸丁酯和水的质量比为1：(1～3)；
和/或，步骤(2)中，所述洗涤为依次用5％氢氧化钠溶液、饱和食盐水洗涤；
和/或，步骤(3)中，所述高碘酸盐为高碘酸钠或高碘酸钾；
和/或，步骤(3)中，所述反应为室温搅拌1.5-2小时；
和/或，步骤(3)中，所述反应后还要提纯，所述提纯方法为：将反应后得到的反应液静置分层，将乙酸丁酯层洗涤、干燥、减压浓度，即可。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述鸭胆酸、步骤(1)中的浓硫酸、甲醇钠、硼氢化钠、高碘酸盐的当量比为1:0.05:0.05:1.1:1.1；所述鸭胆酸、甲醇、水、步骤(3)中的浓硫酸的质量比1:3:1:0.05；
和/或，步骤(3)中，所述洗涤为依次用5％亚硫酸钠溶液、5％氢氧化钠溶液、饱和食盐水洗涤。
8.一种制备权利要求1所述的化合物的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
以鸭胆酸为起始原料，加入溶剂溶解，然后加入高碘酸盐，反应，乙二醇淬灭反应，即得。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述鸭胆酸和高碘酸盐的当量比为1：(1～5)；所述鸭胆酸和溶剂的质量比为1:(1～5)；
和/或，所述溶剂为醋酸水溶液；
和/或，所述高碘酸盐为高碘酸钠或高碘酸钾；
和/或，所述反应为室温下搅拌2-3小时；
和/或，所述淬灭反应后还要提纯，所述提纯方法为：将淬灭反应得到的反应液减压浓缩，乙酸乙酯和水混合溶液萃取，将乙酸乙酯层洗涤，干燥减压后将产物经硅胶柱层析，即可。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述鸭胆酸和高碘酸盐的当量比为1:2；所述鸭胆酸和溶剂的质量比为1:3；
和/或，所述醋酸水溶液的浓度为30％；
和/或，所述乙酸乙酯和水混合溶液中乙酸乙酯和水的质量比为1：(1～3)；
和/或，所述洗涤为采用亚硫酸钠洗涤。
11.权利要求1所述的化合物、或其盐在制备抗菌药物中的用途；所述药物是抗艰难梭菌的药物。
12.一种利用权利要求1所述的化合物制备鹅去氧胆酸中的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1)取权利要求1所述的化合物，使用溶剂溶解，依次加入海因、碱，反应，得中间缩合物；
2)以水为溶剂，氢氧化物和双氧水反应，得过氧化物混悬溶液；
3)在过氧化物混悬溶液中加入步骤1)所得中间缩合物，反应，即得；
所述权利要求1所述的化合物、海因、碱、氢氧化物、双氧水的当量比为1：(1～2)：(1～2)：(1～5)：(1～5)；所述权利要求1所述的化合物与步骤1)所述溶剂的质量比为1：(1～5)；所述权利要求1所述的化合物与步骤2)所述的水的质量比为1：(1～5)；
步骤1)中，所述溶剂为95％乙醇；
步骤1)中，所述碱为哌啶、乙二醇胺或碳酸氢钠；
步骤1)中，所述反应为加热回流20～25小时；
步骤2)中，所述氢氧化物为八水氢氧化钡；
步骤2)中，所述反应为在氢氧化物水溶液中搅拌滴加双氧水；
步骤3)中，所述加入步骤1)所得中间缩合物时温度为40～60℃；
步骤3)中，所述反应为加热回流20～25小时；
步骤3)中，所述反应后还要提纯，所述提纯方法为：将反应后得到的反应液减压浓缩，加入乙酸丁酯和酸水混合溶液，分层后水层用乙酸丁酯萃取，乙酸丁酯层盐水洗涤，结晶，即可。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述权利要求1所述的化合物、海因、碱、氢氧化物、双氧水的当量比为1:1.3:1.3:2:2；所述权利要求1所述的化合物与步骤1)所述溶剂的质量比为1:3；所述权利要求1所述的化合物与步骤2)所述的水的质量比为1:3；
和/或，步骤3)中，所述加入步骤1)所得中间缩合物时温度为50℃；
和/或，步骤3)中，所述乙酸丁酯和酸水混合溶液中，乙酸丁酯和酸水的质量比为(5～10)：(1～5)；所述酸水为浓盐酸。
14.一种药物，它是以权利要求1所述的化合物、或其盐为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。
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