CN110527632B - 一株高效生物转化白桦脂酸的内生真菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株高效生物转化白桦脂酸的内生真菌菌株及其应用。本发明首先提供了一株拟茎点霉，所述拟茎点霉为拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2019394。本发明进一步提供了包含上述拟茎点霉的菌剂及其应用。本发明拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2具有高效生物转化白桦脂醇为白桦脂酸的能力，其白桦脂酸转化量达到了23.5mg/L，因此，拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2为未来抗癌和抗病毒产品的开发提供了优良的菌株材料，具有重要价值。

Description

一株高效生物转化白桦脂酸的内生真菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株高效生物转化白桦脂酸的内生真菌菌株及其应用。
背景技术
植物三萜类化合物的主要来源是从植物中提取，大量酸碱和有机溶剂的使用带来严重的环境问题，而且植物的栽培需要较长时间，加之植物中三萜类化合物的含量低，且有较多的结构类似物，导致提取成本高。白桦酯醇(Betulin)和白桦酯酸(Betulinic acid，BA)是重要的抗癌以及抗病毒五环三萜类天然化合物，在人类疾病治疗中具有重要的价值与意义，且白桦酯醇和白桦脂酸的药物作用异于其他抗肿瘤药物，靶向性强以及对正常细胞的无毒性使其更受青睐，作为最有潜力的新型药物制剂，具有广阔的应用前景。
随着合成生物学的发展，微生物转化，即通过微生物整体细胞或酶将复杂的底物进行结构修饰，为植物三萜类化合物提供了合成途径。近年来，部分三萜类化合物已经在微生物细胞中被成功合成，例如在酿酒酵母中合成人参皂苷(Rasool A，Zhang G，LIZ，etal.Engineering of the terpenoid pathway in Saccharomyces cerevisiaeco-overproduces squalene and the non-terpenoid compound oleic acid[J].ChemicalEngineering Science，2016，152：457-467.)、齐墩果酸(Khan N E，Nybo SE，Chappell J，et a1.Triterpene hydrocarbon production engineered into ametabolicallyversatile host-Rhodobacter capsulatus[J].BiotechnolBioeng，2015，112(8)：1523-1532)、桦木酸和甘草次酸(Zhuang Y，Yang G Y，Chen X，et al.Biosynthesis of plantderived ginsenoside Rh2 in yeast via repurposing akey promiscuous microbialenzyme[J].Metab Eng，2017，42：25-32.)等。然而由于三萜合成途径的复杂和植物来源的酶在微生物中表现出低活性等缺点，使得植物三萜类化合物的微生物合成仍然存在许多挑战。
现阶段，白桦脂酸的合成全部依靠于由白桦酯醇的氧化还原制备，这种方法价格昂贵而且白桦脂酸的得率以及纯度都较低，从而导致市场上的白桦脂酸价格的高昂。因此，挖掘出具有白桦脂酸的生物转化的菌株具有重要的价值与意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为提供如何高效生物转化白桦酯醇为白桦脂酸。
为解决上述问题，本发明提供了一株拟茎点霉，所述拟茎点霉为拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2019394。
上述拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2的ITS序列如序列表中序列1所示。
上述拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2的培养物也在本发明的保护范围之内。
所述拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2的培养物是将拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2在微生物培养基中培养得到的培养容器内的物质，如发酵液；
其中，所述培养物包括拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2的代谢物和拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2的菌丝(即所述菌丝为将上述拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2培养得到的物质之一)。
含上述拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2的菌剂也在本发明的保护范围之内。
上述菌剂中，所述菌剂可为生产三萜类化合物的菌剂。
上述菌剂中，所述菌剂的活性成分可为上述拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2、上述拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2的代谢物、上述拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2的培养物和/或上述拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2的菌丝。所述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，所述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据本发明实际需要进行确定。
上述菌剂中，所述拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2可以以孢子、菌丝或含有孢子和/或菌丝的培养物的形式存在。
上述菌剂中，所述菌剂除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为三萜类化合物生产领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。
上述菌剂中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
本发明还提供了上述拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2、上述拟茎点霉(Phomopsissp.)WDS2的代谢物、上述拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2的培养物、上述拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2的菌丝和/或上述菌剂在如下1)-4)任一中的应用：
1)在生产三萜类化合物中的应用；
2)在白桦酯醇生物转化为白桦脂酸中的应用；
3)在制备抗癌产品中的应用；
4)在制备抗病毒产品中的应用。
本发明还提供了一种生产三萜类化合物的方法。
一种生产三萜类化合物的方法包括：用微生物培养基培养上述拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2，收集培养物，从所述培养物中得到三萜类化合物。
上述方法中，所述培养物是将拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2在微生物培养基中培养得到的培养容器内的物质；如发酵液。
上述方法中，所述微生物培养基为PDB培养基。
本发明进一步提供了一种将白桦酯醇生物转化为白桦脂酸的方法。
一种将白桦酯醇生物转化为白桦脂酸的方法，包括以下步骤：用含有白桦酯醇的微生物培养基培养上述拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2，完成白桦酯醇向白桦脂酸的生物转化。
上述方法中，所述培养的时间为8-12天；具体为10天。
上述方法中，所述微生物培养基为PDB培养基。
本发明从112株内生真菌中筛选得到了33株具有三萜类化合物代谢功能的内生真菌，又从33株具有三萜类化合物代谢通路的内生真菌中筛选得到了4株具有将白桦酯醇生物转化为白桦脂酸功能的内生真菌，寻找到了生物转化合成途径的新资源，为后续三萜物质的微生物合成利用奠定坚实基础。比较4株具有将白桦酯醇生物转化为白桦脂酸功能的内生真菌，得到具有高效生物转化能力的拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2，其白桦脂酸转化量达到了23.5mg/L，因此，拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2为未来抗癌和抗病毒产品的开发提供了优良的菌株材料，具有重要价值。
生物材料信息
菌种名称：拟茎点霉WDS2
拉丁文名：Phomopsis sp.WDS2
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏机构简称：CCTCC
保藏编号：CCTCC NO：M 2019394
地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏中心
附图说明
图1为白桦脂酸齐墩果酸及白桦酯醇标准品色谱图
图2为内生真菌WDS2生物转化前后液相色谱图对比；其中，A为生物转化前液相色谱图，B为生物转化后液相色谱图。
图3为内生真菌WDS2的菌落形态特征。
图4为内生真菌WDS2的显微结构形态特征。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中用到的培养基和溶液如下：
PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，即Potato Dextrose Agar)培养基：
1000ml的培养基中包含马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，其余为水。
制备方法为：马铃薯洗净去皮，称取200g切成小块，加水煮烂(煮沸20-30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，再据实际实验需要加15-20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖20g，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，115℃灭菌20分钟，冷却后贮存备用。
PDB培养基：PDA培养基去掉琼脂的液体培养基。
白桦酯醇溶液：称取白桦酯醇2mg溶解于1ml甲醇溶液中。
白桦脂酸溶液：称取白桦脂酸2mg溶解于1ml甲醇溶液中。
实施例1、拟茎点霉WDS2的分离筛选和鉴定
一、内生真菌的分离筛选
采集黑龙江省阿城区豌豆植株，用自来水连续冲洗采集材料，进行外植体消毒及内生真菌分离培养，具体方法参考高剑(高剑.红树林内生真菌多样性及其生态分布[D].广东海洋大学，2013.)。利用浙大袁志林(袁志林.疣粒野生稻内生真菌资源挖掘、系统发育分析和功能初探[D].浙江大学，2010.)的方法进行内生真菌的分离和培养，获得内生真菌WDS2。本发明的发明人还从大豆、柽柳枝条、树皮与白桦的枝条、叶片、树皮分离了其它111株内生真菌。对这112株内生真菌进行如下白桦酯醇生物转化内生真菌的筛选：
1、三萜化合物合成能力的内生真菌筛选
将121株内生真菌于PDB培养基以转速120r/min在25℃条件下发酵暗培养10d，过滤获得菌丝，滤液回收后进行旋转蒸发仪浓缩20倍，得到菌液。采用冰醋酸-香草醛-高氯酸分光光度法分别检测了菌丝和菌液中的三萜化合物含量，三萜化合物在551nm处具有吸光度。
其中，所述冰醋酸-香草醛-高氯酸分光光度法检测的具体步骤为：
菌丝中总三萜含量测定：精确称取干燥菌丝粉末样品0.050g，加入2ml 95％的乙醇70℃恒温水浴1h，超声40min后取出100ul，放入10ml的离心管中，70℃水浴蒸干，加入200ul的5％香草醛-冰乙酸和800ul高氯酸，70℃水浴15min，取出迅速放入冰中冷却，用乙酸乙酯定容到5ml，即可在分光光度计检测其551nm下的OD值，并根据回归方程计算总三萜含量。
菌液中总三萜含量测定：从浓缩后的发酵液中取1ml放入10ml的离心管中，70℃水浴蒸干，加入200ul的5％香草醛-冰乙酸和800ul高氯酸，70℃水浴15min，取出迅速放入冰中冷却，用乙酸乙酯定容到5ml，即可在分光光度计检测其551nm下的OD值，并根据回归方程计算总三萜含量。
121株内生真菌中有33株内生真菌在菌丝和菌液中均检测到了三萜类化合物，因此，在从121株内生真菌中确定了33株内生真菌具有三萜类化合物合成能力，占据总数的29.46％。将以上33株内生真菌选做生物转化(白桦脂醇转化为白桦脂酸)的内生真菌菌株。
2、白桦酯醇生物转化白桦脂酸的内生真菌的筛选
配制以白桦脂醇为底物的底物培养基：112.5mg 90％白桦脂醇溶于30ml 95％无水乙醇中，浓度为3.25mg/ml，0.45μm滤膜过滤，得到白桦脂醇溶液；超净工作台中吸取1ml白桦脂醇溶液至PDB培养基中，得到白桦脂醇的终浓度为0.036mg/ml的底物培养基。将90ml底物培养基分装于250ml三角瓶中，115℃，20min灭菌。每个三角瓶中加大小均匀3个菌饼，置于摇床上以转速120r/min在25℃条件下发酵暗培养10d，得到发酵液。取200ml发酵液旋转蒸发浓缩20倍至10ml，冷冻抽干后乙醇超声萃取6h，离心取上清后，40℃水浴蒸干，2ml甲醇复溶后得到样品液。每个样品进行3次重复。利用高效液相色谱(HPLC)检测样品液中白桦脂酸和白桦酯醇的含量。
其中，所述高效液相色谱(HPLC)检测条件：用Waters公司1525-2707-2489色谱系统，色谱柱HiQ sil C18V 4.6mm×250mm；流动相为乙腈：水＝9∶1(V：V)；柱温25℃；灵敏度16AUFS；进样量20μl，流速1.0mL/min；检测波长210nm。
利用HPLC检测白桦脂酸和白桦酯醇的标准液，结果如图1所示，白桦酯醇的出峰时间在9.2min，白桦脂酸的出峰时间在7.3min，测得白桦脂酸回归方程为：y＝(X-63763)*10^-7，R2＝0.9996。白桦脂酸在0.2-5.0ug范围内具有良好的线性关系。白桦脂醇回归方程为：y＝(x-68020)*10^-6/9，R2＝0.9994。白桦脂醇在0.2-5.0ug范围内具有良好的线性关系，作为样品液的同步定量分析的参考标准，通过对33株内生真菌的样品液进行HPLC同步检测，筛选得到了4株可生物转化白桦酯醇为白桦脂酸的内生真菌，如图2所示，内生真菌WDS2的样品液中白桦脂酸有积累，说明内生真菌WDS2成功催化白桦酯醇转化为白桦脂酸，且4株内生真菌中内生真菌WDS2转化量较高，可达23.5mg/L。因此，将筛选得到高效转化白桦脂酸的内生真菌WDS2进行鉴定和保藏。
二、内生真菌WDS2的形态学鉴定
培养内生真菌WDS2单菌落5-15天，观察内生真菌WDS2的菌落形态特征，结果如图3所示：菌丝少，菌落扁平，表面较光滑，有无色(淡黄色)液体分泌物。菌落正面为灰黑色，背面为黑色。
采用光学显微镜观察菌丝显微形态特征，结果如图4所示：菌丝分支且有隔，未发现有孢子。
三、内生真菌WDS2的分子鉴定
CTAB法提取内生真菌WDS2的基因组DNA，以通用引物ITS1(5｀-CTTGGTCATTTAGACGAAGTAA-3`)和ITS4(5`-GCATATCAATAAGCGGAGGA-3`)PCR扩增ITS序列，反应程序为：94℃变性40s、55℃退火50s、72℃延伸1min，共35个循环。PCR产物电泳检测，测序得到内生真菌WDS2扩增得到的ITS序列如序列表中序列1所示。登陆NCBI(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)将该序列进行序列比(Blast)表明：内生真菌WDS2匹配度较高序列的Gene BankNumber为AB107890.1。
综上，通过形态学鉴定和分子鉴定确定内生真菌WDS2为拟茎点霉属(phomopsissp.)。将内生真菌WDS2命名为拟茎点霉(phomopsis sp.)WDS2，以下简称拟茎点霉WDS2。拟茎点霉WDS2已于2019年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019394。
实施例2高效转化白桦脂酸内生真菌培养时间优化
以拟茎点霉WDS2为材料，挑取菌丝于500ml PDB培养基中培养2d制备成一级种子液。向98ml PDB培养基中加入2ml的5mg/ml的白桦脂醇，得到白桦脂醇的终浓度为0.1mg/ml的底物培养基。吸取10ml种子液于底物培养基中，置于摇床上以转速120r/min在25℃条件下发酵暗培养发酵暗培养(锡箔纸包裹)，并于48h、96h、144h、192h、240h、284h时取10ml发酵液至于冷冻干燥机中冻干，加入5ml无水乙醇超声萃取6h，重复两次后合并有机相，40℃水浴蒸干，2ml甲醇复溶后得到样品液，利用实施例1中所述HPLC方法检测样品液白桦脂酸的含量。每组重复3次。
结果显示：拟茎点霉WDS2在4d前并未有生物转化现象出现，第6d检测到积累并产生白桦脂酸，10d时达到最大值19.2mg/L，12d时有所减少，此时对数生长期结束，细胞或产物开始降解或转化为其他化合物，因此，确定了拟茎点霉WDS2高效转化白桦脂酸的时间为第10d。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 东北林业大学
<120> 一株高效生物转化白桦脂酸的内生真菌菌株及其应用
<130> GNCFY191604
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 560
<212> DNA
<213> 拟茎点霉（Aspergillus sp.）
<400> 1
gtgaaccagc ggagggatca ttgctggaac gcgccccagg cgcacccaga aaccctttgt 60
gaacttatac cttactgttg cctcggcgct agctggtcct tcggggcccc tcaccctcgg 120
gtgttgagac agcccgccgg cggccaacct aactcttgtt tttacactga aactctgaga 180
ataaaacata aatgaatcaa aactttcaac aacggatctc ttggttctgg catcgatgaa 240
gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt 300
tgaacgcaca ttgcgccctc tggtattccg gagggcatgc ctgttcgagc gtcatttcaa 360
ccctcaagcc tggcttggtg atggggcact gcttttaccc aaaagcaggc cctgaaattc 420
agtggcgagc tcgccaggac cccgagcgca gtagttaaac cctcgctctg gaaggccctg 480
gcggtgccct gccgttaaac ccccaacttc tgaaaatttg acctcggatc aggtaggaat 540
acccgctgaa cttaagcata 560

Claims (10)

1.一株拟茎点霉，其特征在于：所述拟茎点霉为拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2019394。
2.权利要求1所述的拟茎点霉的培养物，其特征在于：所述培养物是将权利要求1所述的拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2在微生物培养基中培养得到的物质。
3.权利要求1所述的拟茎点霉的菌丝，其特征在于：所述菌丝是将权利要求1所述的拟茎点霉(Phomopsis sp.)WDS2培养得到的物质。
4.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂含权利要求1所述的拟茎点霉、权利要求1所述的拟茎点霉的代谢物、权利要求2所述的培养物和/或权利要求3所述的菌丝。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为产生三萜类化合物的菌剂。
6.权利要求1所述的拟茎点霉，或，权利要求2所述的培养物，或，权利要求3所述的菌丝，或，权利要求4所述的菌剂在如下1)-4)任一中的应用：
1)在生产三萜类化合物中的应用；
2)在白桦酯醇生物转化为白桦脂酸中的应用；
3)在制备抗癌产品中的应用；
4)在制备抗病毒产品中的应用。
7.一种生产三萜类化合物的方法，其特征在于：所述方法包括用微生物培养基培养权利要求1所述的拟茎点霉，收集培养物，从所述培养物中得到三萜类化合物。
8.一种白桦酯醇生物转化为白桦脂酸的方法，其特征在于：所述方法包括用含有白桦酯醇的微生物培养基培养权利要求1所述的拟茎点霉，完成白桦酯醇向白桦脂酸的生物转化。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述培养的时间为8～12天。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述微生物培养基为PDB培养基。
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