CN101993373A - 酰氯化蓝萼甲素衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酰氯化蓝萼甲素衍生物的结构、制备方法及其在治疗癌症中的应用。所述酰氯化蓝萼甲素衍生物的分子结构的通式如下：

Description

酰氯化蓝萼甲素衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及蓝萼甲素(GLA)衍生物，特别涉及酰氯化蓝萼甲素衍生物。本发明还涉及所述酰氯化蓝萼甲素衍生物的制备方法及其在治疗癌症中的应用。

背景技术

唇形科香茶菜属植物。在亚洲东部和非洲西部广为分布，全世界约有150种，我国约有90种25个变种。其中约有30种民间作为药用，作为清热解毒、抗癌消炎、健脾、活血、杭菌药来使用。人们对该属植物的-菇类成分作了研究，已从中提取了百余种药类成分。经药理筛选发现许多二萜化合物具有细胞毒、抗肿瘤、杭炎活性作用。

蓝萼香茶菜是唇形科香茶菜属植物，分布在我国的东北、华北，朝鲜.日本，原苏联远东地区，吉林省资源尤其丰富。蓝萼香茶菜具有健胃、清热解毒、活血、抗菌消炎和抗癌活性，用于胃炎、肝炎初起、感冒发热、乳腺炎、关节痛等疾病。现代研究发现全草对心血管有一定的作用，而其中的有效成分对血小板聚集及癌症有一定的影响。

1981年许云龙等人从蓝萼香茶菜中提取出蓝萼甲素(glaucocalyxinA)和蓝萼乙素(glaucocalyxinB)，从光谱中推断蓝萼甲素具有香茶菜属二萜典型的巧一氧-16一贝壳杉烯(ent-15-oxo-l6-kaurene)骨架，而蓝萼乙素是蓝萼甲素的14一乙酰化物，把两者分别乙酰化，得到相同的乙酰化物，从而证实了两者的相互关系。随后赵全成也从吉林产蓝萼香茶菜中分得这两种二萜。

1988年刘晨江等从北京地区产蓝萼香茶菜中分得甲素和乙素外，还分得蓝萼丙素(glaucocalyxinC)，结构为对映-7p，14a，15a-三羟基-16-贝壳杉-3-酮。Dongsa kimls，除了从中分出蓝萼甲素、蓝萼乙素和蓝萼丙素，还分出了两种新二萜glaucocalyxinD和glaucocalyxinE并列出了这五种化合物的结构红外紫外吸收值、最主要的1H一核磁共振、13C一核磁共振化学位移值及质谱数据值。

金永日等从蓝萼香茶菜根中分得了蓝萼甲素，另外王先荣等从安徽产王枣子〔lsodonamethystoides(Benth)CyWuetHsuan〕中也分得蓝萼甲素。王慧芬等人用反相高效液相色谱法外标法对不同部位及不同采集期的蓝萼香茶菜中蓝萼甲素的含量进行了测定，结果表明叶中蓝萼甲素远高于根、茎。不同采集期以7-8月份含量高，9月末含量下降。张元桐等也采用反相HPLC测定蓝萼甲素含量，测得蓝萼甲素含量为1.03％，平均回收率为99.2％。

从蓝萼甲素体内外实验结果来看，其具有较强的抗肿瘤作用，且抗瘤谱较广，能抑制Lewis肺癌、5180实体型以及HCA实体型等实体瘤的生长，明显增加荷腹水型5180腹水型和荷HCA腹水型小鼠的生命延长率，其抗肿瘤作用的强弱呈剂量依赖性。

科研人员用MTT法对从毛叶香茶菜叶中分离鉴定的14个已知对映-贝壳杉烯类二萜化合物进行了人早幼粒白血病细胞、人卵巢癌细胞和人肺癌细胞的抗癌活性研究，其中具有α-亚甲基环戊酮结构的化合物对上述3种肿瘤细胞株均表现出不同程度的抑制活性。从蓝萼香茶菜叶分离的化合物如蓝尊香茶菜甲素(GLA)和乙素(GLB)结构中具有α-亚甲基环戊酮，因而显示出较强的生物活性。

对若干天然及化学修饰后的贝克杉烯类化合物进行了系统的体外抗肿瘤活性筛选及构效关系研究表明，应用化学手段破坏分子中α-亚甲基环戊酮结构单元，会显著降低贝克杉烯类化合物的抗肿瘤活性。

由于蓝萼甲素为对映-贝壳杉烯类二萜化合物，其化合物极性小，易溶于氯仿等非极性溶剂，在水中不溶，因此不适合直接作为药物进行给药；蓝萼甲素体外具有明显的抗癌作用，但在体内需大剂量长时间用药才能产生药效。药物在体内消除很快，半衰期短，尚不能直接作为药物使用。

发明内容

鉴于蓝萼甲素(GLA)特别是其α-亚甲基环戊酮结构对肿瘤细胞株活性具有良好的抑制作用，然而由于其极性小、半衰期短等特点，其不适于直接作为药物进行给药，故现在需要以蓝萼甲素(GLA)为先导化合物，通过对先导化合物的结构改造，来获得蓝萼甲素的衍生物，从而使其按照已知的代谢途径失活或不代谢，而由原形排出体外，从而提高药物的安全性，增加药效。

本发明的目的之一在于提供具有对肿瘤细胞株良好的抑制作用的、结构改良的酰氯化蓝萼甲素(GLA)衍生物，从而解决GLA极性小、不易溶于水、半衰期短、在体内消除过快等缺陷，从而作为治疗癌症的药物使用。

本发明的目的之二在于提供所述酰氯化蓝萼甲素衍生物的制备方法，避免单纯的采用有机合成所带来的毒副作用较大的缺陷，并且避免单纯的采用原料提纯多带来的药效较低、无法针对性治疗某一特定癌症的缺陷。

本发明所公开的酰氯化蓝萼甲素衍生物是一种贝壳杉烷型四环二萜类物质，具有贝壳杉烷型结构、羰基、羟基和酰氯结构，其分子结构的通式如下：

其中，R1为苯甲酰氯取代基-C7H6O2、苯磺酰氯取代基-C6H6O3S2或-OH，R2为苯甲酰氯取代基-C7H6O2、苯磺酰氯取代基-C6H6O3S2或-OH。

故，在较佳的优选实施例中，所述R1和R2中至少有一个为-OH。

在一个优选实施例中，所述R1为-C7H6O2，所述R2为-OH，所述衍生物分子结构如下：

在一个优选实施例中，所述R1为-OH，所述R2为-C7H6O2，所述衍生物分子结构如下。

在一个优选实施例中，所述R1为-C6H6O3S2，所述R2为-OH，所述衍生物分子结构如下：

在一个优选实施例中，所述R1为-OH，所述R2为-C6H6O3S2，所述衍生物分子结构如下：

上述酰氯化GLA衍生物由于具有GLA的α-亚甲基环戊酮结构，故其对肿瘤细胞株活性具有良好的抑制作用，另一方面，上述多肽类GLA进行了结构修饰，解决了极性小、半衰期短等缺陷特点，适于作为治疗癌症的药物使用。

上述酰氯化蓝萼甲素衍生物是按照以下方法进行制备的，其包含用于制备作为先导化合物的蓝萼甲素的步骤1～4以及用于结构修饰蓝萼甲素进行衍生化的步骤5。

所述步骤1为提取步骤，具体包括以下步骤：

步骤1.1：取香茶菜药材(地上部分)粉碎至20目～50目；

步骤1.2：将所得的粉碎物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶5～1∶15混合，加热，在80℃～90℃温度条件下回流1～2小时，提取、过滤，得到提取液和剩余物；

步骤1.3：将步骤1.2所得的剩余物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶5～1∶15混合，加热，在80℃～90℃温度条件下回流1～2小时，提取、过滤，得到提取液和剩余物，重复该步骤1～3次；

步骤1.4：合并步骤1.2和1.3所得的提取液。

所述步骤2为溶剂处理步骤，具体包括以下步骤：

步骤2.1：将步骤1所得的提取液加热，在55℃～65℃温度条件下加热减压浓缩，回收乙醇并得到粘稠的初级浓缩物；

步骤2.2：将步骤2.1所得的初级浓缩物与水按照体积比1∶8～1∶10混合，在室温条件下以60～120转/分的速度搅拌10分钟，随后静置6～12小时，弃去上清液得到下层固体；

步骤2.3：将步骤2.2所得的固体与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶4～1∶6混合，在25℃～35℃温度条件下以60～120转/分的速度搅拌溶解，静置1～3小时，过滤得到滤液和不溶物；

步骤2.4：将步骤2.3所得的不溶物与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶4～1∶6混合，在25℃～35℃温度条件下以60～120转/分的速度搅拌溶解，静置1～3小时，过滤得到滤液和不溶物，重复该步骤1～3次；

步骤2.5：合并步骤2.3和2.4所得的滤液；

步骤2.6：将步骤2.5所得的滤液加热，在35℃～45℃温度条件下加热减压浓缩，回收乙酸乙酯(A.R.)，得到固体浓缩物。

所述步骤3为树脂处理步骤，具体包括以下步骤：

步骤3.1：将步骤2所得的固体浓缩物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶4～1∶6混合溶解，得到溶液；

步骤3.2：将步骤3.1所得的溶液缓慢加到7号树脂柱中，起观察树脂的颜色，在树脂柱有2/3变色时，停止加样，并采用200ml～400ml的95％乙醇(A.R.)冲洗该树脂柱，收集所有流出液，所述树脂柱的填充物为强碱性阴离子树脂并用氢氧化钠饱和至pH值中性；

步骤3.3：将步骤3.2所得流出液加热，并在55℃～65℃温度条件下加热减压回流，直至溶剂干，得到固体残留物。

所述步骤4为重结晶步骤，具体包括以下步骤：

步骤4.1：将上述残留物与30℃～40℃的极性溶剂按照体积比1∶4～1∶6混合，得到初级溶液，加热，在30℃的～40℃温度条件下减压浓缩，在-23℃～-13℃温度条件下静置析晶，过滤得到浅黄色针状结晶；

所述极性溶剂为按照体积比1∶1～1∶2混合的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液；

步骤4.2：将步骤4.1所得的结晶与极性溶剂按照体积比1∶4～1∶6混合，在-23℃～-13℃温度条件下反复重结晶2～4次，每次12～24小时，得到中间产物蓝萼甲素；

所述极性溶剂为按照体积比1∶1～1∶4混合的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液。

所述步骤5为衍生化步骤，具体包括以下步骤：

步骤5.1：将90～110mg步骤4所得蓝萼甲素溶于3～7ml二氯甲烷中，并在0℃～5℃的冰水浴条件下，缓慢依次加入苯甲酰氯或苯磺酰氯、40.6～50.6mg三乙胺和3.1～4.1mgDMAP，并在室温条件下搅拌反应12小时；

步骤5.2：向步骤5.1的反应溶液中加入5～15ml水稀释，随后采用5～15ml二氯甲烷萃取2～4次，合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥；

步骤5.3：将步骤5.2中经洗涤干燥后的有机相加热至35℃～40℃减压浓缩以蒸去溶剂，并在室温条件下干燥，得到白色粉末状产物；

步骤5.4：采用高效制备薄层层析硅胶板分离步骤5.3所得白色粉末状产物，将分离所得产物溶于15～25ml甲醇，过滤并将所得滤液加热至35℃～40℃减压浓缩至干，得到蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物的无色晶体。

经上述制备过程所得的酰氯化蓝萼甲素衍生物，由于具有α-亚甲基环戊酮结构，故其对肿瘤细胞株具有良好的抑制作用，可用于治疗癌症，特别用于治疗胃癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、宫颈癌、人结肠癌。

本发明同时公开了所述酰氯化蓝萼甲素衍生物在治疗癌症中的应用，特别是在治疗胃癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、宫颈癌、人结肠癌中的应用。

本发明所公开的前述任一结构的酰氯化蓝萼甲素衍生物可以采用药剂学上的常规药物载体制成任何一种剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、软胶剂、喷雾剂、凝胶剂、凝胶吸入剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、脂质体注射剂、靶向给药注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。

附图说明

图1为蓝萼甲素与苯甲酰氯的反应方程式。

图2a为图1所示反应所得蓝萼甲素与苯甲酰氯的衍生物的HPLC图。

图2b为图1所示反应所得蓝萼甲素与苯甲酰氯的衍生物的LC-MS图。

图3为蓝萼甲素与苯磺酰氯的反应方程式。

图4a为图3所示反应所得蓝萼甲素与苯磺酰氯的衍生物的HPLC图。

图4b为图3所示反应所得蓝萼甲素与苯磺酰氯的衍生物的LC-MS图。

具体实施方式

根据本发明的权利要求和发明内容所公开的内容，本发明的技术方案具体如以下实施例所述。

本发明所公开的制备方式是在三乙胺和4-二甲氨基吡啶(DMAP)存在的条件下，将经提取处理后的蓝萼甲素与苯甲酰氯或苯磺酰氯反应，从而制备得到本发明所公开的酰氯化蓝萼甲素衍生物，该制备过程主要包括蓝萼甲素的制备以及取代基的衍生化。以下实施例所述制备过程，所采用的各种化学试剂如无特别标注，则为分析纯。

实施例1：蓝萼甲素的制备

采用香茶菜药材(地上部分)作为原料，通过提取、溶剂处理、树脂处理和重结晶等步骤，制备得到蓝萼甲素(GLA)，其具体过程如下：

步骤1为提取步骤，其进一步包括：

步骤1.1：取香茶菜药材(地上部分)粉碎至20目～50目；

步骤1.2：将所得的粉碎物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶5～1∶15混合，加热，在80℃～90℃温度条件下回流1～2小时，提取、过滤，得到提取液和剩余物；

步骤1.3：将步骤1.2所得的剩余物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶5～1∶15混合，加热，在80℃～90℃温度条件下回流1～2小时，提取、过滤，得到提取液和剩余物，重复该步骤1～3次；

步骤1.4：合并步骤1.2和1.3所得的提取液。

步骤2为溶剂处理步骤，其进一步包括：

步骤2.1：将步骤1所得的提取液加热，在55℃～65℃温度条件下加热减压浓缩，回收乙醇并得到粘稠的初级浓缩物；

步骤2.2：将步骤2.1所得的初级浓缩物与水按照体积比1∶8～1∶10混合，在室温条件下以60～120转/分的速度搅拌10分钟，随后静置6～12小时，弃去上清液得到下层固体；

步骤2.3：将步骤2.2所得的固体与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶4～1∶6混合，在25℃～35℃温度条件下以60～120转/分的速度搅拌溶解，静置1～3小时，过滤得到滤液和不溶物；

步骤2.4：将步骤2.3所得的不溶物与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶4～1∶6混合，在25℃～35℃温度条件下以60～120转/分的速度搅拌溶解，静置1～3小时，过滤得到滤液和不溶物，重复该步骤1～3次；

步骤2.5：合并步骤2.3和2.4所得的滤液；

步骤2.6：将步骤2.5所得的滤液加热，在35℃～45℃温度条件下加热减压浓缩，回收乙酸乙酯(A.R.)，得到固体浓缩物。

步骤3为树脂处理步骤，其进一步包括：

步骤3.1：将步骤2所得的固体浓缩物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶4～1∶6混合溶解，得到溶液；

步骤3.2：将步骤3.1所得的溶液缓慢加到7号树脂柱中，起观察树脂的颜色，在树脂柱有2/3变色时，停止加样，并采用200ml～400ml的95％乙醇(A.R.)冲洗该树脂柱，收集所有流出液，所述树脂柱的填充物为强碱性阴离子树脂并用氢氧化钠饱和至pH值中性；

步骤3.3：将步骤3.2所得流出液加热，并在55℃～65℃温度条件下加热减压回流，直至溶剂干，得到固体残留物。

步骤4为重结晶步骤，其进一步包括：

步骤4.1：将上述残留物与30℃～40℃的极性溶剂按照体积比1∶4～1∶6混合，得到初级溶液，加热，在30℃的～40℃温度条件下减压浓缩，在-23℃～-13℃温度条件下静置析晶，过滤得到浅黄色针状结晶；

所述极性溶剂为按照体积比1∶1～1∶2混合的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液；

步骤4.2：将步骤4.1所得的结晶与极性溶剂按照体积比1∶4～1∶6混合，在-23℃～-13℃温度条件下反复重结晶2～4次，每次12～24小时，得到中间产物蓝萼甲素；

所述极性溶剂为按照体积比1∶1～1∶4混合的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液。

通过上述步骤制备得到蓝萼甲素。

实施例2：衍生化

按照图1所示的反应方程式，将实施例1所制备得到的蓝萼甲素，采用苯甲酰氯进行衍生化，从而向蓝萼甲素中引入修饰取代基，得到蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物，所述衍生化步骤5进一步包括：

步骤5.1：将90～110mg步骤4所得蓝萼甲素溶于3～7ml二氯甲烷中，并在0℃～5℃的冰水浴条件下，缓慢依次加入41.5～51.5mg苯甲酰氯、40.6～50.6mg三乙胺和3.1～4.1mgDMAP，在室温条件下搅拌反应12小时；

步骤5.2：向步骤5.1的反应溶液中加入5～15ml水稀释，随后采用5～15ml二氯甲烷萃取2～4次，合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥；

步骤5.3：将步骤5.2中经洗涤干燥后的有机相加热至35℃～40℃减压浓缩以蒸去溶剂，并在室温条件下干燥，得到白色粉末状产物；

步骤5.4：采用高效制备薄层层析硅胶板分离步骤5.3所得白色粉末状产物，采用体积比为10∶1的氯仿-丙酮混合溶液作为展开剂，待产物展开后，采用紫外灯在254nm下检视，刮下样品分布带，分离得到产物，将分离所得产物溶于15～25ml甲醇，过滤并将所得滤液加热至35℃～40℃减压浓缩至干，得到蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物的无色晶体。

实施例3：衍生化

按照图3所示的反应方程式，将实施例1所制备得到的蓝萼甲素，采用苯磺酰氯进行衍生化，从而向蓝萼甲素中引入修饰取代基，得到蓝萼甲素的苯磺酰氯衍生物，所述衍生化步骤5进一步包括：

步骤5.1：将90～110mg步骤4所得蓝萼甲素溶于3～7ml二氯甲烷中，并在0℃～5℃的冰水浴条件下，缓慢依次加入106.8～126.8mg苯磺酰氯、86.3～96.3mg三乙胺和6.2～8.2mgDMAP，在室温条件下搅拌反应12小时；

步骤5.2：向步骤5.1的反应溶液中加入5～15ml水稀释，随后采用5～15ml二氯甲烷萃取2～4次，合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥；

步骤5.3：将步骤5.2中经洗涤干燥后的有机相加热至35℃～40℃减压浓缩以蒸去溶剂，并在室温条件下干燥，得到白色粉末状产物；

步骤5.4：采用高效制备薄层层析硅胶板分离步骤5.3所得白色粉末状产物，采用体积比为10∶1的氯仿-丙酮混合溶液作为展开剂，待产物展开后，采用紫外灯在254nm下检视，刮下样品分布带，分离得到产物，将分离所得产物溶于15～25ml甲醇，过滤并将所得滤液加热至35℃～40℃减压浓缩至干，得到蓝萼甲素的苯磺酰氯衍生物的无色晶体。

实施例4：

采用以下技术参数改进实施例1。

步骤1.1中采用粉碎至30目的香茶菜药材(地上部分)。

步骤1.2和步骤1.3的重结晶过程中，按照体积比1∶8混合所得粉碎物与95％乙醇，加热回流的温度为83℃，加热回流的时间为1.7小时。

重复步骤1.3的重结晶过程2次。

步骤2.1中，加热减压浓缩的温度为58℃。

步骤2.2中，按照体积比1∶9混合初级浓缩物与水，搅拌后静置的时间为8小时。

步骤2.3和2.4的重结晶过程中，按照体积比1∶4.5混合步骤2.2所得的固体与乙酸乙酯，溶解的温度为15℃，静置的时间为2.5小时。

重复步骤2.4的重结晶过程2次。

步骤2.6中，加热减压浓缩的温度为38℃。

步骤3.1中，按照体积比1∶4.5将步骤2所得固体浓缩物溶解于95％乙醇。

步骤3.2中，采用250ml的95％乙醇冲洗树脂柱。

步骤3.3中，加热减压回流的温度为58℃。

步骤4.1中，按照体积比1∶4.5混合残留物与33℃的极性溶剂，所述极性溶剂为体积比1∶1.5的氯仿-丙酮混合溶液，所述加热减压浓缩的温度为33℃，静置析晶的温度为-18℃。

步骤4.2中，按照体积比1∶4.5混合所得晶体与33℃的极性溶剂，所述极性溶剂为体积比1∶2的氯仿-丙酮混合溶液，所述加热减压浓缩的温度为33℃，静置析晶的温度为-18℃，静置析晶的时间为16小时。

重复步骤4.2的重结晶过程2次。

通过上述步骤制备得到蓝萼甲素。

实施例5：

采用以下技术参数改进实施例1。

步骤1.1中采用粉碎至40目的香茶菜药材(地上部分)。

步骤1.2和步骤1.3的重结晶过程中，按照体积比1∶12混合所得粉碎物与95％乙醇，加热回流的温度为87℃，加热回流的时间为1.3小时。

重复步骤1.3的重结晶过程2次。

步骤2.1中，加热减压浓缩的温度为62℃。

步骤2.2中，按照体积比1∶9混合初级浓缩物与水，搅拌后静置的时间为10小时。

步骤2.3和2.4的重结晶过程中，按照体积比1∶5.5混合步骤2.2所得的固体与乙酸乙酯，溶解的温度为25℃，静置的时间为1.5小时。

重复步骤2.4的重结晶过程2次。

步骤2.6中，加热减压浓缩的温度为42℃。

步骤3.1中，按照体积比1∶5.5将步骤2所得固体浓缩物溶解于95％乙醇。

步骤3.2中，采用350ml的95％乙醇冲洗树脂柱。

步骤3.3中，加热减压回流的温度为62℃。

步骤4.1中，按照体积比1∶5.5混合残留物与37℃的极性溶剂，所述极性溶剂为体积比1∶1.5的氯仿-丙酮混合溶液，所述加热减压浓缩的温度为37℃，静置析晶的温度为-18℃。

步骤4.2中，按照体积比1∶5.5混合所得晶体与37℃的极性溶剂，所述极性溶剂为体积比1∶3的氯仿-丙酮混合溶液，所述加热减压浓缩的温度为37℃，静置析晶的温度为-18℃，静置析晶的时间为20小时。

重复步骤4.2的重结晶过程2次。

通过上述步骤制备得到蓝萼甲素。

实施例6：

采用以下技术参数改进实施例2。

步骤5.1中，各物质用量为，蓝萼甲素91mg、二氯甲烷3.5ml、苯甲酰氯42.5mg、41.6mg三乙胺、DMAP3.2mg。

步骤5.2中，采用6ml水稀释，采用6ml二氯甲烷萃取4次。

步骤5.3中，减压浓缩的温度为36℃，室温干燥可采用干燥器进行干燥。

步骤5.4中，采用16ml甲醇溶解分离所得产物，减压浓缩的温度为36℃。

实施例7：

采用以下技术参数改进实施例2。

步骤5.1中，各物质用量为，蓝萼甲素93mg、二氯甲烷4.5ml、苯甲酰氯44.5mg、43.6mg三乙胺、DMAP3.4mg。

步骤5.2中，采用8ml水稀释，采用8ml二氯甲烷萃取3次。

步骤5.3中，减压浓缩的温度为37℃，室温干燥可采用干燥器进行干燥。

步骤5.4中，采用18ml甲醇溶解分离所得产物，减压浓缩的温度为37℃。

实施例8：

采用以下技术参数改进实施例2。

步骤5.1中，各物质用量为，蓝萼甲素95mg、二氯甲烷5ml、苯甲酰氯46.5mg、45.6mg三乙胺、DMAP3.6mg。

步骤5.2中，采用10ml水稀释，采用10ml二氯甲烷萃取3次。

步骤5.3中，减压浓缩的温度为37.5℃，室温干燥可采用干燥器进行干燥。

步骤5.4中，采用20ml甲醇溶解分离所得产物，减压浓缩的温度为37.5℃。

实施例9：

采用以下技术参数改进实施例2。

步骤5.1中，各物质用量为，蓝萼甲素97mg、二氯甲烷5.5ml、苯甲酰氯48.5mg、47.6mg三乙胺、DMAP3.8mg。

步骤5.2中，采用12ml水稀释，采用12ml二氯甲烷萃取3次。

步骤5.3中，减压浓缩的温度为38℃，室温干燥可采用干燥器进行干燥。

步骤5.4中，采用22ml甲醇溶解分离所得产物，减压浓缩的温度为38℃。

实施例10：

采用以下技术参数改进实施例2。

步骤5.1中，各物质用量为，蓝萼甲素99mg、二氯甲烷6.5ml、苯甲酰氯40.5mg、49.6mg三乙胺、DMAP4.0mg。

步骤5.2中，采用14ml水稀释，采用14ml二氯甲烷萃取2次。

步骤5.3中，减压浓缩的温度为39℃，室温干燥可采用干燥器进行干燥。

步骤5.4中，采用24ml甲醇溶解分离所得产物，减压浓缩的温度为39℃。

实施例11：

采用以下技术参数改进实施例3。

步骤5.1中，各物质用量为，蓝萼甲素91mg、二氯甲烷3.5ml、苯磺酰氯110.8mg、三乙胺87.3mg、DMAP6.6mg。

步骤5.2中，采用6ml水稀释，采用6ml二氯甲烷萃取4次。

步骤5.3中，减压浓缩的温度为36℃，室温干燥可采用干燥器进行干燥。

步骤5.4中，采用16ml甲醇溶解分离所得产物，减压浓缩的温度为36℃。

实施例12：

采用以下技术参数改进实施例3。

步骤5.1中，各物质用量为，蓝萼甲素93mg、二氯甲烷4.5ml、苯磺酰氯113.8mg、三乙胺89.3mg、DMAP6.9mg。

步骤5.2中，采用8ml水稀释，采用8ml二氯甲烷萃取3次。

步骤5.3中，减压浓缩的温度为37℃，室温干燥可采用干燥器进行干燥。

步骤5.4中，采用18ml甲醇溶解分离所得产物，减压浓缩的温度为37℃。

实施例13：

采用以下技术参数改进实施例3。

步骤5.1中，各物质用量为，蓝萼甲素95mg、二氯甲烷5ml、苯磺酰氯116.8mg、三乙胺91.3mg、DMAP7.2mg。

步骤5.2中，采用10ml水稀释，采用10ml二氯甲烷萃取3次。

步骤5.3中，减压浓缩的温度为37.5℃，室温干燥可采用干燥器进行干燥。

步骤5.4中，采用20ml甲醇溶解分离所得产物，减压浓缩的温度为37.5℃。

实施例14：

采用以下技术参数改进实施例3。

步骤5.1中，各物质用量为，蓝萼甲素97mg、二氯甲烷5.5ml、苯磺酰氯119.8mg、三乙胺93.3mg、DMAP7.5mg。

步骤5.2中，采用12ml水稀释，采用12ml二氯甲烷萃取3次。

步骤5.3中，减压浓缩的温度为38℃，室温干燥可采用干燥器进行干燥。

步骤5.4中，采用22ml甲醇溶解分离所得产物，减压浓缩的温度为38℃。

实施例15：

采用以下技术参数改进实施例3。

步骤5.1中，各物质用量为，蓝萼甲素99mg、二氯甲烷6.5ml、苯磺酰氯122.8mg、三乙胺95.3mg、DMAP7.8mg。

步骤5.2中，采用14ml水稀释，采用14ml二氯甲烷萃取2次。

步骤5.3中，减压浓缩的温度为39℃，室温干燥可采用干燥器进行干燥。

步骤5.4中，采用24ml甲醇溶解分离所得产物，减压浓缩的温度为39℃。

实施例16：

根据实施例4～5制备得到蓝萼甲素，并将所得蓝萼甲素按照实施例6～10进行衍生化，特别是根据实施例4和实施例8，制备得到蓝萼甲素与苯甲酰氯的衍生物。

采用高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-质谱联用(LC-MS)检测上述蓝萼甲素与苯甲酰氯的衍生物结构，所得HPLC谱图和LC-MS谱图分别如图2a和图2b所示。经HPLC和LC-MS检测表明，上述蓝萼甲素与苯甲酰氯的衍生物结构如下。

实施例17：

根据实施例4～5制备得到蓝萼甲素，并将所得蓝萼甲素按照实施例11～15进行衍生化，特别是根据实施例4和实施例13，制备得到蓝萼甲素与苯磺酰氯的衍生物。

采用高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-质谱联用(LC-MS)检测上述蓝萼甲素与苯磺酰氯的衍生物结构，所得HPLC谱图和LC-MS谱图分别如图4a和图4b所示。经HPLC和LC-MS检测表明，上述蓝萼甲素与苯磺酰氯的衍生物结构如下。

实施例18：酰氯化蓝萼甲素衍生物制剂的制备

按照上述实施例制备得到具有实施例16的分子式结构的蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物，或按照上述实施例制备具有实施例17的分子式结构的蓝萼甲素的苯磺酰氯衍生物。

将所得酰氯化的蓝萼甲素，采用药剂学上的常规药物载体，并采用药剂学上的常规制备方法，制备成药剂学上的常规剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、软胶剂、喷雾剂、凝胶剂、凝胶吸入剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、脂质体注射剂、靶向给药注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。

实施例19：酰氯化蓝萼甲素衍生物针对胃癌AGS细胞生长抑制作用的药效学实验

1、样品配制：

取按照上述实施例制备得到的蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物、蓝萼甲素的苯磺酰氯衍生物，分别加入相应体积的二甲基亚砜(DMSO)溶解，得到浓度为约50mg/ml的药物溶液，随后震荡溶解，所得药物溶液可在-20℃条件下储存

2、细胞株：

胃癌AGS细胞

3、实验方法：

将胃癌AGS细胞培养于含10％胎牛血清(FBS)的F-12培养基中。取对数生长期的胃癌AGS细胞，按常规消化后进行细胞计数。细胞计数后调整细胞浓度为1×10⁴并接种于96孔细胞培养板上，置于培养箱中培养24小时后加药。24小时后对照组换培养液，实验组加入不同浓度的受试物，于48小时后应用MTT法(MTT比色法、噻唑蓝法)比色检测细胞活力。每孔中加入浓度为5mg/ml的MTT(噻唑蓝)20μl，培养4小时后吸去培养液，加DMSO150μl，摇床振荡使蓝紫色沉淀颗粒完全溶解，在酶标仪上490nm处测吸光度(A)值。

4、实验结果：

酰氯化蓝萼甲素衍生物对人胃癌AGS细胞增殖的影响如下表所示

组别	浓度	A值(490nm)	抑制率(％)
				空白对照	-	0.4420+0.0355
GLA	1μmol/ml	0.0310+0.0208＊＊△△	92.99
					0.1μmol/ml	0.0380+0.0193＊＊△△	91.40
	0.01μmol/ml	0.0837+0.0190＊＊△△	81.07
				GLA-PHOCL	1μmol/ml	0.0853+0.0208＊＊△△	82.14
	0.1μmol/ml	0.0920+0.0347＊＊△△	80.93
					0.01μmol/ml	0.197+0.0041＊＊△△	73.25
GLA-PHSO	1μmol/ml	0.099+0.0209＊＊△△	79.12
					0.1μmol/ml	0.102+0.0932＊＊△△	77.14
	0.01μmol/ml	0.206+0.0112＊＊△△	72.48
				DMSO对照	1μl/ml	0.3723+0.0492	15.76

	0.1μl/ml	0.4417+0.0318	0.08
					0.01l/ml	0.4070+0.0288	7.92

注：^＊表示与空白对照组比较，P＜0.05；

    ^＊＊表示与空白对照组比较，P＜0.01；

    △表示与相同浓度的DMSO对照组比较，P＜0.05；

    △△表示与相同浓度的DMSO对照组比较，P＜0.01；

    GLA-PHOCL表示蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物；

    GLA-PHSO表示蓝萼甲素的苯磺酰氯衍生物。

结果表明，酰氯化蓝萼甲素(蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物、蓝萼甲素的苯磺酰氯衍生物)能明显抑制人胃癌AGS胃癌细胞的增殖，此作用与助溶剂DMSO无关。

实施例20：酰氯化蓝萼甲素衍生物针对SMMC-7721人肝癌细胞、MCF-7乳腺癌肿瘤细胞、Eca-109人食管癌肿瘤细胞、A-549肺癌肿瘤细胞、宫颈癌HeLa肿瘤细胞、人结肠癌SW480肿瘤细胞的生长抑制作用的药效学实验

1、药物与试剂：

受试样品，F-12培养基，10％灭活胎牛血清(FBS)，二甲基亚砜，噻唑盐，阿霉素(阳性药)

2、仪器：

培养箱，超静工作台，多功能倒置显微镜，离心机，自动酶标仪，96孔培养板

3、细胞株：

SMMC-7721人肝癌细胞、MCF-7乳腺癌肿瘤细胞、Eca-109人食管癌肿瘤细胞、A-549肺癌肿瘤细胞、宫颈癌HeLa肿瘤细胞、人结肠癌SW480肿瘤细胞

4、样品配制：

取按照上述实施例制备得到的蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物、蓝萼甲素的苯磺酰氯衍生物，分别加入相应体积的二甲基亚砜(DMSO)溶解，得到浓度为约50mg/ml的药物溶液，随后震荡溶解，所得药物溶液可在-20℃条件下储存

5、实验方法：

将上述肿瘤细胞培养于含10％FBS的F-12培养基中。取对数生长期的上述肿瘤细胞，按常规消化后进行细胞计数。细胞计数后调整细胞浓度为1×10⁴并接种于96孔细胞培养板上，置于培养箱中培养24小时后加药。24小时后对照组换培养液，实验组加入不同浓度的受试物，于48小时后应用MTT法(MTT比色法、噻唑蓝法)比色检测细胞活力。每孔中加入浓度为5mg/ml的MTT(噻唑蓝)20μl，培养4小时后吸去培养液，加DMSO150μl，摇床振荡使蓝紫色沉淀颗粒完全溶解，在酶标仪上490nm处测吸光度(A)值。

6、实验结果：

酰氯化蓝萼甲素衍生物对SMMC-7721人肝癌细胞、MCF-7乳腺癌肿瘤细胞、Eca-109人食管癌肿瘤细胞、A-549肺癌肿瘤细胞、宫颈癌HeLa肿瘤细胞、人结肠癌SW480肿瘤细胞增殖的影响如下表所示

注：GLA-PHOCL表示蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物；

    GLA-PHSO表示蓝萼甲素的苯磺酰氯衍生物。

结果表明，酰氯化蓝萼甲素(蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物、蓝萼甲素的苯磺酰氯衍生物)能明显抑制SMMC-7721人肝癌细胞、MCF-7乳腺癌肿瘤细胞、Eca-109人食管癌肿瘤细胞、A-549肺癌肿瘤细胞、宫颈癌HeLa肿瘤细胞、人结肠癌SW480肿瘤细胞的生长，此作用与助溶剂DMSO无关。

实施例21：酰氯化蓝萼甲素衍生物制剂的应用

根据实施例19～20，按照上述实施例制备得到具有实施例16的分子式结构的蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物，或按照上述实施例制备具有实施例17的分子式结构的蓝萼甲素的苯磺酰氯衍生物，用于癌症的治疗，特别是在治疗胃癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、宫颈癌、人结肠癌中的应用。

上述内容为本发明的具体实施例的例举，对于其中未详尽描述的试剂、设备、操作方法等，应当理解为采取本领域已有的普通及常规试剂、设备、操作方法等来予以实施。

同时本发明上述实施例仅为说明本发明技术方案之用，仅为本发明技术方案的列举，并不用于限制本发明的技术方案及其保护范围。采用等同技术手段、等同试剂等对本发明权利要求书及说明书所公开的技术方案的改进应当认为是没有超出本发明权利要求书及说明书所公开的范围。

Claims (10)

1.一种酰氯化蓝萼甲素衍生物，其特征在于，是一种贝壳杉烷型四环二萜类物质，具有贝壳杉烷型结构、羰基、羟基和酰氯结构，其分子结构的通式如下：

其中，R1为苯甲酰氯取代基-C7H6O2、苯磺酰氯取代基-C6H6O3S2或-OH，R2为苯甲酰氯取代基-C7H6O2、苯磺酰氯取代基-C6H6O3S2或-OH，R1和R2中至少有一个为-OH。

2.如权利要求1所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物，其特征在于，所述R1为-C7H6O2，所述R2为-OH，其分子结构如下：

3.如权利要求1所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物，其特征在于，所述R1为-OH，所述R2为-C7H6O2，其分子结构如下：

4.如权利要求1所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物，其特征在于，所述R1为-C6H6O3S2，所述R2为-OH，其分子结构如下：

5.如权利要求1所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物，其特征在于，所述R1为-OH，所述R2为-C6H6O3S2，其分子结构如下：

6.一种如权利要求1所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

步骤1：提取

步骤1.1：取香茶菜药材(地上部分)粉碎至20目～50目；

步骤1.2：将所得的粉碎物与95％乙醇按照体积比1∶5～1∶15混合，加热，在80℃～90℃温度条件下回流1～2小时，提取、过滤，得到提取液和剩余物；

步骤1.3：将步骤1.2所得的剩余物与95％乙醇按照体积比1∶5～1∶15混合，加热，在80℃～90℃温度条件下回流1～2小时，提取、过滤，得到提取液和剩余物，重复该步骤1～3次；

步骤1.4：合并步骤1.2和1.3所得的提取液；

步骤2：溶剂处理

步骤2.1：将步骤1所得的提取液加热，在55℃～65℃温度条件下加热减压浓缩，回收乙醇并得到粘稠的初级浓缩物；

步骤2.2：将步骤2.1所得的初级浓缩物与水按照体积比1∶8～1∶10混合，在室温条件下以60～120转/分的速度搅拌10分钟，随后静置6～12小时，弃去上清液得到下层固体；

步骤2.3：将步骤2.2所得的固体与乙酸乙酯按照体积比1∶4～1∶6混合，在25℃～35℃温度条件下以60～120转/分的速度搅拌溶解，静置1～3小时，过滤得到滤液和不溶物；

步骤2.4：将步骤2.3所得的不溶物与乙酸乙酯按照体积比1∶4～1∶6混合，在25℃～35℃温度条件下以60～120转/分的速度搅拌溶解，静置1～3小时，过滤得到滤液和不溶物，重复该步骤1～3次；

步骤2.5：合并步骤2.3和2.4所得的滤液；

步骤2.6：将步骤2.5所得的滤液加热，在35℃～45℃温度条件下加热减压浓缩，回收乙酸乙酯，得到固体浓缩物；

步骤3：树脂处理

步骤3.1：将步骤2所得的固体浓缩物与95％乙醇按照体积比1∶4～1∶6混合溶解，得到溶液；

步骤3.2：将步骤3.1所得的溶液缓慢加到7号树脂柱中，起观察树脂的颜色，在树脂柱有2/3变色时，停止加样，并采用200ml～400ml的95％乙醇冲洗该树脂柱，收集所有流出液，所述树脂柱的填充物为强碱性阴离子树脂并用氢氧化钠饱和至pH值中性；

步骤3.3：将步骤3.2所得流出液加热，并在55℃～65℃温度条件下加热减压回流，直至溶剂干，得到固体残留物；

步骤4：重结晶

步骤4.1：将上述残留物与30℃～40℃的极性溶剂按照体积比1∶4～1∶6混合，得到初级溶液，加热，在30℃的～40℃温度条件下减压浓缩，在-23℃～-13℃温度条件下静置析晶，过滤得到浅黄色针状结晶；

所述极性溶剂为按照体积比1∶1～1∶2混合的氯仿和丙酮的混合溶液；

步骤4.2：将步骤4.1所得的结晶与极性溶剂按照体积比1∶4～1∶6混合，在-23℃～-13℃温度条件下反复重结晶2～4次，每次12～24小时，得到中间产物蓝萼甲素；

所述极性溶剂为按照体积比1∶1～1∶4混合的氯仿和丙酮的混合溶液；

步骤5：衍生化

将所得中间产物溶于二氯甲烷溶液，在冰水浴条件下，加入苯甲酰氯或苯磺酰氯溶液、三乙胺和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，室温搅拌，采用二氯甲烷萃取，合并有机相，蒸去溶剂并干燥，得到酰氯化蓝萼甲素衍生物。

7.如权利要求6所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤5进一步包含以下步骤：

步骤5.1：将90～110mg步骤4所得蓝萼甲素溶于3～7ml二氯甲烷中，并在0℃～5℃的冰水浴条件下，缓慢依次加入41.5～51.5mg苯甲酰氯、40.6～50.6mg三乙胺和3.1～4.1mgDMAP，在室温条件下搅拌反应12小时；

步骤5.2：向步骤5.1的反应溶液中加入5～15ml水稀释，随后采用5～15ml二氯甲烷萃取2～4次，合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥；

步骤5.3：将步骤5.2中经洗涤干燥后的有机相加热至35℃～40℃减压浓缩以蒸去溶剂，并在室温条件下干燥，得到白色粉末状产物；

步骤5.4：采用高效制备薄层层析硅胶板分离步骤5.3所得白色粉末状产物，将分离所得产物溶于15～25ml甲醇，过滤并将所得滤液加热至35℃～40℃减压浓缩至干，得到蓝萼甲素的苯甲酰氯衍生物的无色晶体。

8.如权利要求6所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤5进一步包含以下步骤：

步骤5.1：将90～110mg步骤4所得蓝萼甲素溶于3～7ml二氯甲烷中，并在0℃～5℃的冰水浴条件下，缓慢依次加入106.8～126.8mg苯磺酰氯、86.3～96.3mg三乙胺和6.2～8.2mgDMAP，在室温条件下搅拌反应12小时；

步骤5.2：向步骤5.1的反应溶液中加入5～15ml水稀释，随后采用5～15ml二氯甲烷萃取2～4次，合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥；

步骤5.3：将步骤5.2中经洗涤干燥后的有机相加热至35℃～40℃减压浓缩以蒸去溶剂，并在室温条件下干燥，得到白色粉末状产物；

步骤5.4：采用高效制备薄层层析硅胶板分离步骤5.3所得白色粉末状产物，将分离所得产物溶于15～25ml甲醇，过滤并将所得滤液加热至35℃～40℃减压浓缩至干，得到蓝萼甲素的苯磺酰氯衍生物的无色晶体。

9.如权利要求1～5所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物在治疗癌症中的应用。

10.如权利要求1～5所述的酰氯化蓝萼甲素衍生物在治疗胃癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、宫颈癌、人结肠癌中的应用。

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