CN105037470B

CN105037470B - 一种三萜类化合物及其制备方法和医药用途

Info

Publication number: CN105037470B
Application number: CN201510192080.XA
Authority: CN
Inventors: 许建华; 李鹏; 张志强; 柯方; 沈翠娥; 熊小文
Original assignee: Fujian Medical University
Current assignee: FUJIAN XIANZHILOU BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY CO.,LTD.
Priority date: 2015-04-22
Filing date: 2015-04-22
Publication date: 2017-06-06
Anticipated expiration: 2035-04-22
Also published as: CN105037470A

Abstract

本发明公开一种三萜类化合物及其制备方法和医药用途，所述三萜类化合物为式（Ⅰ）的化合物，其化学结构式如下：（Ⅰ）。其制备方法为：将灵芝用醇或醇溶液提取一次或2次以上，过滤，收集滤液，再减压浓缩干燥，获得醇提取物；将醇提取物加水，以石油醚萃取脱脂后，再以乙酸乙酯萃取，获得的乙酸乙酯萃取液再以pH 8‑12碱性水溶液萃取，取乙酸乙酯相蒸干，获得粗品；将获得的粗品进行色谱分离纯化，得到纯的式（Ⅰ）化合物。能作为治疗肿瘤的药物。

Description

一种三萜类化合物及其制备方法和医药用途

技术领域

本发明涉及一种从中药灵芝中分离出的具有抗肿瘤作用的新化合物。

本发明还涉及该化合物的制备方法。

本发明还涉及以该化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤常称癌症，是严重威胁人类健康的常见病、多发病。目前治疗恶性肿瘤的三大主要方法包括化学治疗、外科手术和放射治疗。化疗是当今治疗肿瘤的主要手段，在肿瘤治疗中有明显的疗效，但对肿瘤细胞的特异性仍不理想，在杀伤肿瘤的同时也影响正常细胞如肝细胞、肠胃道和骨髓细胞等，具有较大的毒副作用(如导致免疫功能低下、骨髓抑制和急性肾功能衰竭等)；此外临床上许多肿瘤对化疗不敏感，或是在最初的敏感后表现为群体抗性，这成为化疗来治疗肿瘤的一大障碍。由于化学合成药物具有很大的毒副作用，从传统中药中寻找毒性低、疗效高的抗癌新药成为肿瘤治疗研究领域的重要课题。在我国，采用中药防治恶性肿瘤历史悠久。很多中药已被证实具有抗肿瘤作用，如斑盂对肝癌、胃癌、乳腺癌等有效；长春花碱对恶性淋巴瘤、白血病等肿瘤有效；喜树碱对白血病有效等。由于植物所含的天然化合物具有来源广泛、价格低廉、毒性低等优点，因此从中草药中寻找高效低毒，作用专一的抗肿瘤药物有广阔的发展前景。

中药灵芝是多孔菌科灵芝属真菌植物赤芝[Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst]或紫芝[Ganoderma japonicum(Fr.) Lloyd]的干燥子实体。性温、味甘，具有补中益气、滋补强壮、扶正固本的功效，临床上常用于肿瘤的治疗或辅助治疗。对于灵芝抗肿瘤有效成分的研究，主要针对灵芝多糖和灵芝三萜类成分。抗肿瘤研究结果表明，灵芝三萜对多种肿瘤细胞的生长和转移都有抑制作用。对灵芝三萜类成分的研究在20世纪八十年代达到了高潮，目前已经有150多种灵芝三萜类成分被分离鉴定，我们在针对灵芝抗肿瘤作用的有效成分研究中，分离鉴定了一个新的三萜类化合物，命名为24(S)-24, 25-dihydroxylanost-8-en-3, 7, 11-trione。药理学实验表明，该化合物具有抗肿瘤活性。针对该化合物经过试验，确定了合理的制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种从灵芝中分离出的具有抗肿瘤作用的新的三萜类化合物[24(S)-24, 25-dihydroxylanost-8-en-3, 7, 11-trione]。

本发明的另一个目的在于提供制备该化合物方法。

本发明的再一目的在于提供该化合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

根据本发明的一方面，提供具有下列化学结构式（Ⅰ）的化合物：

（Ⅰ）。

本发明所述的化合物（Ⅰ）的制备方法，包括以下步骤：

A）将灵芝用醇或醇溶液提取一次或2次以上，过滤，收集滤液，再减压浓缩干燥，获得醇提取物；

B）将醇提取物加水，以石油醚萃取脱脂后，再以乙酸乙酯萃取，获得的乙酸乙酯萃取液再以pH 8-12碱性水溶液萃取，取乙酸乙酯相蒸干，获得粗品；

C）将获得的粗品进行色谱分离纯化，得到纯的式（Ⅰ）化合物。

上述步骤C）的粗品进行色谱分离纯化的步骤包括如下：1）将粗品在硅胶上进行柱层析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，获得石油醚-乙酸乙酯的体积比为1:2的洗脱物；2) 取此部位的洗脱物经制备型高效液相色谱分离，甲醇-水梯度洗脱，从甲醇-水的体积比为85:15的洗脱部位得到纯的式（Ⅰ）化合物。

上述pH 8-12碱性水溶液采用饱和NaHCO₃水溶液。

上述的结构式（Ⅰ）的化合物或其衍生物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

所述的肿瘤为人慢性粒细胞白血病细胞株K562、人髓系白血病细胞株HL60、人口腔表皮样癌细胞株KB、人食管癌细胞株OE-19或人结肠癌细胞株SW620。

含有治疗有效量的上述的结构式（Ⅰ）的化合物或其衍生物的药物组合物。

上述结构式（Ⅰ）的化合物和/或其衍生物的含量大于50%以上，尤其90%以上。

含有治疗有效量的上述的结构式（Ⅰ）的化合物或其衍生物的药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。

具体地说，本发明上述化合物（Ⅰ）的制备方法，本发明的化合物可以人工合成，但优选的是从天然植物中分离提取，以获得天然存在的、低毒性的天然化合物。在本发明的一个优选实施方案中，从中国传统中药灵芝中分离纯化了本发明的化合物，其制备步骤包括：

A）将灵芝用醇或醇溶液提取一次或多次，过滤，收集滤液，再减压浓缩干燥，获得醇提取物；

B）将醇提取物加水，以石油醚萃取脱脂后，再以乙酸乙酯萃取，获得的乙酸乙酯萃取液再以饱和NaHCO₃水溶液萃取，取乙酸乙酯相蒸干，获得粗品。

上述步骤C）的粗品进行色谱分离纯化的步骤包括如下：1）将粗品在硅胶上进行柱层析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，获得石油醚-乙酸乙酯（体积比1:2）洗脱物；2）取此部位经制备型高效液相色谱分离，甲醇-水梯度洗脱，从甲醇-水（体积比85:15）洗脱部位得到纯的式（Ⅰ）化合物。

根据本发明的再一方面，提供含有本发明化合物的药物组合物，可以通过将本发明化合物添加药学上可接受的载体或附形剂或可选的其他成分而制成适于临床使用的药物组合物。

根据本发明的再一方面，提供本发明化合物在制备治疗肿瘤药物中的应用，具有杀伤肿瘤细胞的作用。

所述的肿瘤优选为人髓系白血病细胞株HL60和人食管癌细胞株OE-19。

实验表明在含有结构式（Ⅰ）的化合物和/或其衍生物的药物组合物中，其中结构式（Ⅰ）的化合物和/或其衍生物的含量大于50%以上，尤其90%以上，治疗效果较佳。

本发明的有益效果是：肿瘤细胞增殖的抑制作用，本发明的24(S)-24, 25-dihydroxylanost-8-en-3, 7, 11-trione对OE-19细胞增殖有显著的抑制作用，表现出明显的量效关系（见图1）。药物作用于OE-19细胞48 h的IC₅₀值是11.03μg/ml。作用于HL60细胞48 h 的IC₅₀值是43.21μg/ml。实验结果表明，本发明的化合物具有抗肿瘤活性。由上可知，本发明的式（Ⅰ）化合物——24(S)-24, 25-dihydroxylanost-8-en-3, 7, 11-trione制备方法简便，工艺条件温和，式（Ⅰ）化合物为白色晶体，实验证明采用本发明工艺步骤，获得的产品纯度可达98%，明显高于现有技术的步骤。本发明的化合物能作为治疗肿瘤的药物，其具有杀伤肿瘤细胞的作用，尤其对人食管癌具有较好的疗效。

附图说明

图1为本发明式（Ⅰ）化合物（作用48h）对OE-19细胞增殖抑制作用的量效关系曲线图。

具体实施方式

下面通过对本发明实施例的描述，详细说明但不限制本发明。

实施例

实施例1式（Ⅰ）化合物的制备

材料来源灵芝（Ganoderma lucidum(Leys.ex Fr.)Karst）购自中国福建仙芝楼生物科技有限公司，该灵芝的标本样本保藏在福建医科大学药学院。

提取和分离将干的和粉碎的灵芝用无水乙醇回流提取3次，每次2h，提取液用2号滤纸过滤，用旋转蒸发器去除乙醇获得醇提浸膏。醇提浸膏加适量水后，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，获得的乙酸乙酯萃取液再用饱和碳酸氢钠水溶液萃取，取出乙酸乙酯相减压浓缩蒸干得粗品，将粗品在硅胶上进行柱层析，用体积比1:2的石油醚-乙酸乙酯洗脱，取石油醚-乙酸乙酯（体积比1:2）洗脱物经制备型高效液相色谱（沃特世Pre-150B制备型高效液相色谱仪）分离，采用体积比85:15的甲醇-水洗脱，从甲醇-水（体积比85:15）洗脱部位得到纯的式（Ⅰ）化合物。式（Ⅰ）化合物为白色晶体，经测试纯度达98%。

实施例2式（Ⅰ）化合物的化学结构测定

结构测定用Shimadzu-3100分光光度计测定紫外光谱，在CDCl₃溶液中用BRUKER核磁共振波谱仪记录NMR光谱，用Agilent 6210飞行时间质谱仪测定质谱。

式（Ⅰ）化合物的理化性质本发明式（Ⅰ）化合物为白色晶体，UV（EtOH）λmax 254nm；Liebermann-Burchard反应阳性；¹H-NMR（CDCl₃，500MHz）：δ1.74(1H，m，H-1)，δ2.95(1H，m，H-1’)，δ2.47(1H，m，H-2)，δ2.58(1H，m，H-2’)，δ2.24(1H，m，H-5)，δ2.36(1H，m，H-6)，δ2.52(1H，m，H-6’)，δ2.63 (1H，m，H-12)，δ2.71(1H，m，H-12’)，δ1.62(1H，m，H-15)，δ2.13(1H，m，H-15’)，δ1.20(1H，m，H-16)，δ2.10(1H，m，H-16’)，δ1.65(1H，m，H-17)，δ0.81(3H，s，H-18)，δ1.26(3H，s，H-19)，δ1.40(1H，m，H-20)，δ0.89(3H，d，J=5.5Hz，H-21)，δ1.00(1H，m，H-22)，δ1.79(1H，m，H-22’)，δ 1.10(1H，m，H-23)，δ 1.58(1H，m，H-23’)，δ3.28(1H，m，H-24)，δ1.20(3H，s，H-26)，δ1.15(3H，s，H-27)，δ1.11(3H，s，H-28)，δ1.09(3H，s， H-29)，δ1.20(3H，s，H-30)；¹³C-NMR（CDCl₃，125MHz）：δ34.96(C-1), 34.00(C-2)，215.83(C-3)，46.68(C-4)，49.64(C-5)，37.03(C-6)，210.39(C-7)，151.65(C-8)，149.67(C-9)，38.76(C-10)，202.12(C-11)，51.23(C-12)，48.64(C-13)，46.80(C-14)，31.88(C-15)，27.31(C-16)，49.19(C-17)，16.90(C-18)，17.96(C-19)，36.48(C-20)，18.63(C-21)，33.26(C-22)，28.63(C-23)，79.39(C-24)，73.31(C-25)，26.56(C-26)，23.13(C-27)，27.46(C-28)，20.30(C-29)，25.86(C-30)；ESI-MS：m/z 485.4[M-H]^-1。

从HMBC谱图及HSQC谱图数据，并结合上述理化数据，确证式（Ⅰ）化合物的结构式如下：

实施例3式（Ⅰ）化合物抗癌作用的生物学实验及分析

1、材料和方法

细胞系和试剂人食管癌细胞株OE-19和人髓系白血病细胞株HL60。将这些细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中培养，置37℃，5%饱和湿度的CO₂培养箱中培养。上述的三萜类式（Ⅰ）化合物——化学名为24(S)-24, 25-dihydroxylanost-8-en-3, 7, 11-trione，来自于实施例1的制备而获得的。

细胞增殖分析取对数生长期的OE-19及HL60细胞，根据细胞株不同按一定的密度接种于96孔培养板中，每孔190 μl。接种细胞后立即加药。实验组加入不同浓度药物10 μl/孔，细胞对照组加含等量浓度DMSO的无血清培养液，空白对照组为190 μl RPMI 1640加10μl无药溶剂，每组3个复孔。OE-19及HL60孵育48 h后，加入5 mg/ml的MTT 20 μl/孔，37℃孵育4 h后离心（2000 rpm，10分钟），小心吸去上清，加150 μl/孔DMSO混匀，各组均于570 nm波长处测定各孔的OD值，计算细胞生长抑制率，抑制率=(1-药物处理孔平均OD值/细胞对照孔平均OD值)×100%。以药物浓度为横轴，抑制率值为纵轴绘制细胞增殖抑制量效关系曲线。用Logit法计算48 h时药物浓度的IC₅₀值，实验重复3次，取平均值。

结果

肿瘤细胞增殖的抑制作用结果上述的三萜式（Ⅰ）化合物 [24(S)-24, 25-dihydroxylanost-8-en-3, 7, 11-trione]对OE-19细胞增殖有显著的抑制作用，表现出明显的量效关系（见图1）。药物作用于OE-19和HL60细胞48 h的IC₅₀值分别是11.03μg/ml和43.21μg/ml。实验结果表明，本发明的化合物具有抗肿瘤活性。

Claims

1.一种三萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：

C）将获得的粗品进行色谱分离纯化，得到纯的式（Ⅰ）化合物；

步骤C）的粗品进行色谱分离纯化的步骤包括如下：1）将粗品在硅胶上进行柱层析，用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，获得石油醚-乙酸乙酯的体积比为1:2的洗脱物；2) 取此部位的洗脱物经制备型高效液相色谱分离，甲醇-水梯度洗脱，从甲醇-水的体积比为85:15的洗脱部位得到纯的式（Ⅰ）化合物；其化学结构式如下：

。

2.根据权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于pH 8-12碱性水溶液采用饱和NaHCO₃水溶液。