CN108795774A - 一种拟茎点霉及其次生代谢产物中新甾体类化合物的分离应用 - Google Patents

一种拟茎点霉及其次生代谢产物中新甾体类化合物的分离应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，提供了一种拟茎点霉TJ507a(Phomopsis sp.TJ507a)菌株，保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016651，本发明从该菌株次生代谢产物中分离纯化制备得到了两个新甾体类化合物青拟甾酮A(Phomopsterone A)和青拟甾酮B(Phomopsterone B)，所得化合物具有对NO合成酶以及RAW264.7细胞抑制活性，为开发新的抑制NO合成酶的抗炎药物提供了候选化合物。

Description

一种拟茎点霉及其次生代谢产物中新甾体类化合物的分离 应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及从拟茎点霉菌株中分离制备新甾体类化合物的方法，具 体涉及一种拟茎点霉及其次生代谢产物中新甾体类化合物的分离应用。
背景技术
炎症是一种常见的病理反应，可能引起一系列严重的并发症，甚至威胁生命安全。一氧 化氮(NO)在人体内扮演着传递重要讯息和调节细胞功能的角色。作为生物体内一种重要的 信号分子，NO参与免疫反应、神经传导等多种生理功能的调节。内源性的NO是由一氧化氮 合酶(NOS)催化氧化L-精氨酸产生。研究表明，过量的NO引起会DNA损伤、线粒体呼吸抑制等，特别是NO与超氧负离子形成过氧亚硝酸盐阴离子等活性氮，对关键蛋白进行氮化修饰，进而改变信号途径，间接和直接介导NO的细胞毒性效应；此外多重级联信号被活化，这些信号通路之间又相互影响，形成炎症级联瀑布反应，推动炎症发展，导致多种疾病，如败血性休克、哮喘、炎症性肠病、癌症等。对于由NO生成过多而导致的疾病，开发NOS 抑制剂作为抗炎新药应用于临床将取得良好的治疗效果。
植物内生菌几乎存在于所有的植物中，是产生结构新颖及重要药理活性次生代谢产物的 主要来源之一。因此，从植物内生菌中筛选具有抗炎作用的新的天然产物具有非常重要的意 义。
本发明的目的是提供一种拟茎点霉菌株。本发明得另一个目的是提供从该茎点霉菌株的次生代 谢产物中分离制备得到的新甾体类化合物以及分离制备方法，以及所得新甾体类化合物的应 用。
实现本发明的技术方案是；本发明提供的拟茎点霉菌株是于2016年11月17日保藏于中 国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉市武汉大学)，名称为：拟茎点霉TJ507a(Phomopsis sp.TJ507a)；保藏编号：CCTCC NO：M2016651。
本发明从从上述保藏的拟茎点霉TJ507a(Phomopsis sp.TJ507a)菌株中分离纯化制备得 到以下式(1)所示新甾体类化合物化合物(化合物1、化合物2)，
化合物1：青拟甾酮A(Phomopsterone A)
化合物2：青拟甾酮B(Phomopsterone B)
式(1)
具体分离纯化制备方法包括以下步骤：
S1.种子培养基的制备：将权利要求1所述的拟茎点霉TJ507a(Phomopsissp.TJ507a) 菌株接入种子培养基，恒温箱培养，得到种子培养基；所述恒温箱培养的条件为：28℃，培 养时间为5～7天；所述种子培养基的组分为：马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂15～20g,自 来水1000mL；
S2.接种：采用固体发酵方式，在发酵瓶中加入大米固体发酵培养基，接种S1中种子培 养基，静置培养；所述大米固体发酵培养基为每1L的三角锥形瓶中加入大米200g，水200 mL；所述静置培养的时间为28～30天，培养温度为25～28℃；
S3.将S2发酵得到的菌丝体及培养基用甲醇提取，减压浓缩回收甲醇，然后用乙酸乙酯 -水萃取，得到乙酸乙酯浸膏；
S4.将S3所得浸膏经层析分离，得到式(1)中所示化合物1、化合物2；所述层析分离方法包括硅胶柱层析，凝胶柱层析，高效液相色谱。
从拟茎点霉TJ507a(Phomopsis sp.TJ507a)菌株中分离纯化得到的式1中所示的化合物 1、化合物2为具有抗炎活性的新的甾体类化合物。
本发明通过对植物内生菌拟茎点霉Phomopsis sp.TJ507a固体发酵和对其发酵产物的甲醇 提取物进行分离纯化，得到2个新甾体化合物。运用多种波谱分析方法和其他手段，确定其 结构为甾体类化合物，具体结构如式(1)所示。通过对化合物1和2的抗炎活性评价，发现 化合物1和2对NO的生成均表现出抑制活性，其中2表现出显著的NO合成酶抑制活性 本发明的第二个目的是提供式(1)中所示化合物在制备抗炎药物中的应用。化合物1和2所 述的抗炎药物均为抑制NO合成酶的药物。
附图说明
图1：化合物1X射线单晶衍射的晶体结构图。
图2：化合物2与已知化合物dankasterone A的圆二色谱比较来确定化合物2绝对构型。
具体实施方式
实施例1：化合物1、2的制备和结构鉴定。
(一)如式(1)所示1、2的制备
1.发酵条件
种子培养基的配置：取PDA固体粉末9g，再用水定容至200mL，121℃下高温灭菌30min， 备用。将植物内生菌拟茎点霉Phomopsis sp.TJ507a接种到上述培养基中，28℃恒温培养5～ 7天，得到种子培养基。
发酵：将200g大米装入1000mL锥形瓶中，加入200mL水，121℃下高温灭菌30min，备用。将上述种子培养液接种到大米培养基中，25～28℃条件下静置培养25～30天。
2.提取分离
将发酵得到的菌丝体及培养基用甲醇提取4次，低于40℃下减压浓缩回收甲醇，得到 178.3g浸膏。将总浸膏100～200目硅胶拌样，干法装柱后，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱(50:1–0:1)，TLC检测，合并相同的组分，共得到9个组分。组分5再经过反复的正反相硅 胶柱色谱，凝胶色谱和高效液相色谱分离得到化合物phomopsterone A(6.0mg)，组分6经过反复的正反相硅胶柱色谱，凝胶色谱和高效液相色谱分离分到化合物phomopsterone B(5.6 mg)。
(二)如式(1)所示化合物phomopsterones A和B结构鉴定
对化合物phomopsterones A和B分别进行质谱，紫外光谱，红外光谱，旋光，核磁共振， 圆二色谱和X射线单晶衍射等数据测试，从而确定化合物的结构。
化合物1：White crystals；(c＝0.33,CD3OD)；UV(MeOH)λmax(logε)＝202 (3.76),222(3.78)nm；IR vmax＝3499,2972,1728,1668,1461,1223cm–1；ECD(MeOH)λmax(Δε) 220(+6.9),265(-6.0),314(-0.5),355(-1.6)nm；For 1H NMR(400MHz)and 13C NMR(100 MHz)data see Table 1；HRESIMS([M+Na]+m/z 509.2879,calcd for C29H24O6Na,509.2881).
化合物1绝对构型的确定是通过X射线单晶衍射。晶体结构如图1所示。
化合物2：Yellow oil；(c＝0.56,CD3OD)；UV(MeOH)λmax(logε)＝202(4.00),254 (3.84)nm；IR vmax＝3429,2956,2871,1680,1458cm–1；ECD(MeOH)λmax(Δε)211(-10.3),226 (+2.1),243(-5.0),268(+7.3),298(-12.2),383(+7.6)nm；For 1H NMR(400MHz)and 13C NMR (100MHz)data see Tables 1；HRESIMS([M+H]+m/z 439.3195,calcdfor C29H43O3,439.3204)。
化合物2绝对构型的确定是通过与已知化合物dankasterone A的圆二色谱比较来确定的，如 图2所示。
Table 1.1H NMR and 13C NMR data for compounds 1and 2(400MHz,J in Hz)
a“m”means overlapped or multiplet with other signals.
a in CD3OD；b in CDCl3；c in DMSO–d6
实施例2：化合物1和2的对LPS诱导的NO合成酶及RAW264.7细胞生成抑制活性。结果 如Table 2所示：
Table 2.Inhibitory activities of compounds against LPS-induced NOproduction,iNOS enzyme,and RAW264.7 cells(given as IC50)
aPositive control.
实验结论：化合物2有显著的NO生成抑制活性。

Claims (5)

1.一种拟茎点霉TJ507a(Phomopsis sp TJ507a)菌株，于2016年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2016651。
2.从权利要求1所述的拟茎点霉TJ507a(Phomopsis sp.TJ507a)菌株中分离纯化制备以下式(1)所示化合物(化合物1、化合物2)的方法，
化合物1：青拟甾酮A(Phomopsterone A)
化合物2：青拟甾酮B(Phomopsterone B)
式(1)
包括以下步骤：
S1.种子培养基的制备：将权利要求1所述的拟茎点霉TJ507a(Phomopsis sp.TJ507a)菌株接入种子培养基，恒温箱培养，得到种子培养基；所述恒温箱培养的条件为：28℃，培养时间为5～7天；所述种子培养基的组分为：马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂15～20g,自来水1000mL；
S2.接种：采用固体发酵方式，在发酵瓶中加入大米固体发酵培养基，接种S1中种子培养基，静置培养；所述大米固体发酵培养基为每1L的三角锥形瓶中加入大米200g，水200mL；所述静置培养的时间为28～30天，培养温度为25～28℃；
S3.将S2发酵得到的菌丝体及培养基用甲醇提取，减压浓缩回收甲醇，然后用乙酸乙酯-水萃取，得到乙酸乙酯浸膏；
S4.将S3所得浸膏经层析分离，得到式(1)中所示化合物1、化合物2；所述层析分离方法包括硅胶柱层析，凝胶柱层析，高效液相色谱。
3.从权利要求1所述的拟茎点霉TJ507a(Phomopsis sp TJ507a)菌株中分离纯化得到的以下式1中所示的化合物1或化合物2，
化合物1：青拟甾酮A(Phomopsterone A)
化合物2：青拟甾酮B(Phomopsterone B)
式(1)
4.权利要求3中所示的化合物1或化合物2在制备抗炎药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的抗炎药物为NO合成酶抑制。
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