CN117925745A - 一种制备Atpenin A5的方法 - Google Patents
一种制备Atpenin A5的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117925745A CN117925745A CN202211317031.0A CN202211317031A CN117925745A CN 117925745 A CN117925745 A CN 117925745A CN 202211317031 A CN202211317031 A CN 202211317031A CN 117925745 A CN117925745 A CN 117925745A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- atpenin
- solution
- liquid
- silica gel
- chromatographic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- OVULNOOPECCZRG-UHFFFAOYSA-N Atpenin A5 Natural products COC=1NC(O)=C(C(=O)C(C)CC(C)C(Cl)CCl)C(=O)C=1OC OVULNOOPECCZRG-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 7
- OVULNOOPECCZRG-CIUDSAMLSA-N atpenin-a5 Chemical compound COC=1NC(=O)C(C(=O)[C@@H](C)C[C@H](C)[C@@H](Cl)CCl)=C(O)C=1OC OVULNOOPECCZRG-CIUDSAMLSA-N 0.000 title description 7
- 229930186797 Atpenin Natural products 0.000 claims abstract description 43
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 32
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 26
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 26
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims abstract description 20
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims abstract description 20
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims abstract description 17
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 15
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims abstract description 12
- 238000002386 leaching Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims abstract description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 63
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 claims description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 claims description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims description 3
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 15
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 5
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000228168 Penicillium sp. Species 0.000 description 4
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 4
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 4
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 4
- 239000012065 filter cake Substances 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 4
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 3
- HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(4-chlorophenyl)-2-(4-methylphenyl)sulfonylbutane-1,4-dione Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)C(C(=O)C=1C=CC(Cl)=CC=1)CC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229940035936 ubiquinone Drugs 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ACTIUHUUMQJHFO-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q10 Natural products COC1=C(OC)C(=O)C(CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ACTIUHUUMQJHFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 240000006570 Euonymus japonicus Species 0.000 description 1
- 235000016796 Euonymus japonicus Nutrition 0.000 description 1
- 108020000949 Fungal DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 235000003283 Pachira macrocarpa Nutrition 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 244000202052 Poncirus trifoliata Species 0.000 description 1
- 235000000404 Poncirus trifoliata Nutrition 0.000 description 1
- 244000007853 Sarothamnus scoparius Species 0.000 description 1
- 229930182692 Strobilurin Natural products 0.000 description 1
- 240000001085 Trapa natans Species 0.000 description 1
- 235000014364 Trapa natans Nutrition 0.000 description 1
- 241000591119 Trichophyton sp. Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000003927 aminopyridines Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000001556 benzimidazoles Chemical class 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N coenzyme Q10 Chemical compound COC1=C(OC)C(=O)C(C\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N 0.000 description 1
- 235000017471 coenzyme Q10 Nutrition 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000011930 enantioselective total synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 244000000004 fungal plant pathogen Species 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011206 morphological examination Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- NPCOQXAVBJJZBQ-UHFFFAOYSA-N reduced coenzyme Q9 Natural products COC1=C(O)C(C)=C(CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)C(O)=C1OC NPCOQXAVBJJZBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 235000009165 saligot Nutrition 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
本发明提供了一种制备Atpenin A5的方法，包括以下步骤，步骤1：用青霉菌通过发酵获得发酵液；步骤2：将发酵液固液分离后，得到的菌渣，随后用溶剂浸提得到浸提液并浓缩至膏状；步骤3：将膏状物经过硅胶层析柱分离后得到包含Atpenin A5的溶液a；步骤4：使用溶液a结晶得到Atpenin A5成品。本方法尤其适用于青霉菌(Penicillium sp.)CGMCCNO.23056。本发明制备Atpenin A5的方法具有的有益效果为：工艺路径少，生产周期短，成本低；污染少；得到的Atpenin A5纯度、产率高。
Description
相关申请的交叉引用
本申请通过引用的方式将申请号为CN202210743649.7的申请文本全文并入本文。
技术领域
本发明涉及发酵液纯化技术领域，具体涉及一种制备Atpenin A5的方法。
背景技术
Atpenin A5是一种有效的复合物II(琥珀酸-泛醌氧化还原酶)抑制剂，复合物II是线粒体电子传递链上重要功能复合物，已经成为农用杀菌剂方面的关键靶标，该类杀菌剂在植物病原真菌保护中发挥着重要的作用。基于复合物II的呼吸系统抑制剂被广泛用于世界范围内的真菌病害，该类抑制剂通过与复合物II的泛醌还原位点结合而抑制真菌的呼吸，作用方式独特，与其他类别的杀菌剂如苯并咪唑类、strobilurins类、氨基吡啶类均无交互抗性，因此成为改善杀菌剂抗性和提高病害控制的优秀候选品种。
1988年，由日本Kitasato公司从土壤中分离得到的一株菌株Penicillium sp.FO-125的代谢产物中分离获得。Atpenin A5是一种胞内脂溶性抗真菌类抗生素，在筛选脂代谢微生物抑制剂的过程中，Hidetoshi Kumagai等发现了从青霉菌FO-125的培养液中分离到一系列抗真菌抗生素atpenins，包含三种有效组分，A4,A5和B，他们都具有抗真菌活性，尤其是对Trichophyton sp.真菌的抑制能力最强，其中又以Atpenin A5的抗真菌活性最强。
Masaki Ohtaw等在《Enantioselective total synthesis of atpenin A5》中报道了Atpenin A5具有比较出众的活性，对其进行了全合成研究，也完成了合成产物的结构确证。但化学合成存在反应步骤长，收率低，对安全性要求高，且成本方面也没有明显优势。Satoshi Omura等在《ATPENINS,NEW ANTIFUNGAL ANTIBIOTICS PRODUCED BY PENICILLIUMSP.》中报道Atpenin A5的产量为1-3mg/L。
结合现有技术的情况，目前缺少一种Atpenin A5产量高、工艺简单、产物纯度高的生产方法。
发明内容
为了克服上述问题，本发明提供了一种制备Atpenin A5的方法，包括以下步骤，
步骤1：用青霉菌通过发酵获得发酵液；
步骤2：将发酵液固液分离后，得到的菌渣，随后用溶剂浸提得到浸提液并浓缩至膏状；
步骤3：将膏状物至少经过硅胶层析柱分离后得到包含Atpenin A5的溶液a；
步骤4：使用溶液a结晶得到Atpenin A5成品。
优选地，使用的青霉菌为：青霉菌(Penicillium sp.)HDCC00055，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.23056，保藏日期为2021年07月26日。
优选地，发酵液经过板框或陶瓷膜过滤后得到的菌渣。
优选地，发酵液经过板框过滤后得到的菌渣。
优选地，步骤2中，浸提菌渣的溶剂选自丙醇、异丙醇、正丁醇、四氢呋喃、氯仿、乙醇、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、乙腈、乙酸、正己烷中的一种或多种。
优选地，使用正己烷浸提菌渣。
优选地，浸提的溶剂的体积与菌渣的质量比为1～5：1。优选地，为2:1或3:1或4:1或5:1。更优选地为4:1。
优选地，硅胶层析中的硅胶为100-200目硅胶。品牌优选自青岛海洋，青岛邦凯，青岛硕远。
优选地，步骤3中，将膏状物经过硅胶层析柱分离后，再经过至少1次液相色谱分离得到包含Atpenin A5的溶液a。
优选地，步骤3中，将膏状物经过硅胶层析柱分离后得到溶液a1，溶液a1浓缩至干后配成上柱液，经过液相色谱分离得到溶液a2；溶液a2在经过浓缩后配成上柱液，经过第2次液相色谱分离得到包含Atpenin A5的溶液a；
优选地，步骤3的硅胶层析过程中，将正己烷与乙酸乙酯混合作为流动相a进行洗脱。优选地，正己烷与乙酸乙酯以10L：1L比例混合。
优选地，用流动相a以1BV/h流速洗脱硅胶柱。
优选地，在用流动相a洗脱硅胶柱前，先用正己烷平衡硅胶柱。优选地，用正己烷以1BV/h流速平衡硅胶柱2BV。
优选地，将硅胶层析中，Atpenin A5色谱纯度＞60％的组分合并得到溶液a1。
优选地，溶液a1浓缩至干后加入乙腈溶解配制成上柱液。优选地，配制成10g/L的上柱液。
优选地，将溶液a2浓缩至有固体析出后加入溶剂a萃取并分液，将溶剂a部分的萃取液浓缩至干后再加入乙腈配成上柱液。优选地，配制成10g/L的上柱液。
优选地，液相色谱分离中，用乙腈和水混合作为流动相b进行洗脱。优选地，乙腈和水以5L:5L混合作为流动相b。优选地，以50ml/min进行洗脱。优选地，用量为10BV。
优选地，使用乙腈与水的混合液平衡色谱柱。优选地，乙腈与水的体积比为5L:5L。优选地，以0.1BV/min的流速平衡柱子2BV。
优选地，使用DAC50制备柱。
优选地，使用华谱C18填料。
优选地，第1次色谱分离中，收集色谱纯度＞85％的组分，合并得到溶液a2；
优选地，第2次色谱分离中，收集色谱纯度＞95％的组分，合并得到溶液a。
优选地，溶液a浓缩至固体析出后加入溶剂a进行分液萃取，分离含有Atpenin A5萃取剂后浓缩至干得到固体，随后加入溶剂b结晶后得到Atpenin A5成品。
优选地，溶剂a选自四氢呋喃、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正己烷中的一种或多种。优选地，为正己烷。
优选地，溶剂b选自四氢呋喃、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正己烷中的一种或多种。优选地，为乙酸乙酯。
优选地，分离含有Atpenin A5萃取剂后浓缩至干得到的固体用溶剂a溶解后再加入溶剂b，随后结晶得到Atpenin A5成品。
优选地，固体溶于溶剂a后的浓度为100～300g/L，随后以体积比的方式，加入5倍于溶剂a的溶剂b，随后结晶得到Atpenin A5成品。
优选地，固体溶于溶剂a后的浓度为200g/L
优选地，结晶温度为0～10℃。优选地，结晶温度为5℃。
优选地，结晶时间不低于1h。优选地，结晶时间不低于3h。优选地，结晶时间不低于6h。优选地，结晶时间不低于9h。优选地，结晶时间不低于12h。
本发明还提供了一种将所述方法得到的Atpenin A5用于制备抗菌药物的用途。
有益效果；
1、本发明制备Atpenin A5的方法采用的青霉菌(Penicillium sp.)的发酵效价高；
2、本发明制备Atpenin A5的方法，工艺路径少，生产周期短，成本低；
3、本发明制备Atpenin A5的方法，污染少；
4、本发明制备得到的Atpenin A5纯度、产率高；
5、在相同发酵体积下，本发明提供的方法能够得到更多的Atpenin A5终产品。
附图说明
图1为发酵液经过提纯并结晶后，产物的HPLC谱图。
具体实施方式
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中采用的材料、试剂等如无特殊说明，皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
本发明中使用的菌种为青霉菌(Penicillium sp.)HDCC00055，具体的筛选、鉴定、培养等信息见本申请人之前的中国申请，申请号为：CN202210743649.7，以下仅示例性地描述。
HDCC00055菌种的原始菌种提取自我国安徽安庆菱湖景区的土壤样品，原始菌种经NTG诱变筛选后获得青霉菌(Penicillium sp.)HDCC00055，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.23056，保藏日期为2021年07月26日。
形态学检查
取HDCC00055菌种甘油管，稀释涂布于PDA平板，置于25℃培养3天，菌落正圆形，边缘整齐，中心孢子丰满，表面呈墨绿色，边缘为白色气生菌丝、微凸，反面浅黄色，无渗出液，无可溶性色素。显微镜下观察，该菌种菌丝粗、网状、顶端产生多细胞的分生孢子梗，分生孢子呈现扫帚状，染色较好。pH试验结果表明该菌种最适生长pH范围为4.0～6.0，温度试验结果表明最适生长温度范围为23～28℃。
菌种鉴定
HDCC00055菌种的18S rDNA序列分析参照《分子克隆实验指南》书中的有关内容进行实验。收集菌体，然后用真菌DNA提取试剂盒抽提总DNA。
利用通用引物进行PCR扩增(美国BioRad公司，PTC200扩增仪)，用0.9％的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，纯化回收采用AxyPrep凝胶回收试剂盒，纯化后的产物进行18SrDNA序列测定。
通用引物序列如下：
NS1 GTAGTCATATGCTTGTCTC
NS6 GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC
菌株HDCC00055所测得到的18S rDNA序列与GenBank数据库中相关种、属的序列进行同源序列BLAST比较，最终确定该菌株为青霉菌(Penicillium sp.)。
实施例1Atpenin A550L罐发酵制备
取HDCC00055菌株甘油管，划线法接种PDA斜面，置于25℃培养3-5天，获得斜面孢子，用接种铲刮取少量孢子，接种到液体种子培养基，置于27℃培养40h，获得一级摇瓶种子液。一级摇瓶种子液以0.05％的比例接种到装有10L液体培养基的种子罐中，设定温度27℃，罐压0.05Mpa，空气流量1vvm，初始搅拌100rpm，搅拌联动控制溶氧≥40％，培养周期30h，二级种子液pH达到2.5～4.0之间移种。二级种子液以10％的比例接种到装有30L液体发酵培养基的发酵罐中，设定温度26℃，罐压0.05Mpa，空气流量1vvm，初始搅拌100rpm，待溶氧下降到20％以下，开启搅拌联动，控制溶氧≥10％。发酵24h以后用碱水控制pH，使之维持在5.0～6.0之间。发酵24h后每天取样检测效价，具体方法为发酵液1ml，用无水乙醇浸泡，离心过滤后进行HPLC检测。最终，发酵液中Atpenin A5的效价达到418mg/L。
种子培养基组成为：葡萄糖4％，硫酸铵1.0％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.1％，pH6.0。
发酵培养基组成为：葡萄糖2％，山梨醇6％，玉米淀粉2％，酵母浸粉1％，蛋白胨2％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸镁0.2％，氯化钾0.15％，氯化钙0.15％，pH为6.0。
实施例2提取纯化Atpenin A5
板框过滤：接收发酵液，记录体积5L，效价415mg/L；将发酵液用物料泵，泵入板框内进行过滤；过滤结束后，用自来水顶洗板框滤饼；顶洗结束后，用空气将滤饼吹干至无液体流出；气吹结束后，拆卸板框，收集板框滤饼并称重750克。
有机溶剂浸提：滤饼用3L体积的正己烷浸泡、搅拌60min后过滤；过滤结束后，用150mL体积的正己烷顶洗滤饼，得滤液；在40℃±2℃下，减压真空浓缩至不再滴出液体，得到油状物。
正相硅胶：将硅胶与浓缩后油状物拌匀后装柱，挥发干后用正己烷以1BV/h流速平衡硅胶柱2BV，用流动相(正己烷10L：乙酸乙酯1L)以1BV/h流速洗脱至结束样单位低于10μg/mL，合并Atpenin A5色谱纯度＞60％的组分；再浓缩至干形成粗品。加入乙腈溶解配制成10g/L的上柱液，用于后续色谱分离。
一次高压制备：使用DAC50制备柱，填料使用华谱C18填料，装柱完成后，使用乙腈：水＝(5L:5L)平衡柱子2BV，流速为0.1BV/min；再按1g/L(1克粗品/1L填料)上柱，随后使用乙腈：水＝(5L:5L)以50ml/min进行洗脱，用量为10BV，根据液相结果合并色谱纯度＞85％的组分。
浓缩萃取：在40±2℃温度下，减压真空浓缩至白色固体析出；加入正己烷后搅拌0.5小时，静置分液；在40℃温度下，减压真空浓缩至干；加入乙腈溶解配制成10g/L的二次高压制备上柱液。
二次高压制备：使用DAC50制备柱，填料使用华谱C18填料，装柱完成后，使用乙腈：水＝(5L:5L)平衡柱子2BV，流速为0.1BV/min；再按1g/L上柱，随后使用乙腈：水＝(5L:5L)以50ml/min进行洗脱，用量为10BV，根据液相结果合并色谱纯度＞95％的组分。
浓缩结晶：在40±2℃温度下，减压真空浓缩至白色固体析出；加入650mL正己烷后搅拌0.5小时，静置分液；在40℃温度下，将分液得到的正己烷部分减压真空浓缩至干；加入5mL正己烷溶解配制成200g/L的结晶前液，再向溶液中滴加25mL体积的乙酸乙酯，放置于5℃条件下搅拌结晶6-12h，过滤，烘干得到成品。色谱纯度最高能达到97.3％，收率为46.2％。
实施例3提取纯化Atpenin A5
陶瓷膜过滤：接收发酵液，记录体积5L，效价413mg/L；将发酵液用物料泵，泵入陶瓷膜内进行过滤，加入25L体积的乙醇浸泡，循环透出，收集滤液25L；在40℃±2℃下，减压真空浓缩至不再滴出液体，得到油状物。再加入10L正己烷搅拌萃取，收集正己烷相，再在40℃±2℃下，减压真空浓缩至不再滴出液体，得到油状物。
正相硅胶：将青岛邦凯硅胶用正己烷匀浆后装于玻璃层析柱中进行湿法装柱；将硅胶与浓缩后油状物拌匀后，挥发干后用正己烷以1BV/h流速平衡硅胶柱2BV，用流动相(正己烷10L：乙酸乙酯1L)以1BV/h流速洗脱至结束样单位低于10μg/mL，合并Atpenin A5色谱纯度＞60％的组分,再浓缩至干。加入乙腈溶解配制成10g/L的上柱液，用于后续色谱分离。
一次高压制备：使用DAC50制备柱，填料使用华谱C18填料，装柱完成后，使用乙腈：水＝(5L:5L)平衡柱子2BV，流速为0.1BV/min；再按1g/L(1克Atpenin A5/1L填料)上柱，随后使用乙腈：水＝(5L:5L)以50ml/min进行洗脱，用量为10BV，根据液相结果合并色谱纯度＞85％的组分。
浓缩萃取：在40±2℃温度下，减压真空浓缩至白色固体析出；加入正己烷后搅拌0.5小时，静置分液；在40℃温度下，减压真空浓缩至干；加入乙腈溶解配制成10g/L的二次高压制备上柱液。
二次高压制备：使用DAC50制备柱，填料使用华谱C18填料，装柱完成后，使用乙腈：水＝(5L:5L)平衡柱子2BV，流速为0.1BV/min；再按1g/L(1克Atpenin A5/1L填料)上柱，随后使用乙腈：水＝(5L:5L)以50ml/min进行洗脱，用量为10BV，根据液相结果合并色谱纯度＞95％的组分。
浓缩结晶：在40±2℃温度下，减压真空浓缩至白色固体析出；加入650mL正己烷后搅拌0.5小时，静置分液；在40℃温度下，将分液得到的正己烷部分减压真空浓缩至干；加入5mL正己烷溶解配制成200g/L的结晶前液，再向溶液中滴加25mL体积的乙酸乙酯，放置于5℃条件下搅拌结晶6-12h，过滤，烘干得到成品。色谱纯度最高能达到97.2％，收率为46.1％。
Claims (10)
1.一种制备Atpenin A5的方法，其特征在于：
包括以下步骤，
步骤1：用青霉菌通过发酵获得发酵液；
步骤2：将发酵液固液分离后，得到的菌渣，随后用溶剂浸提得到浸提液并浓缩至膏状；
步骤3：将膏状物至少经过硅胶层析柱分离后得到包含Atpenin A5的溶液a；
步骤4：使用溶液a结晶得到Atpenin A5成品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
使用的青霉菌为：青霉菌(Penicillium sp.)HDCC00055，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.23056，保藏日期为2021年07月26日。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
步骤3中，将膏状物经过硅胶层析柱分离后，再经过至少1次液相色谱分离得到包含Atpenin A5的溶液a。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
步骤3中，将膏状物经过硅胶层析柱分离后得到溶液a1，溶液a1浓缩至干后配成上柱液，经过液相色谱分离得到溶液a2；溶液a2在经过浓缩后配成上柱液，经过第2次液相色谱分离得到包含Atpenin A5的溶液a。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
步骤3的硅胶层析过程中，将正己烷与乙酸乙酯混合作为流动相a进行洗脱。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
液相色谱分离中，用乙腈和水混合作为流动相b进行洗脱。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
将硅胶层析中，Atpenin A5色谱纯度＞60％的组分合并得到溶液a1；
第1次色谱分离中，收集色谱纯度＞85％的组分，合并得到溶液a2；
第2次色谱分离中，收集色谱纯度＞95％的组分，合并得到溶液a。
8.根据权利要求1～7任一所述的方法，其特征在于：
步骤2中，浸提菌渣的溶剂选自丙醇、异丙醇、正丁醇、四氢呋喃、氯仿、乙醇、乙酸乙酯、甲醇、丙酮、乙腈、乙酸、正己烷中的一种或多种。
9.根据权利要求1～7任一所述的方法，其特征在于：
溶液a浓缩至固体析出后加入萃取剂进行分液萃取，分离含有Atpenin A5萃取剂后浓缩至干得到固体，随后加入溶剂结晶后得到Atpenin A5成品。
10.一种将权利要求1～9任一所述方法得到的Atpenin A5用于制备抗菌药物的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211317031.0A CN117925745A (zh) | 2022-10-26 | 2022-10-26 | 一种制备Atpenin A5的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211317031.0A CN117925745A (zh) | 2022-10-26 | 2022-10-26 | 一种制备Atpenin A5的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117925745A true CN117925745A (zh) | 2024-04-26 |
Family
ID=90761539
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211317031.0A Pending CN117925745A (zh) | 2022-10-26 | 2022-10-26 | 一种制备Atpenin A5的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117925745A (zh) |
-
2022
- 2022-10-26 CN CN202211317031.0A patent/CN117925745A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106978350B (zh) | 一株黑曲霉及其在普洱茶素类化合物的制备中的应用 | |
| Kumar et al. | Cultural, morphological and molecular characterization of vinca alkaloids producing endophytic fungus Fusarium solani isolated from Catharanthus roseus | |
| WO2016179735A1 (en) | A method of semi-solid state fermentation for producing surfactin from a mutant strain of bacillus subtilis subsp | |
| CN103911293B (zh) | 一株高产紫杉醇的内生真菌及应用该菌株生产紫杉醇的方法 | |
| CN103805648A (zh) | 高产安丝菌素发酵工艺 | |
| EP3029147A1 (en) | A method of semi-solid state fermentation for producing surfactin from a mutant strain of bacillus subtilis subsp | |
| JP6181972B2 (ja) | 芳香族化合物の製造方法 | |
| CN117925745A (zh) | 一种制备Atpenin A5的方法 | |
| CN113956990B (zh) | 产二氢尼洛替星的重组酿酒酵母及其制备方法和应用 | |
| CN112626132B (zh) | 西柏烷二萜的微生物生产方法 | |
| CN113481106B (zh) | 一种深海来源蕈青霉及获得化合物 | |
| CN110527632B (zh) | 一株高效生物转化白桦脂酸的内生真菌菌株及其应用 | |
| CN109370919B (zh) | 一株生产青霉酸的菌株及其应用 | |
| CN115044483B (zh) | 青霉菌w21c371及其在制备弯孢霉菌素中的应用 | |
| US7846699B2 (en) | Process for gibberellic acid production with “Fusarium moniliforme” strains | |
| CN113151013B (zh) | 一种高产环孢菌素的植物内生镰刀菌及其应用 | |
| CN117343844A (zh) | 一种青霉菌及其发酵产Atpenin A5的方法 | |
| CN115521877B (zh) | 青霉菌株及其在制备布雷菲德菌素a中的应用 | |
| CN111808115B (zh) | 马铃薯内生菌的具有抗病原活性的发酵有机物、其制备工艺、应用以及发酵产物 | |
| CN109055233B (zh) | 一株产二甲氧基异苯并呋喃-1-酮的真菌及其制备二甲氧基异苯并呋喃-1-酮的方法 | |
| CN112481326B (zh) | 利用丟糟发酵生产6-戊基-2h-吡喃-2-酮的方法 | |
| CN114933976B (zh) | 一株山地蒙氏团菌及其应用 | |
| CN114561405B (zh) | 木霉菌Harzianolide的合成基因簇在制备提高植物灰霉病抗性制剂中的应用 | |
| JP6181971B2 (ja) | 芳香族化合物の製造方法 | |
| CN114806888B (zh) | 花斑曲霉zjute2及其在制备杂色曲霉毒素中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication |