CN117925745A - 一种制备Atpenin A5的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种制备Atpenin A5的方法，包括以下步骤，步骤1：用青霉菌通过发酵获得发酵液；步骤2：将发酵液固液分离后，得到的菌渣，随后用溶剂浸提得到浸提液并浓缩至膏状；步骤3：将膏状物经过硅胶层析柱分离后得到包含Atpenin A5的溶液a；步骤4：使用溶液a结晶得到Atpenin A5成品。本方法尤其适用于青霉菌(Penicillium sp.)CGMCCNO.23056。本发明制备Atpenin A5的方法具有的有益效果为：工艺路径少，生产周期短，成本低；污染少；得到的Atpenin A5纯度、产率高。
Description
相关申请的交叉引用
本申请通过引用的方式将申请号为CN202210743649.7的申请文本全文并入本文。
技术领域
本发明涉及发酵液纯化技术领域，具体涉及一种制备Atpenin A5的方法。
背景技术
Atpenin A5是一种有效的复合物II(琥珀酸-泛醌氧化还原酶)抑制剂，复合物II是线粒体电子传递链上重要功能复合物，已经成为农用杀菌剂方面的关键靶标，该类杀菌剂在植物病原真菌保护中发挥着重要的作用。基于复合物II的呼吸系统抑制剂被广泛用于世界范围内的真菌病害，该类抑制剂通过与复合物II的泛醌还原位点结合而抑制真菌的呼吸，作用方式独特，与其他类别的杀菌剂如苯并咪唑类、strobilurins类、氨基吡啶类均无交互抗性，因此成为改善杀菌剂抗性和提高病害控制的优秀候选品种。
1988年，由日本Kitasato公司从土壤中分离得到的一株菌株Penicillium sp.FO-125的代谢产物中分离获得。Atpenin A5是一种胞内脂溶性抗真菌类抗生素，在筛选脂代谢微生物抑制剂的过程中，Hidetoshi Kumagai等发现了从青霉菌FO-125的培养液中分离到一系列抗真菌抗生素atpenins，包含三种有效组分，A4,A5和B，他们都具有抗真菌活性，尤其是对Trichophyton sp.真菌的抑制能力最强，其中又以Atpenin A5的抗真菌活性最强。
Masaki Ohtaw等在《Enantioselective total synthesis of atpenin A5》中报道了Atpenin A5具有比较出众的活性，对其进行了全合成研究，也完成了合成产物的结构确证。但化学合成存在反应步骤长，收率低，对安全性要求高，且成本方面也没有明显优势。Satoshi Omura等在《ATPENINS,NEW ANTIFUNGAL ANTIBIOTICS PRODUCED BY PENICILLIUMSP.》中报道Atpenin A5的产量为1-3mg/L。
结合现有技术的情况，目前缺少一种Atpenin A5产量高、工艺简单、产物纯度高的生产方法。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种制备Atpenin A5的方法，包括以下步骤，
步骤1：用青霉菌通过发酵获得发酵液；
步骤2：将发酵液固液分离后，得到的菌渣，随后用溶剂浸提得到浸提液并浓缩至膏状；
步骤3：将膏状物至少经过硅胶层析柱分离后得到包含Atpenin A5的溶液a；
步骤4：使用溶液a结晶得到Atpenin A5成品。
优选地，使用的青霉菌为：青霉菌(Penicillium sp.)HDCC00055，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.23056，保藏日期为2021年07月26日。
优选地，发酵液经过板框或陶瓷膜过滤后得到的菌渣。
优选地，发酵液经过板框过滤后得到的菌渣。
优选地，步骤2中，浸提菌渣的溶剂选自丙醇、异丙醇、正丁醇、四氢呋喃、氯仿、乙醇、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、乙腈、乙酸、正己烷中的一种或多种。
优选地，使用正己烷浸提菌渣。
优选地，浸提的溶剂的体积与菌渣的质量比为1～5：1。优选地，为2:1或3:1或4:1或5:1。更优选地为4:1。
优选地，硅胶层析中的硅胶为100-200目硅胶。品牌优选自青岛海洋，青岛邦凯，青岛硕远。
优选地，步骤3中，将膏状物经过硅胶层析柱分离后，再经过至少1次液相色谱分离得到包含Atpenin A5的溶液a。
优选地，步骤3中，将膏状物经过硅胶层析柱分离后得到溶液a1，溶液a1浓缩至干后配成上柱液，经过液相色谱分离得到溶液a2；溶液a2在经过浓缩后配成上柱液，经过第2次液相色谱分离得到包含Atpenin A5的溶液a；
优选地，步骤3的硅胶层析过程中，将正己烷与乙酸乙酯混合作为流动相a进行洗脱。优选地，正己烷与乙酸乙酯以10L：1L比例混合。
优选地，用流动相a以1BV/h流速洗脱硅胶柱。
优选地，在用流动相a洗脱硅胶柱前，先用正己烷平衡硅胶柱。优选地，用正己烷以1BV/h流速平衡硅胶柱2BV。
优选地，将硅胶层析中，Atpenin A5色谱纯度＞60％的组分合并得到溶液a1。
优选地，溶液a1浓缩至干后加入乙腈溶解配制成上柱液。优选地，配制成10g/L的上柱液。
优选地，将溶液a2浓缩至有固体析出后加入溶剂a萃取并分液，将溶剂a部分的萃取液浓缩至干后再加入乙腈配成上柱液。优选地，配制成10g/L的上柱液。
优选地，液相色谱分离中，用乙腈和水混合作为流动相b进行洗脱。优选地，乙腈和水以5L:5L混合作为流动相b。优选地，以50ml/min进行洗脱。优选地，用量为10BV。
优选地，使用乙腈与水的混合液平衡色谱柱。优选地，乙腈与水的体积比为5L:5L。优选地，以0.1BV/min的流速平衡柱子2BV。
优选地，使用DAC50制备柱。
优选地，使用华谱C18填料。
优选地，第1次色谱分离中，收集色谱纯度＞85％的组分，合并得到溶液a2；
优选地，第2次色谱分离中，收集色谱纯度＞95％的组分，合并得到溶液a。
优选地，溶液a浓缩至固体析出后加入溶剂a进行分液萃取，分离含有Atpenin A5萃取剂后浓缩至干得到固体，随后加入溶剂b结晶后得到Atpenin A5成品。
优选地，溶剂a选自四氢呋喃、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正己烷中的一种或多种。优选地，为正己烷。
优选地，溶剂b选自四氢呋喃、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正己烷中的一种或多种。优选地，为乙酸乙酯。
优选地，分离含有Atpenin A5萃取剂后浓缩至干得到的固体用溶剂a溶解后再加入溶剂b，随后结晶得到Atpenin A5成品。
优选地，固体溶于溶剂a后的浓度为100～300g/L，随后以体积比的方式，加入5倍于溶剂a的溶剂b，随后结晶得到Atpenin A5成品。
优选地，固体溶于溶剂a后的浓度为200g/L
优选地，结晶温度为0～10℃。优选地，结晶温度为5℃。
优选地，结晶时间不低于1h。优选地，结晶时间不低于3h。优选地，结晶时间不低于6h。优选地，结晶时间不低于9h。优选地，结晶时间不低于12h。
本发明还提供了一种将所述方法得到的Atpenin A5用于制备抗菌药物的用途。
有益效果；
1、本发明制备Atpenin A5的方法采用的青霉菌(Penicillium sp.)的发酵效价高；
2、本发明制备Atpenin A5的方法，工艺路径少，生产周期短，成本低；
3、本发明制备Atpenin A5的方法，污染少；
4、本发明制备得到的Atpenin A5纯度、产率高；
5、在相同发酵体积下，本发明提供的方法能够得到更多的Atpenin A5终产品。
附图说明
图1为发酵液经过提纯并结晶后，产物的HPLC谱图。
具体实施方式
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中采用的材料、试剂等如无特殊说明，皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
本发明中使用的菌种为青霉菌(Penicillium sp.)HDCC00055，具体的筛选、鉴定、培养等信息见本申请人之前的中国申请，申请号为：CN202210743649.7，以下仅示例性地描述。
HDCC00055菌种的原始菌种提取自我国安徽安庆菱湖景区的土壤样品，原始菌种经NTG诱变筛选后获得青霉菌(Penicillium sp.)HDCC00055，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.23056，保藏日期为2021年07月26日。
形态学检查
取HDCC00055菌种甘油管，稀释涂布于PDA平板，置于25℃培养3天，菌落正圆形，边缘整齐，中心孢子丰满，表面呈墨绿色，边缘为白色气生菌丝、微凸，反面浅黄色，无渗出液，无可溶性色素。显微镜下观察，该菌种菌丝粗、网状、顶端产生多细胞的分生孢子梗，分生孢子呈现扫帚状，染色较好。pH试验结果表明该菌种最适生长pH范围为4.0～6.0，温度试验结果表明最适生长温度范围为23～28℃。
菌种鉴定
HDCC00055菌种的18S rDNA序列分析参照《分子克隆实验指南》书中的有关内容进行实验。收集菌体，然后用真菌DNA提取试剂盒抽提总DNA。
利用通用引物进行PCR扩增(美国BioRad公司，PTC200扩增仪)，用0.9％的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，纯化回收采用AxyPrep凝胶回收试剂盒，纯化后的产物进行18SrDNA序列测定。
通用引物序列如下：
NS1 GTAGTCATATGCTTGTCTC
NS6 GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC
菌株HDCC00055所测得到的18S rDNA序列与GenBank数据库中相关种、属的序列进行同源序列BLAST比较，最终确定该菌株为青霉菌(Penicillium sp.)。
实施例1Atpenin A550L罐发酵制备
取HDCC00055菌株甘油管，划线法接种PDA斜面，置于25℃培养3-5天，获得斜面孢子，用接种铲刮取少量孢子，接种到液体种子培养基，置于27℃培养40h，获得一级摇瓶种子液。一级摇瓶种子液以0.05％的比例接种到装有10L液体培养基的种子罐中，设定温度27℃，罐压0.05Mpa，空气流量1vvm，初始搅拌100rpm，搅拌联动控制溶氧≥40％，培养周期30h，二级种子液pH达到2.5～4.0之间移种。二级种子液以10％的比例接种到装有30L液体发酵培养基的发酵罐中，设定温度26℃，罐压0.05Mpa，空气流量1vvm，初始搅拌100rpm，待溶氧下降到20％以下，开启搅拌联动，控制溶氧≥10％。发酵24h以后用碱水控制pH，使之维持在5.0～6.0之间。发酵24h后每天取样检测效价，具体方法为发酵液1ml，用无水乙醇浸泡，离心过滤后进行HPLC检测。最终，发酵液中Atpenin A5的效价达到418mg/L。
种子培养基组成为：葡萄糖4％，硫酸铵1.0％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.1％，pH6.0。
发酵培养基组成为：葡萄糖2％，山梨醇6％，玉米淀粉2％，酵母浸粉1％，蛋白胨2％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸镁0.2％，氯化钾0.15％，氯化钙0.15％，pH为6.0。
实施例2提取纯化Atpenin A5
板框过滤：接收发酵液，记录体积5L，效价415mg/L；将发酵液用物料泵，泵入板框内进行过滤；过滤结束后，用自来水顶洗板框滤饼；顶洗结束后，用空气将滤饼吹干至无液体流出；气吹结束后，拆卸板框，收集板框滤饼并称重750克。
有机溶剂浸提：滤饼用3L体积的正己烷浸泡、搅拌60min后过滤；过滤结束后，用150mL体积的正己烷顶洗滤饼，得滤液；在40℃±2℃下，减压真空浓缩至不再滴出液体，得到油状物。
正相硅胶：将硅胶与浓缩后油状物拌匀后装柱，挥发干后用正己烷以1BV/h流速平衡硅胶柱2BV，用流动相(正己烷10L：乙酸乙酯1L)以1BV/h流速洗脱至结束样单位低于10μg/mL，合并Atpenin A5色谱纯度＞60％的组分；再浓缩至干形成粗品。加入乙腈溶解配制成10g/L的上柱液，用于后续色谱分离。
一次高压制备：使用DAC50制备柱，填料使用华谱C18填料，装柱完成后，使用乙腈：水＝(5L:5L)平衡柱子2BV，流速为0.1BV/min；再按1g/L(1克粗品/1L填料)上柱，随后使用乙腈：水＝(5L:5L)以50ml/min进行洗脱，用量为10BV，根据液相结果合并色谱纯度＞85％的组分。
浓缩萃取：在40±2℃温度下，减压真空浓缩至白色固体析出；加入正己烷后搅拌0.5小时，静置分液；在40℃温度下，减压真空浓缩至干；加入乙腈溶解配制成10g/L的二次高压制备上柱液。
二次高压制备：使用DAC50制备柱，填料使用华谱C18填料，装柱完成后，使用乙腈：水＝(5L:5L)平衡柱子2BV，流速为0.1BV/min；再按1g/L上柱，随后使用乙腈：水＝(5L:5L)以50ml/min进行洗脱，用量为10BV，根据液相结果合并色谱纯度＞95％的组分。
浓缩结晶：在40±2℃温度下，减压真空浓缩至白色固体析出；加入650mL正己烷后搅拌0.5小时，静置分液；在40℃温度下，将分液得到的正己烷部分减压真空浓缩至干；加入5mL正己烷溶解配制成200g/L的结晶前液，再向溶液中滴加25mL体积的乙酸乙酯，放置于5℃条件下搅拌结晶6-12h，过滤，烘干得到成品。色谱纯度最高能达到97.3％，收率为46.2％。
实施例3提取纯化Atpenin A5
陶瓷膜过滤：接收发酵液，记录体积5L，效价413mg/L；将发酵液用物料泵，泵入陶瓷膜内进行过滤，加入25L体积的乙醇浸泡，循环透出，收集滤液25L；在40℃±2℃下，减压真空浓缩至不再滴出液体，得到油状物。再加入10L正己烷搅拌萃取，收集正己烷相，再在40℃±2℃下，减压真空浓缩至不再滴出液体，得到油状物。
正相硅胶：将青岛邦凯硅胶用正己烷匀浆后装于玻璃层析柱中进行湿法装柱；将硅胶与浓缩后油状物拌匀后，挥发干后用正己烷以1BV/h流速平衡硅胶柱2BV，用流动相(正己烷10L：乙酸乙酯1L)以1BV/h流速洗脱至结束样单位低于10μg/mL，合并Atpenin A5色谱纯度＞60％的组分,再浓缩至干。加入乙腈溶解配制成10g/L的上柱液，用于后续色谱分离。
一次高压制备：使用DAC50制备柱，填料使用华谱C18填料，装柱完成后，使用乙腈：水＝(5L:5L)平衡柱子2BV，流速为0.1BV/min；再按1g/L(1克Atpenin A5/1L填料)上柱，随后使用乙腈：水＝(5L:5L)以50ml/min进行洗脱，用量为10BV，根据液相结果合并色谱纯度＞85％的组分。
浓缩萃取：在40±2℃温度下，减压真空浓缩至白色固体析出；加入正己烷后搅拌0.5小时，静置分液；在40℃温度下，减压真空浓缩至干；加入乙腈溶解配制成10g/L的二次高压制备上柱液。
二次高压制备：使用DAC50制备柱，填料使用华谱C18填料，装柱完成后，使用乙腈：水＝(5L:5L)平衡柱子2BV，流速为0.1BV/min；再按1g/L(1克Atpenin A5/1L填料)上柱，随后使用乙腈：水＝(5L:5L)以50ml/min进行洗脱，用量为10BV，根据液相结果合并色谱纯度＞95％的组分。
浓缩结晶：在40±2℃温度下，减压真空浓缩至白色固体析出；加入650mL正己烷后搅拌0.5小时，静置分液；在40℃温度下，将分液得到的正己烷部分减压真空浓缩至干；加入5mL正己烷溶解配制成200g/L的结晶前液，再向溶液中滴加25mL体积的乙酸乙酯，放置于5℃条件下搅拌结晶6-12h，过滤，烘干得到成品。色谱纯度最高能达到97.2％，收率为46.1％。
Claims (10)
1.一种制备Atpenin A5的方法，其特征在于：
包括以下步骤，
步骤1：用青霉菌通过发酵获得发酵液；
步骤2：将发酵液固液分离后，得到的菌渣，随后用溶剂浸提得到浸提液并浓缩至膏状；
步骤3：将膏状物至少经过硅胶层析柱分离后得到包含Atpenin A5的溶液a；
步骤4：使用溶液a结晶得到Atpenin A5成品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
使用的青霉菌为：青霉菌(Penicillium sp.)HDCC00055，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.23056，保藏日期为2021年07月26日。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
步骤3中，将膏状物经过硅胶层析柱分离后，再经过至少1次液相色谱分离得到包含Atpenin A5的溶液a。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
步骤3中，将膏状物经过硅胶层析柱分离后得到溶液a1，溶液a1浓缩至干后配成上柱液，经过液相色谱分离得到溶液a2；溶液a2在经过浓缩后配成上柱液，经过第2次液相色谱分离得到包含Atpenin A5的溶液a。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
步骤3的硅胶层析过程中，将正己烷与乙酸乙酯混合作为流动相a进行洗脱。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
液相色谱分离中，用乙腈和水混合作为流动相b进行洗脱。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
将硅胶层析中，Atpenin A5色谱纯度＞60％的组分合并得到溶液a1；
第1次色谱分离中，收集色谱纯度＞85％的组分，合并得到溶液a2；
第2次色谱分离中，收集色谱纯度＞95％的组分，合并得到溶液a。
8.根据权利要求1～7任一所述的方法，其特征在于：
步骤2中，浸提菌渣的溶剂选自丙醇、异丙醇、正丁醇、四氢呋喃、氯仿、乙醇、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、乙腈、乙酸、正己烷中的一种或多种。
9.根据权利要求1～7任一所述的方法，其特征在于：
溶液a浓缩至固体析出后加入萃取剂进行分液萃取，分离含有Atpenin A5萃取剂后浓缩至干得到固体，随后加入溶剂结晶后得到Atpenin A5成品。
10.一种将权利要求1～9任一所述方法得到的Atpenin A5用于制备抗菌药物的用途。
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