CN102164944A - 加工微生物生产的环状寡肽的方法 - Google Patents

加工微生物生产的环状寡肽的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102164944A
CN102164944A CN200980137840XA CN200980137840A CN102164944A CN 102164944 A CN102164944 A CN 102164944A CN 200980137840X A CN200980137840X A CN 200980137840XA CN 200980137840 A CN200980137840 A CN 200980137840A CN 102164944 A CN102164944 A CN 102164944A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cyclosporin
neoral
ether
crystallization
weight
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN200980137840XA
Other languages
English (en)
Inventor
S·贝特尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sandoz AG
Original Assignee
Sandoz AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sandoz AG filed Critical Sandoz AG
Publication of CN102164944A publication Critical patent/CN102164944A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/645—Cyclosporins; Related peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及加工微生物生产的、非极性环状寡肽的方法，其包含以下步骤：a)用不与水混合的液体含醚提取剂提取在微生物生产中产生的全部发酵液，其中提取剂的量足够与全部发酵液形成两相系统，本发明还涉及新的环孢菌素A和甲基叔丁基醚的溶剂化物。

Description

加工微生物生产的环状寡肽的方法
本发明涉及加工微生物生产的、非极性环状寡肽的方法，和环孢菌素A和甲基叔丁基醚的新型溶剂化物，所述方法包含以下步骤：a)用不与水混合的液体含醚提取剂提取在微生物生产中积聚的全部发酵液或醪液，其中提取剂的量足够与全部发酵液一起形成两相系统。
环状寡肽特别是十一肽，是早就知道的微生物代谢物之一。在十一肽中，特别是环孢菌素变得越来越重要。
环孢菌素特别是环孢菌素A，是珍贵的药物活性物质，其可作为免疫抑制剂使用，特别是在器官移植中。环孢菌素还适于治疗疾病，例如糖尿病和牛皮癣，和许多自身免疫疾病，例如类风湿性关节炎和慢性炎症。由于其对人免疫缺陷病毒(HIV)的抑制作用，环孢菌素特别是环孢菌素A也适用于对抗由HIV引起的疾病。此外，环孢菌素特别是环孢菌素A已显示在涉及癌细胞对化学治疗剂例如长春新碱或柔红霉素的致敏中具有药物作用。环孢菌素特别是环孢菌素A的神经保护和再生性能也可用于多种神经性适应症，例如阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化和帕金森病。
如上所述，环状十一肽例如环孢菌素可通过微生物过程制备。
具体来说，环孢菌素A可通过真菌物种菌株即柱孢霉菌(Cylindrocarpon lucidum Booth)或真菌物种菌株即膨大弯颈霉(Tolypocladium inflatum Gams)制备。此弯颈霉属真菌物种菌株最初被认为是多孢木霉(Trichoderma polysporum)真菌物种菌株，在美国农业部(北方研究及开发部)(United States Department of Agriculture(Northern Research and Development Division)，Peoria，IL，U.S.A)保藏，编号为NRRL 8044。前一种真菌物种菌株即柱孢霉菌也在美国农业部(北方研究及开发部)Peoria，IL，U.S.A保藏，编号为NRRL 5760。用于环孢菌素特别是环孢菌素A的微生物制备的其他菌株为真菌物种菌株Tolypocladium geodes，柱孢弯颈霉(Tolypocladium cylindrosporum)和弯颈霉属物种LeA3(Tolypocladium sp.LeA3)，后一种菌株依照布达佩斯条约在荷兰霉菌微生物中央局(Central Office for Mold Cultures in Holland)的存放处保藏，编号为CBS 630.92。
通过微生物过程的环孢菌素的大规模生产具有重要意义。为此，已经进行了许多试验通过发现和培养所述真菌物种或新的真菌物种的高效菌株改进微生物生产。上述菌株是这些努力的示例。
然而，在环孢菌素的大规模微生物生产中，重要的不仅是高效的发酵过程，还有对发酵得到的代谢物的有效加工。
根据从例如DOS 2455859和DD-B-298276中得到的从全部发酵液即培养液中分离环孢菌素特别是环孢菌素A的方法，有可能通过过滤或离心从培养液中分离具有产物的生物质，或加工全部发酵液，即不分离生物质。
根据第一种加工变型，优选用甲醇或丙酮重复提取包括代谢物的分离的生物质，将分离的提取物优选的浓缩为水性残留物，优选的用例如氯乙烯或氯仿提取几次。优选的相应的也提取从生物质分离的培养滤出液。
根据第二种不分离生物质的加工变型，特别使用上述溶剂即氯乙烯或氯仿提取培养液即全部发酵液，浓缩几次后分离的有机相在填充不同洗脱液的不同固定相柱上层析以用于进一步加工。考虑使用Sephadex LH-20作为固定相柱材料和甲醇作为洗脱液，以及氧化铝作为柱材料和甲苯/乙酸乙酯作为洗脱液。
相应的层析处理也可在第一种加工类型中使用，从氯乙烯或氯仿提取物收集的残留物通过柱材料即硅胶组合氯仿洗脱液和Sephadex LH-20柱材料组合甲醇洗脱液进行纯化，进一步被分离为期望的产物，优选的为环孢菌素A。
与这些以前已知的加工方法相比，(本发明的)目的是提供技术上有优势的、与环境相容和高效的加工方法，其用于微生物生产的环状寡肽，特别是十一肽例如环孢菌素，并具有非常好的产物产量和纯度。具体来说，目的是降低应用的有机溶剂数量和获得其再循环能力，从而使加工方法特别在生态学方面更有效。
通过提供根据本发明的用于加工微生物生产的、非极性环状寡肽的方法达到此目的，所述方法包含以下步骤：
a)用不与水混合的液体含醚提取剂提取在微生物生产中积聚的全部发酵液，其中提取剂的量足够与全部发酵液一起形成两相系统。
根据本发明的方法可加工优选的具有5至15个肽键的微生物生产的、非极性环状寡肽。根据本发明，将术语“寡肽”理解为包含特定数量肽键的有机化合物，优选的只具有2个连续的被2个中间碳原子分隔的环系统氮原子。优选的通过本发明的加工方法分离非极性环状8-13个氨基酸的寡肽，更优选十一肽。此方法特别适用于加工微生物生产的、非极性环状十一肽，例如环孢菌素，特别是环孢菌素A。
根据本发明，必须将作为亲脂性化合物在25℃具有＜0.1g/L水的水溶性的环状寡肽，特别是十一肽，例如环孢菌素理解为非极性的。
通过上述特定真菌物种菌株进行所述产物的微生物生产是本领域技术人员熟知的。德国公开印刷物2455859不仅在第3-4页公开了真菌菌株NRRL 5760和NRRL 8044的培养，还在第4-5页和实施例1描述了生产环孢菌素的发酵过程。
此方法也应用于在WO 94/16091的第3-5页公开的弯颈霉属物种LeA3菌株的培养，WO 94/16091的实施例1和2描述了使用此真菌生产环孢菌素的发酵过程。其他微生物方法特别的在DD-B-298276，EP-A-0507968，US 5156960中公开。
根据本发明，可通过提取从在微生物生产中积聚的培养液即全部发酵液中得到期望的产物。为此，将全部发酵液与不与水混合的液体含醚提取剂混合，其中提取剂的量足够与全部发酵液一起形成两相系统。本领域技术人员已知在2个共存的液相中，发酵过程中的固体颗粒也存在上述系统中，其被包含在水相。
根据本发明，将不与水混合的液体提取剂理解为在20℃与水具有至少一个混溶性区的提取剂。在所述区域，液体提取剂与水至少不完全的混合或在水中不完全可溶，从而出现相的分离。
优选的，根据本发明使用的这些不与水混合的含醚提取剂具有最大0.9g/cm3的密度，优选0.6-0.85g/cm3的密度，更优选的0.7-0.8g/cm3，分别在20℃测量。
优选的，含醚提取剂基本上由一种或多种醚组成，更优选的由至少一种具下述通式的醚组成：
R1-O-R2
其中，R1和R2独立的代表线性或分支的具有C1至C5的烷基，和残基R1和R2中至少一个具有至少3个C原子，优选的至少4个C原子。
特别优选的可用于提取的醚具有至少1种选自二异丙醚、二正丙醚、二叔丁醚、二异丁醚、甲基叔丁基醚、乙基叔丁基醚、丙基叔丁基醚和正丁基叔丁基醚的醚，特别优选使用甲基叔丁基醚。
因此，本发明的另一个主题也涉及优选的具有在20℃测量最大0.9g/cm3密度的不与水混合的液体含醚提取剂作为从微生物生产中积聚的所有发酵液中提取微生物生产的、非极性环状寡肽，优选十一肽，更优选环孢菌素，最优选环孢菌素A的方式的用途。优选的上述所列的醚以指示的量用于根据本发明的此用途以与全部发酵液形成两相系统。
优选的在pH7至9，优选7.5至8.5提取全部发酵液，特别是当环孢菌素，更优选的环孢菌素A已被分离和加工时。
为了加快相分离，可以足够的量在全部发酵液中加入已知的水溶性湿润剂，例如基于聚丙烯酸酯的湿润剂。
优选的进行几次提取。更优选的，使用含醚提取剂优选的提取2次全部提取液。
优选使用不与水混合的含醚提取剂在室温，更优选的在20至30℃提取全部发酵液。
全部发酵液的提取可在传统仪器中进行，分离水相后，合并在提取中收集的具有生物质的提取物用于进一步加工。
因此，方法步骤a)之后优选的进行另一个方法步骤b)，根据步骤b)在提取物中存在的残留水含量降至低于以重量计的1％，优选的低于以重量计的0.3％。在降低残留水含量之前，提取物优选的用水溶液，优选的用水洗涤以任选的去除存在的生物质残留物。为了降低用此方法任选纯化的提取物中的残留水含量，有可能进行共沸蒸馏。就此点而言，不仅将提取物中的残留水含量降低至期望的程度，而且微生物生产的产物，优选环孢菌素，更优选环孢菌素A的浓度也增加了。在此浓缩中将环孢菌素的含量调节至优选的以重量计的10至35％。
作为步骤b)中共沸蒸馏的结果，有可能不仅将提取物中的残留水含量调节至期望的低水含量，而且将提取物浓度调节为对加工产物后续结晶有利的浓度，优选的将所述产物结晶为环孢菌素-醚-溶剂化物。已发现当残留水含量低于以重量计的1％，特别是低于以重量计的0.3％时，环孢菌素以环孢菌素-醚-溶剂化物形式结晶，特别是环孢菌素A以环孢菌素A-醚-溶剂化物形式的结晶显著更好，得到易于过滤的几乎无色、白色的环孢菌素-醚-溶剂化物结晶。已经非常纯的环孢菌素-醚-溶剂化物结晶的易于过滤能力额外易化和缩短了整个加工方法。
相应的，根据本发明的加工微生物生产的产物，优选环孢菌素，更优选环孢菌素A的方法包含另外的方法步骤c)，根据步骤c)通过将在步骤b)中浓缩的几乎没有残留水含量的提取物冷却至-10℃至15℃的温度，优选的-5℃至10℃的温度以得到醚溶剂化物产物，优选环孢菌素-醚-溶剂化物的结晶。优选的，当结晶不溶于几乎没有残留水含量的浓缩提取物时，不需要加入有机溶剂以结晶出环孢菌素-醚-溶剂化物结晶，因为通过冷却浓缩的提取物已经可以得到可以很好过滤的几乎无色、白色的结晶。在适当的情况下，可以用在其中结晶仅缓慢溶解的有机溶剂洗涤结晶，优选环孢菌素-醚-溶剂化物结晶以用于进一步纯化。
在适当的情况下，在合适的已知溶剂中通过已知的层析纯化和结晶可将环孢菌素-醚-溶剂化物结晶分离为环孢菌素A-Z(就此点而言还可见WO97/46575，EP0725076，EP 0888382)。
相应的，本发明的另一个主题是结晶环孢菌素-醚-溶剂化物在环孢菌素，优选环孢菌素A大规模生产中的用途。特别的，根据本发明得到的结晶环孢菌素-醚-溶剂化物晶体适于此大规模生产。
令人惊讶的，使用根据本发明的含醚提取剂提取全部发酵液，特别是与降低残留水含量的步骤结合后能够结晶具有良好滤过性和高纯度的环孢菌素-醚-溶剂化物结晶。因此，显著易化了整个加工方法。
本发明特别优选的实施方案涉及加工微生物生产的、非极性环孢菌素，优选环孢菌素A的方法，其包含以下步骤：
a)用不与水混合的液体含醚提取剂提取在微生物生产环孢菌素中积聚的全部发酵液，其中提取剂的量足够与全部发酵液形成两相系统，
b)将提取物中溶解的残留水含量降低至低于以重量计的1％，优选低于以重量计的0.3％，其中在合适的情况下，在降低此残留水含量之前，可以用水溶液洗涤步骤a)中得到的提取物，和
c)将环孢菌素结晶为环孢菌素-醚-溶剂化物，其中优选的在结晶前，将步骤b)中得到的提取物浓缩至占全部提取物以重量计10至25％的环孢菌素含量，为了结晶将浓缩提取物冷却至-10℃至15℃的温度，优选-5℃至10℃的温度。
用于单个方法步骤的上述反应条件同样适用于根据本发明优选的已经由微生物生产的非极性环孢菌素的加工，特别是应用于环孢菌素A的加工和分离。这也适用于应用的含醚提取剂，优选上述通式的醚。
因此，根据本发明优选的加工方法可得到易于过滤的几乎无色、白色环孢菌素-醚-溶剂化物结晶。
此外，这些结晶特别适于被分离为环孢菌素A-Z，通过已知方式的进一步结晶和/或使用已知柱材料组合已知合适洗脱剂的层析处理。
观察到在环孢菌素A-醚-溶剂化物结晶中显著排除了在其他方法中很难分离的异环孢菌素A。
因此，本发明的另一个主题涉及包含低于以重量计0.05％异环孢菌素A，优选包含以重量计0.04至0.05％异环孢菌素A的环孢菌素A。
根据本发明的加工方法可得到的环孢菌素A还具有相对低含量的环孢菌素H和环孢菌素T。
因此本发明的另一个主题为环孢菌素A，其中其环孢菌素H和环孢菌素T的总含量低于以重量计的0.5％，优选以重量计的0.1-0.4％。
同样的，本发明的另一个主题涉及包含以重量计0.04至0.005％异环孢菌素A的环孢菌素A，其中环孢菌素H和环孢菌素T的额外总含量为以重量计0.01至4％。
具有低含量副产物的环孢菌素A优选的可通过对根据本发明得到的环孢菌素A-甲基叔丁基醚-溶剂化物结晶的根据本发明的加工和进一步处理得到。
通过对非极性、微生物生产的环孢菌素的创造性、优选加工方法，因此有可能得到环孢菌素-醚-溶剂化物结晶，所述结晶不仅具有高于90％，优选≥95％的良好纯度和产量，还具有非常良好的结晶易处理性，因为至少90％的结晶具有＞10μm的结晶大小，粒度分布的中位数为约60μm。为了测量粒度分布，3x1g样品在60mL水中分散，使用Malvern公司的“Mastersizer 2000”测量仪器在加入分散单元Hydro 2000S后在2000rpm搅拌速度下测量。使用仪器制造商的“Fraunhofer”模式用于评估。上述值为3次所述测量的平均值。
因此本发明的另一个主题是结晶环孢菌素A-甲基叔丁基醚-溶剂化物，其至少90％的结晶具有＞10μm的结晶大小，其中优选的大小分布中位数在30μm至100μm之间，优选40μm至80μm之间。
如已经指出的，根据本发明的方法特别适用于加工微生物生产的结晶环孢菌素A-甲基叔丁基醚-溶剂化物形式的环孢菌素A。有可能通过X-光粉末衍射图明确分析所述结晶。
X-光粉末衍射图(XRPD)在AXS Bruker D-8 X-光粉末衍射仪上得到，使用环境条件下的以下记录参数：管阳极：铜；发电机电压：40kV；发电机电流：40mA，初始角度：2°2-θ；结束角度：40°2-θ；增量：0.01°2-θ；每次增量时间：2秒。2-θ值的一般精度为±0.1°2-θ的范围。因此，在大多数X-光衍射仪上在标准条件下发现的在5.0°2-θ的衍射峰(顶点)可能出现在4.9和5.1°2-θ之间。
因此本发明的另一个主题是结晶环孢菌素A-甲基叔丁基醚-溶剂化物，其具有包含7.0°+/-0.1°，8.2°+/-0.1°，11.0°+/-0.1°和20.5°+/-0.1°的2θ角顶点(峰)，特别另外包含7.3°+/-0.1°，11.8°+/-0.1°，13.3°+/-0.1°和16.5°+/-0.1°的2θ角顶点的X-光粉末衍射图。
本发明也涉及以下主题：
1.加工微生物生产的、非极性环状寡肽的方法，其包含以下步骤：
a)用在25℃不与水混合的液体含醚提取剂提取在微生物生产中积聚的全部发酵液，其中提取剂的量足够与全部发酵液形成两相系统。
2.根据主题1的方法，其中非极性、环状寡肽为非极性十一肽。
3.根据主题2的方法，其中非极性十一肽为环孢菌素，优选环孢菌素A。
4.根据主题1至3中任一项的方法，其中含醚提取剂基本上由一种或多种醚组成。
5.根据主题3或4的方法，其中其中含醚提取剂基本上由一种或多种醚组成，及所述方法包含另外的步骤：
b)将提取物中溶解的残留水含量降低至低于以重量计的1％，优选低于以重量计的0.3％。
6.根据主题5的方法，其中步骤b)通过共沸蒸馏进行。
7.根据主题5或6的方法，其中在进一步用步骤b)加工前用水溶液洗涤步骤a)中得到的提取物。
8.根据主题5至7中任一项的方法，其中将含环孢菌素的提取物浓缩至环孢菌素含量占总提取物质量的以重量计10％-以重量计35％。
9.根据主题1至8中任一项的方法，其中使用的醚为至少一种以下通式的醚
R1-O-R2
其中，R1和R2独立的代表线性或分支的具有C1至C5的烷基，且残基R1和R2中至少一个具有至少3个C原子，优选的至少4个C原子。
10.根据主题9的方法，其中使用的醚为至少一种选自二异丙醚、二正丙醚、二叔丁醚、二异丁醚、甲基叔丁基醚、乙基叔丁基醚、丙基叔丁基醚和正丁基叔丁基醚的醚。
11.根据主题5至10中任一项的方法，其中所述方法包含另外的步骤：
c)将非极性环状寡肽结晶为醚溶剂化物产物。
12.根据主题5至10中任一项的方法，其中所述方法包含另外的步骤：
c)将环孢菌素结晶为环孢菌素-醚-溶剂化物。
13.根据主题11或12的方法，其中将浓缩的提取物冷却至-10℃至15℃的温度以用于步骤c)。
14.根据主题12或13的方法，其中当环孢菌素-醚-溶剂化物结晶仅在其中缓慢溶解时，用该有机溶剂洗涤根据步骤c)得到的环孢菌素-醚-溶剂化物结晶。
15.根据主题1至14中任一项的方法，其中用含醚提取剂提取全部发酵液几次，优选2次。
16.根据主题1至15中任一项的方法，其中在提取时全部发酵液具有7至9，优选7.5至8.5的pH。
17.根据主题1至16中任一项的方法，其特征在于使用含醚提取剂在室温，优选在20至30℃进行提取。
18.根据主题12至17中任一项的方法，其特征在于通过重结晶和/或层析处理将环孢菌素-醚-溶剂化物分离为单独的环孢菌素A-Z。
19.结晶环孢菌素A-甲基叔丁基醚-溶剂化物，其具有包含7.0°+/-0.1°，8.2°+/-0.1°，11.0°+/-0.1°和20.5°+/-0.1°的2θ角顶点(峰)，特别另外包含7.3°+/-0.1°，11.8°+/-0.1°，13.3°+/-0.1°和16.5°+/-0.1°的2θ角顶点的X-光粉末衍射图。
20.结晶环孢菌素A-甲基叔丁基醚-溶剂化物，其中至少90％结晶具有大于10μm的结晶大小(通过激光衍射测量，Malvern Mastersizer 2000)。
21.环孢菌素A，其包含以重量计低于0.05％的异环孢菌素A，优选包含以重量计0.04-0.005％的异环孢菌素A。
22.环孢菌素A，其中其环孢菌素H和环孢菌素T的总含量低于以重量计的0.5％，优选以重量计的0.1-0.4％。
23.包含以重量计0.04-0.005％异环孢菌素A的环孢菌素A，其中环孢菌素H和环孢菌素T的额外总含量为以重量计的0.1-0.4％。
24.结晶环孢菌素-醚-溶剂化物在环孢菌素大规模生产中的用途。
25.根据主题24的用途，用于排除副产物，即异环孢菌素A，环孢菌素H和环孢菌素T。
26.在25℃不与水混合的液体含醚提取剂在从全部发酵液中提取微生物生产中积聚的非极性环状寡肽，优选环孢菌素，更优选环孢菌素A中的用途。
附图描述：
图1：结晶环孢菌素A-甲基叔丁基醚-溶剂化物的X-光粉末衍射图
图2：结晶环孢菌素A-甲基叔丁基醚-溶剂化物的红外光谱
实施例
以下实施例详细描述了本发明的特定实施方案；然而，它们无意限制本发明。
实施例1：从发酵液中提取环孢菌素A
如通过发酵例如膨大弯颈霉也可得到2000g含环孢菌素A的发酵液，使用2000ml甲基叔丁基醚(MTBE)在4000ppm Clariant MD07/049聚丙烯酸酯存在下分别提取2次。在分液漏斗中分离醚相并合并。在分液漏斗中用200ml具有pH约7的水洗涤含环孢菌素A的醚相一次，在过滤后通过共沸蒸馏在约53℃浓度浓缩醚相以得到150g/kg的环孢菌素浓度。之后将温度降低至恰好低于沸点的值，保持此温度2小时，通过更换新蒸馏头使MTBE选出。之后，在正常压力下在53℃浓缩溶液以得到300g/kg的环孢菌素浓度。在共沸蒸馏前为以重量计约1.4％的残留水含量此时低于以重量计的0.1％。在120分钟内小心的将溶液从53℃冷却至45℃，在另外60分钟内冷却至40℃，在另外60分钟内冷却至30℃，60分钟内冷却至0℃。得到理论总产量为约82％的白色结晶环孢菌素A-MTBE溶剂化物。图2显示了所得结晶的红外光谱，图1显示了所得结晶的粉末X-光衍射图(XRPD)。干涉显微镜分析显示了高度结晶物质，具有平均约65μm结晶粒度的大、双折射结晶。
实施例2：从发酵液中大规模提取环孢菌素A
510kg含环孢菌素A的发酵液使用510L甲基叔丁基醚(MTBE)分别提取2次，同时加入2.6kg Clariant MD07/049聚丙烯酸酯。醚相在300L分离器中贯穿进给(throughfeed)进行分离并合并。用700L具有pH约7的纯水洗涤含环孢菌素A的醚相一次，在分离器中再次分离一次相，在1000L薄层蒸发器中在约53℃通过共沸蒸馏浓缩醚相以得到100g/kg的环孢菌素浓度。之后将温度降低至恰好低于沸点的值，保持此温度2小时，通过更换新蒸馏头使MTBE选出。之后，在正常压力下在53℃浓缩溶液以得到300g/kg的环孢菌素浓度。在共沸蒸馏前为以重量计约1.4％的残留水含量此时低于以重量计的0.1％。在120分钟内小心的将溶液从53℃冷却至45℃，在另外60分钟内冷却至40℃，在另外60分钟内冷却至30℃，60分钟内冷却至0℃。得到理论总产量为约87％的8.55kg白色结晶环孢菌素A-MTBE溶剂化物。异环孢菌素A含量为以重量计的0.008％，环孢菌素H和环孢菌素T的总含量为以重量计的0.28％，与使用醋酸丁酯的提取方法相比，这些污染物的含量有非常显著的降低。

Claims (10)

1.加工微生物生产的、非极性环状寡肽的方法，其包含以下步骤：
a)用在25℃不与水混合的液体含醚提取剂提取在微生物生产中积聚的全部发酵液，其中提取剂的量足够与全部发酵液形成两相系统。
2.根据权利要求1的方法，其中非极性环状寡肽为环孢菌素A。
3.根据权利要求1或2的方法，其中含醚提取剂基本上由甲基叔丁基醚组成，及所述方法包含另外的步骤：
b)将提取物中溶解的残留水含量降低至低于以重量计的1％，优选低于以重量计的0.3％，更优选低于以重量计的0.15％。
4.根据权利要求3的方法，其中步骤b)通过共沸蒸馏进行。
5.根据权利要求3至4中任一项的方法，其中非极性环状寡肽为环孢菌素A，及所述方法包含另外的步骤：
c)将环孢菌素结晶为环孢菌素A-甲基叔丁基醚-溶剂化物。
6.结晶环孢菌素A-甲基叔丁基醚-溶剂化物，其具有包含7.0°+/-0.1°，8.2°+/-0.1°，11.0°+/-0.1°和20.5°+/-0.1°的2θ角顶点(峰)，特别另外包含7.3°+/-0.1°，11.8°+/-0.1°，13.3°+/-0.1°和16.5°+/-0.1°的2θ角顶点的X-光粉末衍射图。
7.结晶环孢菌素A-甲基叔丁基醚-溶剂化物，其中至少90％结晶具有大于10μm的晶粒大小。
8.包含以重量计0.04-0.005％异环孢菌素A的环孢菌素A，其中环孢菌素H和环孢菌素T的额外总含量为以重量计的0.1-0.4％。
9.结晶环孢菌素-醚-溶剂化物在环孢菌素大规模生产中的用途。
10.根据权利要求9的用途，用于排除副产物异环孢菌素A，环孢菌素H和环孢菌素T。
CN200980137840XA 2008-07-29 2009-07-29 加工微生物生产的环状寡肽的方法 Pending CN102164944A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP08161348A EP2151450A1 (de) 2008-07-29 2008-07-29 Verfahren zur Aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten zyklischen Oligopeptiden
EP08161348.1 2008-07-29
PCT/EP2009/059826 WO2010012786A1 (de) 2008-07-29 2009-07-29 Verfahren zur aufarbeitung von mikrobiologisch hergestellten zyklischen oligopeptiden

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN102164944A true CN102164944A (zh) 2011-08-24

Family

ID=39967244

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980137840XA Pending CN102164944A (zh) 2008-07-29 2009-07-29 加工微生物生产的环状寡肽的方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US8691770B2 (zh)
EP (2) EP2151450A1 (zh)
JP (1) JP2011529476A (zh)
CN (1) CN102164944A (zh)
WO (1) WO2010012786A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104877013A (zh) * 2015-06-03 2015-09-02 兰州大学 环孢菌素t及其制备方法和应用
CN108148118A (zh) * 2017-12-12 2018-06-12 陈秀明 一种环孢菌素h的分离纯化方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1030469A (en) * 1973-12-06 1978-05-02 Artur Ruegger Antibiotics s7481/f-1 and f-2 from cylindrocarpon or tolypocladium
WO2006063470A1 (en) * 2004-12-17 2006-06-22 Isotechnika Inc. Metabolites of cyclosporin analogs

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE298276C (zh)
US2503215A (en) * 1946-06-11 1950-04-04 Shell Dev Purification of penicillin
US4144138A (en) * 1978-01-18 1979-03-13 Texaco Inc. Recovery of ethers
DD298276A5 (de) 1988-10-11 1992-02-13 Institut Fuer Mikrobiologie Und Experimentelle Therapie,De Verfahren zur herstellung von cyclosporin a
HU201577B (en) 1988-12-20 1990-11-28 Gyogyszerkutato Intezet Process for producing cyclosporin antibiotics
ATE127528T1 (de) 1991-04-06 1995-09-15 Dresden Arzneimittel Verfahren zur fermentativen herstellung und isolierung von cyclosporin a sowie neue cyclosporin- bildende stämme.
FI92334C (fi) * 1992-12-30 1994-10-25 Leiras Oy Menetelmä syklosporiinien tuottamiseksi ja menetelmässä käytettävä uusi Tolypocladium-kanta
UA49803C2 (uk) * 1994-06-03 2002-10-15 Дж.Д. Сьорль Енд Ко Спосіб лікування ретровірусних інфекцій
EP0725076B1 (en) 1995-02-01 2001-06-06 National Research Development Corporation of India A process for the preparation of cyclosporin A from tolypocladium species
DE19611094C2 (de) 1996-03-21 1999-06-17 Dresden Arzneimittel Verfahren zur Reinigung von Cyclosporin A und/oder verwandten Cyclosporinen aus einem Cyclosporin-haltigen Rohextrakt unter Anwendung chromatographischer Verfahren mit Kieselgel als Adsorbens
US5747330A (en) 1996-06-05 1998-05-05 Poli Industria Chimica Antibiotic producing microbe
US6423233B1 (en) * 2000-08-15 2002-07-23 Biogal Gyogyszergyar Rt. Purification process
HU223054B1 (hu) * 1997-03-25 2004-03-01 BIOGAL Gyógyszergyár Rt. Tisztítási eljárás nagytisztaságú ciklosporin A előállítására
DK1714977T3 (da) * 2001-10-19 2009-07-06 Isotechnika Inc Syntese af cyclosporinanaloger
DE10153737A1 (de) * 2001-10-31 2003-05-28 Boehringer Ingelheim Pharma Kristallines Natriumsalz des Telmisartans, Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels
NZ576376A (en) * 2006-11-27 2011-02-25 Pfizer Prod Inc Pyrazole analogs

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1030469A (en) * 1973-12-06 1978-05-02 Artur Ruegger Antibiotics s7481/f-1 and f-2 from cylindrocarpon or tolypocladium
WO2006063470A1 (en) * 2004-12-17 2006-06-22 Isotechnika Inc. Metabolites of cyclosporin analogs

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JEGOROV A等: "Cyclosporins of symmetry P21- a series of clathrates", 《JOURNAL OF INCLUSION PHENOMENA AND MACROCYCLIC CHEMISTRY》 *
KUYUKINA 等: "Recovery of rhodococcus biosurfactants using methl tertiary-butyle ether extraction", 《JOURNAL OF MICROBIOLOGICAL METHODS》 *
吴晖: "环孢菌素A菌株选育及生产工艺研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士）工程科技I辑》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104877013A (zh) * 2015-06-03 2015-09-02 兰州大学 环孢菌素t及其制备方法和应用
CN104877013B (zh) * 2015-06-03 2018-04-20 兰州大学 环孢菌素t及其制备方法和应用
CN108148118A (zh) * 2017-12-12 2018-06-12 陈秀明 一种环孢菌素h的分离纯化方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010012786A1 (de) 2010-02-04
EP2151450A1 (de) 2010-02-10
EP2321335A1 (de) 2011-05-18
JP2011529476A (ja) 2011-12-08
US20110124575A1 (en) 2011-05-26
US8691770B2 (en) 2014-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2257271C (en) Method of isolating cyclosporins
JPS6253520B2 (zh)
Schwartz et al. Pneumocandins from Zalerion arboricola I. Discovery and isolation
KR20080091757A (ko) 에키노칸딘형 화합물의 정제 방법
EP2623511A1 (en) Process for purifying cyclic lipopeptide compounds or salts thereof
US9045515B2 (en) Procedure for the purification of tiacumicin B
US20130296529A1 (en) Process for purifying cyclolipopeptide compounds or the salts thereof
CN101622357B (zh) 微生物发酵产物的制造方法
EP0443719A1 (en) Novel R106 compounds
CN102164944A (zh) 加工微生物生产的环状寡肽的方法
WO1997046575A1 (en) Method of isolating cyclosporins
CN1082052C (zh) 制备环状缩肽化合物的方法和新的环状缩肽
CN115724816B (zh) 红树来源真菌中色原酮晶型及其制备与应用
CN107354182B (zh) 一种灰毛豆内生真菌发酵制备(r)-4-苄基-2-噁唑烷酮化合物的方法
CA2093429A1 (en) Process for biophosphorylating organic compounds
CN101031653A (zh) 大环内酯化合物的分离方法
JP5483127B2 (ja) 銀イオン溶液抽出を利用した不飽和アルキル基を有するラクトン化合物の精製方法
CN108148118B (zh) 一种环孢菌素h的分离纯化方法
CN114989190B (zh) 一类大环内酯类化合物kongjuemycins及其制备方法和应用
US5426038A (en) Process for production of an antibiotic compound with Zalerion arboricola
CZ293687B6 (cs) Purifikační postup pro přípravu vysoce čistého cyklosporinu A a vysoce čistý cyklosporin A takto připravený
US7176001B1 (en) Manufacture and purification of cyclosporin A
CN117925745A (zh) 一种制备Atpenin A5的方法
JPH05276962A (ja) 抗生物質ｒ１０６−ｉの製造法
GB2245271A (en) Process for production of an antibiotic polypeptide

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20110824