CN111349134B - 核桃青皮中一种达玛烷型三萜化合物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种从核桃青皮中提取得到的达玛烷型三萜化合物及其制备方法和应用，所述的三萜化合物的分子式为C₃₁H₅₂O₅。本发明提供了该化合物的制备方法包括醇提水沉处理、有机溶剂萃取、正相硅胶柱色谱分离、葡聚糖凝胶柱色谱分离和HPLC制备纯化等步骤；此外，本发明化合物对多种肿瘤细胞，包括人胃癌细胞BGC‑823、人肝癌细胞SMMC‑7721及人结肠癌细胞SW‑480均具有一定的抑制活性，有望进一步开发成为新的抗肿瘤药物。

Description

核桃青皮中一种达玛烷型三萜化合物的制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，更具体地，涉及一种从核桃青皮中分离得到的达玛烷型三萜化合物及其制备方法和在制备抗癌药物上的应用。

背景技术

消化道肿瘤为高发肿瘤，常具有发病隐匿，早期诊断困难等特点。2018年全球癌症统计数据显示，新发肿瘤的发病率及死亡率排名中，结直肠癌、胃癌位居前五。在我国除上述癌症外，肝癌、食道癌等消化道肿瘤危害性也很大。目前主要治疗手段有手术治疗、分子靶向药物治疗、放化疗等，但常常毒副反应比较大；一些中医药特色诊疗，得到越来越多医患的认可。

核桃青皮，又名青龙衣，是鲜核桃外面的肉质果皮。味苦，涩，性平；归肝、脾、胃经。在我国分布广泛，资源丰富。《简明中医词典》记载青核桃酒具有和肠胃，止疼痛的功效。《北京市中草药制剂选编》称青龙衣注射液可以疏肝、解毒。现代研究表明，青龙衣能够通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用，是我国重要的抗肿瘤药源植物。其中，活性成分包括醌类，三萜类、二芳基庚烷类等。在我国不论野生核桃还是种植核桃资源都很丰富，食用核桃时外层青皮常常丢弃造成资源浪费，充分开发和利用核桃青皮，对于抗肿瘤药物的研制开发以及肿瘤治疗具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是为解决核桃青皮资源丢弃浪费问题，提供一种具有抗肿瘤活性结构新颖的达玛烷型三萜化合物，完善三萜类化合物数据库且为抗肿瘤药物的开发提供原料。

本发明的另一目的是提供上述三萜化合物的制备方法。

本发明的再一目的是提供上述三萜化合物在抗肿瘤方面的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种从核桃青皮中分离得到的具有抗肿瘤活性的达玛烷型三萜化合物，简称胡桃达玛酮A，其化学结构式如下：

分子式为C₃₁H₅₂O₅。

本发明还提供了该达玛烷型三萜化合物的制备方法：依次通过醇提水沉处理、有机溶剂萃取、正相硅胶柱色谱分离、葡聚糖凝胶柱色谱分离和HPLC制备纯化得到。具体制备步骤如下：

（1）醇提水沉处理：新鲜核桃青皮低温烘干，适当粉碎，加入80%乙醇加热回流提取3次，药材重量与乙醇体积比为1:8，将所得提取液合并、浓缩；向上述乙醇浓缩液中加入等体积的纯净水，搅拌均匀，并于10℃下静置12小时，抽滤除去沉淀，滤液浓缩至不含醇；

（2）有机溶剂萃取：将步骤（1）中得到的浓缩液，加入适量的纯净水稀释，再依次用等体积的二氯甲烷、乙酸乙酯对稀释溶液进行反复萃取，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩干燥得到乙酸乙酯萃取物；

（3）正相硅胶柱色谱分离：取步骤（2）所得乙酸乙酯萃取物进行正相硅胶柱色谱分离。依次采用体积比为30:1、10:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，每一个比例洗脱6个柱体积，其中将体积比为10:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱部分减压回收得到分离产物；

（4）葡聚糖凝胶柱色谱分离：取经步骤（3）中获得的分离产物，通过葡聚糖凝胶柱，以体积比为6:4的甲醇-水为流动相进行等度洗脱。洗脱8个柱体积，弃去前2.5个柱体积洗脱液，收集后面洗脱液，回收溶剂，得粗品；

（5）HPLC制备纯化：将步骤（4）纯化后的粗品经制备型HPLC分离纯化。用体积比为1:1的甲醇-水为流动相，洗脱流速为3mL/min，保留时间t_R=25.5min～26.0min阶段内收集馏分，回收干燥得成品。

本发明涉及上述达玛烷型三萜化合物胡桃达玛酮A在制备抗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤细胞系包括人胃癌细胞（BGC-823）、人肝癌细胞(SMMC-7721)和人结肠癌细胞（SW-480）。

本发明具有以下优点：本发明所述的达玛烷型三萜化合物来自核桃青皮，原料易得；新活性成分的发现扩展了人们对核桃青皮中化学成分的认识，且该化合物具有良好的人胃癌细胞（BGC-823）、人肝癌细胞(SMMC-7721)和人结肠癌细胞（SW-480）抑制活性，为开发新型抗肿瘤药物提供了物质基础，也为资源回收再利用提供了有效途径。

附图说明

图1为本发明化合物的正性HR-ESI-MS谱图；

图2为本发明化合物的¹H-NMR谱图；

图3为本发明化合物的¹³C-NMR谱图；

图4为本发明化合物的DEPT谱图；

图5为本发明化合物的HSQC谱图；

图6为本发明化合物的HMBC谱图；

图7为本发明化合物的¹H-¹H COSY谱图；

图8为本发明化合物的NOESY谱图；

图9为本发明化合物酯化产物¹H-NMR谱Δδ值 (δ _S -δ _R )

具体实施方式

为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好地理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下。还可以做出若干改进和调整，这些改进和调整也应该视为本发明的保护范围。下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：胡桃达玛酮A的制备方法：

（1）醇提水沉处理：新鲜核桃青皮低温烘干，粉碎至50～70目粗粉（10kg），加入80%乙醇加热回流提取3次，药材重量与乙醇体积比为1:8，将所得提取液合并、浓缩至1.35±0.05g/mL；向上述乙醇浓缩液中加入其等体积的纯净水，搅拌均匀，并于10℃下静置12小时，抽滤除去沉淀，滤液浓缩至不含醇，体积为原来1/4倍；

（2）有机溶剂萃取：将步骤（1）中得到的浓缩液，加入2倍量的纯净水稀释，再依次用与稀释液等体积的二氯甲烷、乙酸乙酯对稀释溶液进行5次萃取，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩干燥得到乙酸乙酯萃取物114.9g；

（3）正相硅胶柱色谱分离：取步骤（2）所得乙酸乙酯萃取物进行正相硅胶柱色谱分离。乙酸乙酯萃取物与80～100目硅胶均匀拌样，二者重量比为1:2，搅拌均匀后挥干溶剂，干法上样；200～300目柱层析硅胶湿法装柱，乙酸乙酯萃取物和柱层析硅胶重量比为的1:20，柱径高比为1:5；依次采用体积比为30:1、10:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，每一个比例洗脱6个柱体积，其中将体积比为10:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱部分减压回收得到分离产物25.8g；

（4）葡聚糖凝胶柱色谱分离：取经步骤（3）中获得的分离产物，通过葡聚糖凝胶柱，样品体积加入量为凝胶总体积10%，以体积比为6:4的甲醇-水为流动相进行等度洗脱。洗脱8个柱体积，弃去前2.5个柱体积洗脱液，收集后面洗脱液，回收溶剂，得粗品1.3g；

（5）HPLC制备纯化：将步骤（4）纯化后的粗品经制备型HPLC（Waters，515-2414，SunFireTM Prep C18，250 mm×10 mm i.d.，5μm）分离纯化。用体积比为1:1的甲醇-水为流动相，洗脱流速为3mL/min，保留时间t_R=25.5min～26.0min阶段内收集馏分，回收干燥得成品15.4mg。

实施例2：胡桃达玛酮A的结构鉴定。

本发明化合物为白色无定形粉末(MeOH)。正性HR-ESI-MS谱中，如图1所示，在m/z527.2090处可见[M+Na]⁺离子峰，表明该化合物的分子量为504。结合¹H-NMR、¹³C-NMR及DEPT谱等推测其分子式为C₃₁H₅₂O₅，计算其不饱和度为6。

本化合物的¹H-NMR(CD₃OD, 400 MHz)谱显示8个甲基(-CH₃)信号δ1.26，1.16，1.16，1.07，1.03，0.99，0.97，0.92 (3H×8，s，CH₃-21，CH₃-27，CH₃-28，CH₃-30，CH₃-29，CH₃-18，CH₃-19，CH₃-31)。此外，本化合物中12位和25位分别有连氧质子信号δ3.56 (1H，ddd，J=2.5，5.6，16.0Hz)、δ 3.86(1H，d，J=6.5Hz)；而δ 5.89 (1H，brd，J = 15.7 Hz)和δ5.74(1H，dd，J = 6.5，15.7 Hz)则归属为烯碳上的质子信号，根据其耦合常数，推测该处双键为反式。本化合物的¹³C-NMR (CD₃OD, 100MHz)谱中，δ220.6处为酮羰基碳信号，δ71.9，δ75.1，δ80.5和δ73.7则为三个连氧碳信号。δ136.5，129.8也证明结构中有两个烯碳信号。

在HMBC谱中可明显观察到H₃-30 (δ1.07)，H₃-29 (δ1.03)与C-3 (δ 220.6)的羰基信号相关，推测3位有酮羰基；同时，HMBC谱中H-13 (δ 1.64)与C-12 (δ 71.9)相关，结合¹H-¹H COSY谱中H₂-11 (δ 1.26, 1.82), H-13 (δ 1.64)与H-12 (δ3.56)相关，推测12位有羟基。根据NOESY谱中H-12与H₃-31相关，可知12位羟基为β构型。观察NMR数据可知，本化合物与12β,20(R),24(R)-三羟基达玛烷-25-烯-3酮化合物结构母核相似，两个化合物的主要不同之处在于侧链。C-20，C-25和C-26在低场区，化学位移值分别为δ75.1，80.5和73.7，推测C-20、C-25和C-26处存在羟基。与20(S)-达玛烷-24-烯-2α，3β，12β，20-三醇数据对比确定20位为R构型取代。在¹H-¹H COSY谱中H-23 (δ5.89)与H-24 (δ5.74)相关，H-24 (δ5.74)与H-25 (δ3.86)相关，而且在HMBC谱中可明显观察到H₃-27 (δ1.16)和H₃-28 (δ1.16)分别与C-25 (δ80.5)和C-26 (δ73.7)相关，H₃-21 (δ1.26)与C-17 (δ53.9)相关，H₂-22 (δ1.28)与C-17 (δ53.9)和C-20 (δ75.1)相关，H₂-16 (δ1.42, 1.94)和H-23 (δ5.89)与C-20 (δ75.1)相关，上述相关信息表明结构中存在如下片段：[-C(CH₃)(OH)-CH₂-CH=CH-CH(OH)-C(OH)(CH₃)₂]。

本化合物的C-25的手性碳原子的绝对构型通过Mosher方法确定：用(R)-(-)-MTPA-Cl和(S)-(+)-MTPA-Cl分别和本化合物反应，得到了本化合物的(S)-Mosher酯和(R)-Mosher酯，通过比较两个产物间的化学位移的改变可以确定C-25的构型，(Δδ _S-R )化学位移值如图9所示，推测该化合物C-25为S构型。通过化合物的¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT、HMBC及¹H-¹HCOSY图，将该化合物的所有碳氢信号进行了相应归属(见表1)。综上分析，将本发明化合物的化学结构确定为(23E)-12β，20(R)，25(S)，26-四羟基达玛烷-23-烯-3-酮，简称胡桃达玛酮A。经SciFinder网络文献检索，确定本发明化合物为新化合物。

表1 本发明化合物NMR信号归属

效果实施例——胡桃达玛酮A的抗肿瘤活性

（1）材料和方法：采用MTT法对实施例1中制备得到的胡桃达玛酮A进行了体外肿瘤细胞抑制试验，试验所选用的肿瘤细胞株为人胃癌细胞BGC-823，人肝癌细胞SMMC-7721和人结肠癌细胞SW-480，上述瘤株均源自赛尔试剂公司。

具体方法如下：取对数生长期且状态良好的BGC-823、SMMC-7721、SW-480细胞，在96孔培养板上接种，每孔10⁴个细胞密度，100 μL/孔。接种好后，将上述肿瘤细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中（另含有100 μg/mL 盘尼西林，100 μg/mL链霉素）培养于37℃，5% CO₂培养箱内，培养24小时后给药，作用48 h，药物浓度设为5、10、20、40、80、160 μM，每组设3个复孔，另设空白孔和对照孔（空白孔未接种细胞，对照孔为不含药物的培养液）。药物作用48 h后，加入5 mg/mL的MTT 20 μL/孔，继续培养4 h后离心，吸弃96孔内的培养上清液，再加入DMSO 150 μL/孔，置摇床上低温振荡10 min，使结晶物完全充分溶解。用酶联免疫检测仪在波长570 nm波长处测定每孔的吸光值（OD值），计算出细胞存活抑制率：细胞存活抑制率%=[1-(实验组A-空白组A)/（对照组A-空白组A）]×100%。使用Logit法计算药物的IC₅₀值，顺铂为阳性对照药。结果如下表2所示：

表2 受试药物对3种肿瘤细胞株BGC-823、SMMC-7721、SW-480的抑制作用

（2）结果：经线性回归计算IC₅₀值显示本发明涉及的达玛烷型三萜化合物胡桃达玛酮A对人胃癌BGC-823细胞、人肝癌细胞SMMC-7721和人结肠癌细胞SW-480细胞作用IC₅₀值分别为20.55±1.35 μM、47.18±3.05 μM和35.99±2.91 μM，阳性对照药顺铂对人胃癌BGC-823细胞、人肝癌细胞SMMC-7721和人结肠癌细胞SW-480细胞作用IC₅₀值分别为5.86±2.15μM、28.23±1.17和14.90±1.93 μM。

结果表明胡桃达玛酮A对人胃癌BGC-823细胞、人肝癌细胞SMMC-7721、人结肠癌细胞SW-480细胞的生长均有较强的抑制作用，尤其是对BGC-823抑制效果最好。据上结果可知，本发明所述胡桃达玛酮A具有制备抗肿瘤药物的应用前景。

Claims (1)

1.一种从核桃青皮中分离得到的达玛烷型三萜化合物胡桃达玛酮A的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

（1）醇提水沉处理：新鲜核桃青皮40℃低温烘干，适当粉碎，加入80%乙醇加热回流提取3次，将所得提取液合并、浓缩；向上述乙醇浓缩液中加入等体积的纯净水，搅拌均匀，并于10℃下静置12小时，抽滤除去沉淀，滤液浓缩至不含醇；

（2）有机溶剂萃取：将步骤（1）中得到的浓缩液，加入适量的纯净水稀释，再依次用等体积的二氯甲烷、乙酸乙酯对稀释溶液进行反复萃取，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩干燥得到乙酸乙酯萃取物；

（3）正相硅胶柱色谱分离：取步骤（2）所得乙酸乙酯萃取物进行正相硅胶柱色谱分离，依次采用体积比为30:1、10:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂梯度洗脱，其中将体积比为10:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂洗脱部分减压回收得到分离产物；

（4）葡聚糖凝胶柱色谱分离：取经步骤（3）中获得的分离产物，通过葡聚糖凝胶柱，以体积比为6:4的甲醇-水为流动相进行等度洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得粗品；

（5）HPLC制备纯化：将步骤（4）纯化后的粗品经制备型HPLC分离纯化，用体积比为1:1的甲醇-水为流动相，洗脱流速为3mL/min，保留时间t_R=25.5min～26.0min阶段内收集馏分，回收干燥得成品；所述达玛烷型三萜化合物胡桃达玛酮A的分子式为C₃₁H₅₂O₅，其结构式如式I所示：

式I。

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