CN101993370A - 蓝萼甲素酸酯衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蓝萼甲素酸酯衍生物的结构、制备方法及其在治疗癌症中的应用。所述蓝萼甲素酸酯衍生物的分子结构的通式如下：
Description
技术领域
本发明涉及蓝萼甲素(GLA)衍生物，特别涉及蓝萼甲素酸酯衍生物。本发明还涉及所述蓝萼甲素酸酯衍生物的制备方法及其在治疗癌症中的应用。
背景技术
唇形科香茶菜属植物。在亚洲东部和非洲西部广为分布，全世界约有150种，我国约有90种25个变种。其中约有30种民间作为药用，作为清热解毒、抗癌消炎、健脾、活血、杭菌药来使用。人们对该属植物的-菇类成分作了研究，已从中提取了百余种药类成分。经药理筛选发现许多二萜化合物具有细胞毒、抗肿瘤、杭炎活性作用。
蓝萼香茶菜是唇形科香茶菜属植物，分布在我国的东北、华北，朝鲜.日本，原苏联远东地区，吉林省资源尤其丰富。蓝萼香茶菜具有健胃、清热解毒、活血、抗菌消炎和抗癌活性，用于胃炎、肝炎初起、感冒发热、乳腺炎、关节痛等疾病。现代研究发现全草对心血管有一定的作用，而其中的有效成分对血小板聚集及癌症有一定的影响。
1981年许云龙等人从蓝萼香茶菜中提取出蓝萼甲素(glaucocalyxinA)和蓝萼乙素(glaucocalyxinB)，从光谱中推断蓝萼甲素具有香茶菜属二萜典型的巧一氧-16一贝壳杉烯(ent-15-oxo-16-kaurene)骨架，而蓝萼乙素是蓝萼甲素的14一乙酰化物，把两者分别乙酰化，得到相同的乙酰化物，从而证实了两者的相互关系。随后赵全成也从吉林产蓝萼香茶菜中分得这两种二萜。
1988年刘晨江等从北京地区产蓝萼香茶菜中分得甲素和乙素外，还分得蓝萼丙素(glaucocalyxinC)，结构为对映-7p，14a，15a-三羟基-16-贝壳杉-3-酮。Dongsa kimls，除了从中分出蓝萼甲素、蓝萼乙素和蓝萼丙素，还分出了两种新二萜glaucocalyxinD和glaucocalyxinE并列出了这五种化合物的结构红外紫外吸收值、最主要的1H一核磁共振、13C一核磁共振化学位移值及质谱数据值。
金永日等从蓝萼香茶菜根中分得了蓝萼甲素，另外王先荣等从安徽产王枣子(lsodonamethystoides(Benth)CyWuetHsuan)中也分得蓝萼甲素。王慧芬等人用反相高效液相色谱法外标法对不同部位及不同采集期的蓝萼香茶菜中蓝萼甲素的含量进行了测定，结果表明叶中蓝萼甲素远高于根、茎。不同采集期以7-8月份含量高，9月末含量下降。张元桐等也采用反相HPLC测定蓝萼甲素含量，测得蓝萼甲素含量为1.03％，平均回收率为99.2％。
从蓝萼甲素体内外实验结果来看，其具有较强的抗肿瘤作用，且抗瘤谱较广，能抑制Lewis肺癌、5180实体型以及HCA实体型等实体瘤的生长，明显增加荷腹水型5180腹水型和荷HCA腹水型小鼠的生命延长率，其抗肿瘤作用的强弱呈剂量依赖性。
科研人员用MTT法对从毛叶香茶菜叶中分离鉴定的14个己知对映-贝壳杉烯类二萜化合物进行了人早幼粒白血病细胞、人卵巢癌细胞和人肺癌细胞的抗癌活性研究，其中具有α-亚甲基环戊酮结构的化合物对上述3种肿瘤细胞株均表现出不同程度的抑制活性。从蓝萼香茶菜叶分离的化合物如蓝尊香茶菜甲素(GLA)和乙素(GLB)结构中具有α-亚甲基环戊酮，因而显示出较强的生物活性。
对若干天然及化学修饰后的贝克杉烯类化合物进行了系统的体外抗肿瘤活性筛选及构效关系研究表明，应用化学手段破坏分子中α-亚甲基环戊酮结构单元，会显著降低贝克杉烯类化合物的抗肿瘤活性。
由于蓝萼甲素为对映-贝壳杉烯类二萜化合物，其化合物极性小，易溶于氯仿等非极性溶剂，在水中不溶，因此不适合直接作为药物进行给药；蓝萼甲素体外具有明显的抗癌作用，但在体内需大剂量长时间用药才能产生药效。药物在体内消除很快，半衰期短，尚不能直接作为药物使用。
发明内容
鉴于蓝萼甲素(GLA)特别是其α-亚甲基环戊酮结构对肿瘤细胞株活性具有良好的抑制作用，然而由于其极性小、半衰期短等特点，其不适于直接作为药物进行给药，故现在需要以蓝萼甲素(GLA)为先导化合物，通过对先导化合物的结构改造，来获得蓝萼甲素的衍生物，从而使其按照已知的代谢途径失活或不代谢，而由原形排出体外，从而提高药物的安全性，增加药效。
本发明的目的之一在于提供具有对肿瘤细胞株良好的抑制作用的、结构改良的蓝萼甲素酸酯衍生物，从而解决GLA极性小、不易溶于水、半衰期短、在体内消除过快等缺陷，从而作为治疗癌症的药物使用。
本发明的目的之二在于提供所述蓝萼甲素酸酯衍生物的制备方法，避免单纯的采用有机合成所带来的毒副作用较大的缺陷，并且避免单纯的采用原料提纯多带来的药效较低、无法针对性治疗某一特定癌症的缺陷。
本发明所公开的蓝萼甲素酸酯衍生物是一种贝壳杉烷型四环二萜类物质，具有贝壳杉烷型结构、羰基和羟基，是蓝萼甲素与羧酸的酯化物，其分子结构的通式如下：
其中，R1为丁二酸取代基-C4H5O4、戊二酸取代基-C5H7O4、丁二酸的甘氨酸衍生物取代基-C6H8NO5、戊二酸的甘氨酸衍生物取代基-C7H10NO5或-OH，R2为丁二酸取代基-C4H5O4、戊二酸取代基-C5H7O4、丁二酸的甘氨酸衍生物取代基-C6H8NO5、戊二酸的甘氨酸衍生物取代基-C7H10NO5或-OH。
故，在较佳的优选实施例中，所述R1和R2中至少有一个为-OH。
在一个优选实施例中，所述R1为-C4H5O4、所述R2为-OH，或者所述R1为-OH、所述R2为-C4H5O4，其分子结构分别如下：
在一个优选实施例中，所述R1为-C5H7O4、所述R2为-OH，或者所述R1为-OH、所述R2为-C5H7O4，所述衍生物分子结构如下。
在一个优选实施例中，所述R1为-C6H8NO5、所述R2为-OH，或者所述R1为-OH、所述R2为-C6H8NO5，所述衍生物分子结构如下：
在一个优选实施例中，所述R1为-C7H10NO5、所述R2为-OH，或者所述R1为-OH、所述R2为-C7H10NO5，所述衍生物分子结构如下：
上述蓝萼甲素酸酯衍生物由于具有GLA的α-亚甲基环戊酮结构，故其对肿瘤细胞株活性具有良好的抑制作用，另一方面，上述多肽类GLA进行了结构修饰，解决了极性小、半衰期短等缺陷特点，适于作为治疗癌症的药物使用。
上述蓝萼甲素酸酯衍生物是按照以下方法进行制备的，其包含用于制备作为先导化合物的蓝萼甲素的步骤1～4以及用于结构修饰蓝萼甲素进行衍生化的步骤5、步骤6。
所述步骤1为提取步骤，具体包括以下步骤：
步骤1.1：取香茶菜药材(地上部分)粉碎至20目～50目；
步骤1.2：将所得的粉碎物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶5～1∶15混合，加热，在80℃～90℃温度条件下回流1～2小时，提取、过滤，得到提取液和剩余物；
步骤1.3：将步骤1.2所得的剩余物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶5～1∶15混合，加热，在80℃～90℃温度条件下回流1～2小时，提取、过滤，得到提取液和剩余物，重复该步骤1～3次；
步骤1.4：合并步骤1.2和1.3所得的提取液。
所述步骤2为溶剂处理步骤，具体包括以下步骤：
步骤2.1：将步骤1所得的提取液加热，在55℃～65℃温度条件下加热减压浓缩，回收乙醇并得到粘稠的初级浓缩物；
步骤2.2：将步骤2.1所得的初级浓缩物与水按照体积比1∶8～1∶10混合，在室温条件下以60～120转/分的速度搅拌10分钟，随后静置6～12小时，弃去上清液得到下层固体；
步骤2.3：将步骤2.2所得的固体与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶4～1∶6混合，在25℃～35℃温度条件下以60～120转/分的速度搅拌溶解，静置1～3小时，过滤得到滤液和不溶物；
步骤2.4：将步骤2.3所得的不溶物与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶4～1∶6混合，在25℃～35℃温度条件下以60～120转/分的速度搅拌溶解，静置1～3小时，过滤得到滤液和不溶物，重复该步骤1～3次；
步骤2.5：合并步骤2.3和2.4所得的滤液；
步骤2.6：将步骤2.5所得的滤液加热，在35℃～45℃温度条件下加热减压浓缩，回收乙酸乙酯(A.R.)，得到固体浓缩物。
所述步骤3为树脂处理步骤，具体包括以下步骤：
步骤3.1：将步骤2所得的固体浓缩物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶4～1∶6混合溶解，得到溶液；
步骤3.2：将步骤3.1所得的溶液缓慢加到7号树脂柱中，起观察树脂的颜色，在树脂柱有2/3变色时，停止加样，并采用200ml～400ml的95％乙醇(A.R.)冲洗该树脂柱，收集所有流出液，所述树脂柱的填充物为强碱性阴离子树脂并用氢氧化钠饱和至pH值中性；
步骤3.3：将步骤3.2所得流出液加热，并在55℃～65℃温度条件下加热减压回流，直至溶剂干，得到固体残留物。
所述步骤4为重结晶步骤，具体包括以下步骤：
步骤4.1：将上述残留物与30℃～40℃的极性溶剂按照体积比1∶4～1∶6混合，得到初级溶液，加热，在30℃的～40℃温度条件下减压浓缩，在-23℃～-13℃温度条件下静置析晶，过滤得到浅黄色针状结晶；
所述极性溶剂为按照体积比1∶1～1∶2混合的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液；
步骤4.2：将步骤4.1所得的结晶与极性溶剂按照体积比1∶4～1∶6混合，在-23℃～-13℃温度条件下反复重结晶2～4次，每次12～24小时，得到中间产物蓝萼甲素；
所述极性溶剂为按照体积比1∶1～1∶4混合的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液。
对上述步骤所制备得到的蓝萼甲素可以采用步骤5进行衍生化，或者采用步骤5和步骤6进行衍生化。
所述步骤5为衍生化步骤，具体包括以下步骤：
步骤5.1：将步骤4所得蓝萼甲素溶于四氢呋喃(THF)中，并在室温条件下，依次加入丁二酸或戊二酸、4-二甲氨基吡啶(DMAP)，在室温条件下搅拌反应10～14小时；
步骤5.2：将步骤5.1的反应溶液加热至40℃～50℃并减压蒸馏，除去四氢呋喃；
步骤5.3：向步骤5.2的反应溶液中加入水稀释，随后采用乙酸乙酯萃取2～4次，合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥；
步骤5.4：将步骤5.3中经洗涤干燥后的有机相加热至40℃～50℃并减压蒸馏，出去溶剂，随后在室温条件下干燥，得到淡黄色油状粗产物；
步骤5.5：采用硅胶柱层析分离步骤5.4所得淡黄色油状粗产物，随后将所得馏分加热至30℃～40℃减压浓缩蒸去溶剂，得到蓝萼甲素的丁二酸酯或戊二酸酯的无色晶体；
所述层析分离过程中，采用体积比为9∶1～11∶1的氯仿丙酮混合溶液作为洗脱液。
所述步骤6为衍生化步骤，具体包括以下步骤：
步骤6.1：将蓝萼甲素的丁二酸酯或戊二酸酯溶于THF，将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于3～7ml磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲溶液)；
所述PBS缓冲液为0.2μmol/L且其pH＝8.0；
步骤6.2：在室温条件下，将所得NHS的PBS溶液滴加到蓝萼甲素的丁二酸酯或戊二酸酯的THF溶液中，室温搅拌10～20分钟，随后将所得反应溶液加热至30℃～40℃减压蒸馏，除去THF，得到黄色油状粗产物；
步骤6.3：采用ODS-C18填料反相中压柱分离步骤6.3的粗产物，得到中间产物，即蓝萼甲素的丁二酸酯或戊二酸酯与N-羟基琥珀酰亚胺的衍生物；
步骤6.4：将所得中间产物溶于0.5～1.5mlTHF，将甘氨酸溶于4～6mlPBS缓冲液；
步骤6.5：在室温条件下，将所得中间产物的THF溶液滴加到甘氨酸的PBS溶液中，室温搅拌反应10～20分钟，随后将所得反应溶液在30℃～40℃条件下减压蒸馏，除去THF，得到溶液；
步骤6.6：将所得溶液在-45℃～-35℃条件下冷冻干燥20～28小时得到白色粉末状的蓝萼甲素的丁二酸酯或戊二酸酯与甘氨酸的衍生物。
经上述制备过程所得的蓝萼甲素酸酯衍生物，由于具有α-亚甲基环戊酮结构，故其对肿瘤细胞株具有良好的抑制作用，可用于治疗癌症，特别用于治疗肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、鼻咽癌、宫颈癌、结肠癌。
本发明同时公开了所述蓝萼甲素酸酯衍生物在治疗癌症中的应用，特别是在治疗肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、鼻咽癌、宫颈癌、结肠癌中的应用。
本发明所公开的前述任一结构的蓝萼甲素酸酯衍生物可以采用药剂学上的常规药物载体制成任何一种剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、软胶剂、喷雾剂、凝胶剂、凝胶吸入剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、脂质体注射剂、靶向给药注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。
附图说明
图1为蓝萼甲素与丁二酸的反应方程式。
图2a为图1所示反应所得蓝萼甲素的丁二酸酯的HPLC图。
图2b为图1所示反应所得蓝萼甲素的丁二酸酯的质谱图。
图3a为蓝萼甲素的丁二酸酯与N-羟基琥珀酰亚胺的反应方程式。
图3b为蓝萼甲素的丁二酸酯与N-羟基琥珀酰亚胺的衍生物与甘氨酸的反应方程式。
图4a为图3a～3b所示反应所得蓝萼甲素的丁二酸酯与甘氨酸的衍生物的HPLC图。
图4b为图3a～3b所示反应所得蓝萼甲素的丁二酸酯与甘氨酸的衍生物的质谱图。
图5为蓝萼甲素与戊二酸的反应方程式。
图6a为图5所示反应所得蓝萼甲素的戊二酸酯的HPLC图。
图6b为图5所示反应所得蓝萼甲素的戊二酸酯的质谱图。
图7a为蓝萼甲素的戊二酸酯与N-羟基琥珀酰亚胺的反应方程式。
图7b为蓝萼甲素的戊二酸酯与N-羟基琥珀酰亚胺的衍生物与甘氨酸的反应方程式。
图8为图7a～7b所示反应所得蓝萼甲素的戊二酸酯与甘氨酸的衍生物的HPLC图。
具体实施方式
根据本发明的权利要求和发明内容所公开的内容，本发明的技术方案具体如以下实施例所述。
本发明所公开的制备方式是在THF和DMAP存在的条件下，将经提取处理后的蓝萼甲素与丁二酸或戊二酸反应，得到本发明所公开的GLA的丁二酸酯或GLA的戊二酸酯，随后在THF和PBS缓冲液的条件下，将所得GLA的酸酯衍生物依次与NHS、甘氨酸反应，得到本发明所公开的GLA的酸酯与甘氨酸的衍生物，该制备过程主要包括蓝萼甲素的制备以及取代基的衍生化。以下实施例所述制备过程，所采用的各种化学试剂如无特别标注，则为分析纯。
实施例1：蓝萼甲素的制备
采用香茶菜药材(地上部分)作为原料，通过提取、溶剂处理、树脂处理和重结晶等步骤，制备得到蓝萼甲素(GLA)，其具体过程如下：
步骤1为提取步骤，其进一步包括：
步骤1.1：取香茶菜药材(地上部分)粉碎至20目～50目；
步骤1.2：将所得的粉碎物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶5～1∶15混合，加热，在80℃～90℃温度条件下回流1～2小时，提取、过滤，得到提取液和剩余物；
步骤1.3：将步骤1.2所得的剩余物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶5～1∶15混合，加热，在80℃～90℃温度条件下回流1～2小时，提取、过滤，得到提取液和剩余物，重复该步骤1～3次；
步骤1.4：合并步骤1.2和1.3所得的提取液。
步骤2为溶剂处理步骤，其进一步包括：
步骤2.1：将步骤1所得的提取液加热，在55℃～65℃温度条件下加热减压浓缩，回收乙醇并得到粘稠的初级浓缩物；
步骤2.2：将步骤2.1所得的初级浓缩物与水按照体积比1∶8～1∶10混合，在室温条件下以60～120转/分的速度搅拌10分钟，随后静置6～12小时，弃去上清液得到下层固体；
步骤2.3：将步骤2.2所得的固体与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶4～1∶6混合，在25℃～35℃温度条件下以60～120转/分的速度搅拌溶解，静置1～3小时，过滤得到滤液和不溶物；
步骤2.4：将步骤2.3所得的不溶物与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶4～1∶6混合，在25℃～35℃温度条件下以60～120转/分的速度搅拌溶解，静置1～3小时，过滤得到滤液和不溶物，重复该步骤1～3次；
步骤2.5：合并步骤2.3和2.4所得的滤液；
步骤2.6：将步骤2.5所得的滤液加热，在35℃～45℃温度条件下加热减压浓缩，回收乙酸乙酯(A.R.)，得到固体浓缩物。
步骤3为树脂处理步骤，其进一步包括：
步骤3.1：将步骤2所得的固体浓缩物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶4～1∶6混合溶解，得到溶液；
步骤3.2：将步骤3.1所得的溶液缓慢加到7号树脂柱中，起观察树脂的颜色，在树脂柱有2/3变色时，停止加样，并采用200ml～400ml的95％乙醇(A.R.)冲洗该树脂柱，收集所有流出液，所述树脂柱的填充物为强碱性阴离子树脂并用氢氧化钠饱和至pH值中性；
步骤3.3：将步骤3.2所得流出液加热，并在55℃～65℃温度条件下加热减压回流，直至溶剂干，得到固体残留物。
步骤4为重结晶步骤，其进一步包括：
步骤4.1：将上述残留物与30℃～40℃的极性溶剂按照体积比1∶4～1∶6混合，得到初级溶液，加热，在30℃的～40℃温度条件下减压浓缩，在-23℃～-13℃温度条件下静置析晶，过滤得到浅黄色针状结晶；
所述极性溶剂为按照体积比1∶1～1∶2混合的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液；
步骤4.2：将步骤4.1所得的结晶与极性溶剂按照体积比1∶4～1∶6混合，在-23℃～-13℃温度条件下反复重结晶2～4次，每次12～24小时，得到中间产物蓝萼甲素；
所述极性溶剂为按照体积比1∶1～1∶4混合的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液。
通过上述步骤制备得到蓝萼甲素。
实施例2：丁二酸衍生化
按照图1所示的反应方程式，将实施例1所制备得到的蓝萼甲素，采用丁二酸进行衍生化，从而向蓝萼甲素中引入修饰取代基，得到蓝萼甲素的丁二酸酯，所述衍生化步骤5进一步包括：
步骤5.1：将0.96～1.16g步骤4所得蓝萼甲素溶于25～35ml四氢呋喃中，并在室温条件下，依次加入0.857～1.057g丁二酸和0.067～0.087gDMAP，在室温条件下搅拌反应10～14小时；
步骤5.2：将步骤5.1的反应溶液加热至40℃～50℃并减压蒸馏，除去四氢呋喃；
步骤5.3：向步骤5.2的反应溶液中加入25～35ml水稀释，随后采用25～35ml乙酸乙酯萃取2～4次，合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥；
步骤5.4：将步骤5.3中经洗涤干燥后的有机相加热至40℃～50℃并减压蒸馏，出去溶剂，随后在室温条件下干燥，得到淡黄色油状粗产物；
步骤5.5：采用硅胶柱层析处理步骤5.4所得淡黄色油状粗产物，所述层析分离过程中，采用体积比为9∶1～11∶1的氯仿丙酮混合溶液作为洗脱液，并采用2BV(2倍柱体积)的洗脱液冲洗层析柱，然后将所得淡黄色油状粗产物用洗脱液完全溶解后加入柱子，用4BV的洗脱液冲洗层析柱，收集合并含有目标成分的馏分，随后将所得馏分加热至30℃～40℃减压浓缩蒸去溶剂，得到蓝萼甲素的丁二酸酯的无色晶体。
实施例3：甘氨酸衍生化
按照图3a～3b所示的反应方程式，将实施例2所制备得到的蓝萼甲素的丁二酸酯，采用甘氨酸进行衍生化，从而向蓝萼甲素中引入修饰取代基，得到蓝萼甲素的丁二酸酯与甘氨酸的衍生物，所述衍生化步骤6进一步包括：
步骤6.1：将113.5～133.5mg蓝萼甲素的丁二酸酯溶于1～5ml四氢呋喃(THF)，将19.3～21.3mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于3～7ml磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲溶液)；
所述PBS缓冲液为0.2μmol/L且其pH＝8.0；
步骤6.2：在室温条件下，将所得NHS的PBS溶液滴加到蓝萼甲素的丁二酸酯的THF溶液中，室温搅拌反应10～20分钟，随后将所得反应溶液加热至30℃～40℃减压蒸馏，除去THF，得到黄色油状粗产物；
步骤6.3：采用ODS-C18填料反相中压柱分离步骤6.3的粗产物，得到中间产物；
所述ODS-C18填料反相中压柱为BUCHI C-605中压制备系统，柱尺寸为20mm×300mm，填料为ODS-C-18-AQ反向填料100g；
步骤6.4：将所得中间产物溶于0.5～1.5mlTHF，将15-20mg甘氨酸溶于4～6mlPBS缓冲液；
步骤6.5：在室温条件下，将所得中间产物的THF溶液滴加到甘氨酸的PBS溶液中，室温搅拌反应10～20分钟，随后将所得反应溶液在30℃～40℃条件下减压蒸馏，除去THF，得到溶液；
步骤6.6：将所得溶液在-45℃～-35℃条件下冷冻干燥20～28小时得到白色粉末状的蓝萼甲素的丁二酸酯与甘氨酸的衍生物。
实施例4：戊二酸衍生化
按照图5所示的反应方程式，将实施例1所制备得到的蓝萼甲素，采用戊二酸进行衍生化，从而向蓝萼甲素中引入修饰取代基，得到蓝萼甲素的戊二酸酯，所述衍生化步骤5进一步包括：
步骤5.1：将0.96～1.16g步骤4所得蓝萼甲素溶于25～35ml四氢呋喃中，并在室温条件下，依次加入1.025～1.225g戊二酸和0.080～0.100gDMAP，在室温条件下搅拌反应10～14小时；
步骤5.2将步骤5.1的反应溶液加热至40℃～50℃并减压蒸馏，除去四氢呋喃；
步骤5.3：向步骤5.2的反应溶液中加入25～35ml水稀释，随后采用25～35ml乙酸乙酯萃取2～4次，合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥；
步骤5.4：将步骤5.3中经洗涤干燥后的有机相加热至40℃～50℃并减压蒸馏，出去溶剂，随后在室温条件下干燥，得到淡黄色油状粗产物；
步骤5.5：采用硅胶柱层析分离步骤5.4所得淡黄色油状粗产物，随后将所得馏分加热至30℃～40℃减压浓缩蒸去溶剂，得到蓝萼甲素的戊二酸酯的无色晶体；所述层析分离过程中，采用体积比为9∶1～11∶1的氯仿丙酮混合溶液作为洗脱液。
实施例5：甘氨酸衍生化
按照图7a～7b所示的反应方程式，将实施例4所制备得到的蓝萼甲素的戊二酸酯，采用甘氨酸进行衍生化，从而向蓝萼甲素中引入修饰取代基，得到蓝萼甲素的戊二酸酯与甘氨酸的衍生物，所述衍生化步骤6进一步包括：
步骤6.1：将130～140mg蓝萼甲素的戊二酸酯溶于1～5ml四氢呋喃(THF)，将19.3～21.3mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于3～7ml(PBS缓冲溶液)；
所述PBS缓冲液为0.2μmol/L且其pH＝8.0；
步骤6.2：在室温条件下，将所得NHS的PBS溶液滴加到蓝萼甲素的戊二酸酯的THF溶液中，室温搅拌10～20分钟，随后将所得反应溶液加热至30℃～40℃减压蒸馏，除去THF，得到黄色油状粗产物；
步骤6.3：采用ODS-C18填料反相中压柱分离步骤6.3的粗产物，得到中间产物；
所述ODS-C18填料反相中压柱为BUCHI C-605中压制备系统，柱尺寸为20mm×300mm，填料为ODS-C-18-AQ反向填料100g；
步骤6.4：将所得中间产物溶于0.5～1.5mlTHF，将15-20mg甘氨酸溶于4～6mlPBS缓冲液；
步骤6.5：在室温条件下，将所得中间产物的THF溶液滴加到甘氨酸的PBS溶液中，室温搅拌反应10～20分钟，随后将所得反应溶液在30℃～40℃条件下减压蒸馏，除去THF，得到溶液；
步骤6.6：将所得溶液在-45℃～-35℃条件下冷冻干燥20～28小时得到白色粉末状的蓝萼甲素的戊二酸酯与甘氨酸的衍生物。
实施例6：
采用以下技术参数改进实施例1。
步骤1.1中采用粉碎至30目的香茶菜药材(地上部分)。
步骤1.2和步骤1.3的重结晶过程中，按照体积比1∶8混合所得粉碎物与95％乙醇，加热回流的温度为83℃，加热回流的时间为1.7小时。
重复步骤1.3的重结晶过程2次。
步骤2.1中，加热减压浓缩的温度为58℃。
步骤2.2中，按照体积比1∶9混合初级浓缩物与水，搅拌后静置的时间为8小时。
步骤2.3和2.4的重结晶过程中，按照体积比1∶4.5混合步骤2.2所得的固体与乙酸乙酯，溶解的温度为15℃，静置的时间为2.5小时。
重复步骤2.4的重结晶过程2次。
步骤2.6中，加热减压浓缩的温度为38℃。
步骤3.1中，按照体积比1∶4.5将步骤2所得固体浓缩物溶解于95％乙醇。
步骤3.2中，采用250ml的95％乙醇冲洗树脂柱。
步骤3.3中，加热减压回流的温度为58℃。
步骤4.1中，按照体积比1∶4.5混合残留物与33℃的极性溶剂，所述极性溶剂为体积比1∶1.5的氯仿-丙酮混合溶液，所述加热减压浓缩的温度为33℃，静置析晶的温度为-18℃。
步骤4.2中，按照体积比1∶4.5混合所得晶体与33℃的极性溶剂，所述极性溶剂为体积比1∶2的氯仿-丙酮混合溶液，所述加热减压浓缩的温度为33℃，静置析晶的温度为-18℃，静置析晶的时间为16小时。
重复步骤4.2的重结晶过程2次。
通过上述步骤制备得到蓝萼甲素。
实施例7：
采用以下技术参数改进实施例1。
步骤1.1中采用粉碎至40目的香茶菜药材(地上部分)。
步骤1.2和步骤1.3的重结晶过程中，按照体积比1∶12混合所得粉碎物与95％乙醇，加热回流的温度为87℃，加热回流的时间为1.3小时。
重复步骤1.3的重结晶过程2次。
步骤2.1中，加热减压浓缩的温度为62℃。
步骤2.2中，按照体积比1∶9混合初级浓缩物与水，搅拌后静置的时间为10小时。
步骤2.3和2.4的重结晶过程中，按照体积比1∶5.5混合步骤2.2所得的固体与乙酸乙酯，溶解的温度为25℃，静置的时间为1.5小时。
重复步骤2.4的重结晶过程2次。
步骤2.6中，加热减压浓缩的温度为42℃。
步骤3.1中，按照体积比1∶5.5将步骤2所得固体浓缩物溶解于95％乙醇。
步骤3.2中，采用350ml的95％乙醇冲洗树脂柱。
步骤3.3中，加热减压回流的温度为62℃。
步骤4.1中，按照体积比1∶5.5混合残留物与37℃的极性溶剂，所述极性溶剂为体积比1∶1.5的氯仿-丙酮混合溶液，所述加热减压浓缩的温度为37℃，静置析晶的温度为-18℃。
步骤4.2中，按照体积比1∶5.5混合所得晶体与37℃的极性溶剂，所述极性溶剂为体积比1∶3的氯仿-丙酮混合溶液，所述加热减压浓缩的温度为37℃，静置析晶的温度为-18℃，静置析晶的时间为20小时。
重复步骤4.2的重结晶过程2次。
通过上述步骤制备得到蓝萼甲素。
实施例8：
采用以下技术参数改进实施例2。
步骤5.1中，各物质用量为，蓝萼甲素0.98g、四氢呋喃26ml、丁二酸0.877g、DMAP0.069g。
步骤5.2中，减压蒸馏的温度为41℃。
步骤5.3中，采用26ml水稀释，采用26ml乙酸乙酯萃取2次。
步骤5.4中，减压蒸馏的温度为41℃。
步骤5.5中，采用体积比为9∶1的氯仿丙酮混合溶液作为洗脱液，减压浓缩的温度为31℃。
实施例9：
采用以下技术参数改进实施例2。
步骤5.1中，各物质用量为，蓝萼甲素1.02g、四氢呋喃28ml、丁二酸0.917g、DMAP0.073g。
步骤5.2中，减压蒸馏的温度为43℃。
步骤5.3中，采用28ml水稀释，采用28ml乙酸乙酯萃取3次。
步骤5.4中，减压蒸馏的温度为43℃。
步骤5.5中，采用体积比为10∶1的氯仿丙酮混合溶液作为洗脱液，减压浓缩的温度为33℃。
实施例10：
采用以下技术参数改进实施例2。
步骤5.1中，各物质用量为，蓝萼甲素1.06g、四氢呋喃30ml、丁二酸0.957g、DMAP0.077g。
步骤5.2中，减压蒸馏的温度为45℃。
步骤5.3中，采用30ml水稀释，采用30ml乙酸乙酯萃取3次。
步骤5.4中，减压蒸馏的温度为45℃。
步骤5.5中，采用体积比为10∶1的氯仿丙酮混合溶液作为洗脱液，减压浓缩的温度为35℃。
实施例11：
采用以下技术参数改进实施例2。
步骤5.1中，各物质用量为，蓝萼甲素1.10g、四氢呋喃32ml、丁二酸0.997g、DMAP0.081g。
步骤5.2中，减压蒸馏的温度为47℃。
步骤5.3中，采用32ml水稀释，采用30ml乙酸乙酯萃取3次。
步骤5.4中，减压蒸馏的温度为47℃。
步骤5.5中，采用体积比为10∶1的氯仿丙酮混合溶液作为洗脱液，减压浓缩的温度为37℃。
实施例12：
采用以下技术参数改进实施例2。
步骤5.1中，各物质用量为，蓝萼甲素1.14g、四氢呋喃34ml、丁二酸1.037g、DMAP0.085g。
步骤5.2中，减压蒸馏的温度为49℃。
步骤5.3中，采用34ml水稀释，采用25～35ml乙酸乙酯萃取4次。
步骤5.4中，减压蒸馏的温度为49℃。
步骤5.5中，采用体积比为11∶1的氯仿丙酮混合溶液作为洗脱液，减压浓缩的温度为39℃。
实施例13：
采用以下技术参数改进实施例3。
步骤6.1中，各物质用量为，蓝萼甲素的丁二酸酯115.5mg、THF2ml，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)19.5mg、PBS缓冲溶液4ml。
步骤6.2中，搅拌反应时间为17分钟，减压蒸馏的温度为31℃。
步骤6.4中，各物质用量为，THF0.6ml、甘氨酸15.5mg、PBS缓冲液4.5ml。
步骤6.5中，搅拌反应时间为17分钟，减压蒸馏的温度为31℃。
步骤6.6中，冷冻干燥的温度为-44℃，冷冻干燥的时间为21小时。
实施例14：
采用以下技术参数改进实施例3。
步骤6.1中，各物质用量为，蓝萼甲素的丁二酸酯119.5mg、THF2.5ml，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)19.9mg、PBS缓冲溶液4.5ml。
步骤6.2中，搅拌反应时间为15分钟，减压蒸馏的温度为33℃。
步骤6.4中，各物质用量为，THF0.8ml、甘氨酸16.5mg、PBS缓冲液5ml。
步骤6.5中，搅拌反应时间为15分钟，减压蒸馏的温度为33℃。
步骤6.6中，冷冻干燥的温度为-42℃，冷冻干燥的时间为23小时。
实施例15：
采用以下技术参数改进实施例3。
步骤6.1中，各物质用量为，蓝萼甲素的丁二酸酯123.5mg、THF3ml，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)20.3mg、PBS缓冲溶液5ml。
步骤6.2中，搅拌反应时间为15分钟，减压蒸馏的温度为35℃。
步骤6.4中，各物质用量为，TH F1.0ml、甘氨酸17.5mg、PBS缓冲液5ml。
步骤6.5中，搅拌反应时间为15分钟，减压蒸馏的温度为35℃。
步骤6.6中，冷冻干燥的温度为-40℃，冷冻干燥的时间为24小时。
实施例16：
采用以下技术参数改进实施例3。
步骤6.1中，各物质用量为，蓝萼甲素的丁二酸酯127.5mg、THF3.5ml，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)20.7mg、PBS缓冲溶液5.5ml。
步骤6.2中，搅拌反应时间为15分钟，减压蒸馏的温度为37℃。
步骤6.4中，各物质用量为，THF1.2ml、甘氨酸18.5mg、PBS缓冲液5ml。
步骤6.5中，搅拌反应时间为15分钟，减压蒸馏的温度为37℃。
步骤6.6中，冷冻干燥的温度为-38℃，冷冻干燥的时间为25小时。
实施例17：
采用以下技术参数改进实施例3。
步骤6.1中，各物质用量为，蓝萼甲素的丁二酸酯131.5mg、THF4ml，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)21.1mg、PBS缓冲溶液6ml。
步骤6.2中，搅拌反应时间为13分钟，减压蒸馏的温度为39℃。
步骤6.4中，各物质用量为，THF1.4ml、甘氨酸19.5mg、PBS缓冲液5.5ml。
步骤6.5中，搅拌反应时间为13分钟，减压蒸馏的温度为39℃。
步骤6.6中，冷冻干燥的温度为-36℃，冷冻干燥的时间为27小时。
实施例18：
采用以下技术参数改进实施例4。
步骤5.1中，各物质用量为，蓝萼甲素0.98g、四氢呋喃26ml、戊二酸1.045g、DMAP0.082g。
步骤5.2中，减压蒸馏的温度为41℃。
步骤5.3中，采用26ml水稀释，采用26ml乙酸乙酯萃取2次。
步骤5.4中，减压蒸馏的温度为41℃。
步骤5.5中，采用体积比为9∶1的氯仿丙酮混合溶液作为洗脱液，减压浓缩的温度为31℃。
实施例19：
采用以下技术参数改进实施例4。
步骤5.1中，各物质用量为，蓝萼甲素1.02g、四氢呋喃28ml、戊二酸1.0825g、DMAP0.086g。
步骤5.2中，减压蒸馏的温度为43℃。
步骤5.3中，采用28ml水稀释，采用28ml乙酸乙酯萃取3次。
步骤5.4中，减压蒸馏的温度为43℃。
步骤5.5中，采用体积比为10∶1的氯仿丙酮混合溶液作为洗脱液，减压浓缩的温度为33℃。
实施例20：
采用以下技术参数改进实施例4。
步骤5.1中，各物质用量为，蓝萼甲素1.06g、四氢呋喃30ml、戊二酸1.125g、DMAP0.090g。
步骤5.2中，减压蒸馏的温度为45℃。
步骤5.3中，采用30ml水稀释，采用30ml乙酸乙酯萃取3次。
步骤5.4中，减压蒸馏的温度为45℃。
步骤5.5中，采用体积比为10∶1的氯仿丙酮混合溶液作为洗脱液，减压浓缩的温度为35℃。
实施例21：
采用以下技术参数改进实施例4。
步骤5.1中，各物质用量为，蓝萼甲素1.10g、四氢呋喃32ml、戊二酸1.165g、DMAP0.094g。
步骤5.2中，减压蒸馏的温度为47℃。
步骤5.3中，采用32ml水稀释，采用30ml乙酸乙酯萃取3次。
步骤5.4中，减压蒸馏的温度为47℃。
步骤5.5中，采用体积比为10∶1的氯仿丙酮混合溶液作为洗脱液，减压浓缩的温度为37℃。
实施例22：
采用以下技术参数改进实施例4。
步骤5.1中，各物质用量为，蓝萼甲素1.14g、四氢呋喃34ml、戊二酸1.205g、DMAP0.098g。
步骤5.2中，减压蒸馏的温度为49℃。
步骤5.3中，采用34ml水稀释，采用25～35ml乙酸乙酯萃取4次。
步骤5.4中，减压蒸馏的温度为49℃。
步骤5.5中，采用体积比为11∶1的氯仿丙酮混合溶液作为洗脱液，减压浓缩的温度为39℃。
实施例23：
采用以下技术参数改进实施例5。
步骤6.1中，各物质用量为，蓝萼甲素的戊二酸酯131mg、THF2ml，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)19.5mg、PBS缓冲溶液4ml。
步骤6.2中，搅拌反应时间为17分钟，减压蒸馏的温度为31℃。
步骤6.4中，各物质用量为，THF0.6ml、甘氨酸15.5mg、PBS缓冲液4.5ml。
步骤6.5中，搅拌反应时间为17分钟，减压蒸馏的温度为31℃。
步骤6.6中，冷冻干燥的温度为-44℃，冷冻干燥的时间为21小时。
实施例24：
采用以下技术参数改进实施例5。
步骤6.1中，各物质用量为，蓝萼甲素的戊二酸酯133mg、THF2.5ml，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)19.9mg、PBS缓冲溶液4.5ml。
步骤6.2中，搅拌反应时间为15分钟，减压蒸馏的温度为33℃。
步骤6.4中，各物质用量为，THF0.8ml、甘氨酸16.5mg、PBS缓冲液5ml。
步骤6.5中，搅拌反应时间为15分钟，减压蒸馏的温度为33℃。
步骤6.6中，冷冻干燥的温度为-42℃，冷冻干燥的时间为23小时。
实施例25：
采用以下技术参数改进实施例5。
步骤6.1中，各物质用量为，蓝萼甲素的戊二酸酯135mg、THF3ml，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)20.3mg、PBS缓冲溶液5ml。
步骤6.2中，搅拌反应时间为15分钟，减压蒸馏的温度为35℃。
步骤6.4中，各物质用量为，THF1.0ml、甘氨酸17.5mg、PBS缓冲液5ml。
步骤6.5中，搅拌反应时间为15分钟，减压蒸馏的温度为35℃。
步骤6.6中，冷冻干燥的温度为-40℃，冷冻干燥的时间为24小时。
实施例26：
采用以下技术参数改进实施例5。
步骤6.1中，各物质用量为，蓝萼甲素的戊二酸酯137mg、THF3.5ml，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)20.7mg、PBS缓冲溶液5.5ml。
步骤6.2中，搅拌反应时间为15分钟，减压蒸馏的温度为37℃。
步骤6.4中，各物质用量为，THF1.2ml、甘氨酸18.5mg、PBS缓冲液5ml。
步骤6.5中，搅拌反应时间为15分钟，减压蒸馏的温度为37℃。
步骤6.6中，冷冻干燥的温度为-38℃，冷冻干燥的时间为25小时。
实施例27
采用以下技术参数改进实施例5
步骤6.1中，各物质用量为，蓝萼甲素的戊二酸酯139mg、THF4ml，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)21.1mg、PBS缓冲溶液6ml。
步骤6.2中，搅拌反应时间为13分钟，减压蒸馏的温度为39℃。
步骤6.4中，各物质用量为，THF1.4ml、甘氨酸19.5mg、PBS缓冲液5.5ml。
步骤6.5中，搅拌反应时间为13分钟，减压蒸馏的温度为39℃。
步骤6.6中，冷冻干燥的温度为-36℃，冷冻干燥的时间为27小时。
实施例28：
根据实施例6～7制备得到蓝萼甲素，并将所得蓝萼甲素按照实施例8～12进行衍生化，特别是根据实施例10，制备得到蓝萼甲素的丁二酸酯。
采用高效液相色谱(HPLC)和质谱检测上述蓝萼甲素的丁二酸酯结构，所得HPLC谱图和质谱图分别如图2a和图2b所示。经HPLC和质谱检测表明，上述蓝萼甲素的丁二酸酯结构如下。
实施例29：
根据实施例6～7制备得到蓝萼甲素，并将所得蓝萼甲素按照实施例8～12进行衍生化，特别是根据实施例10，制备得到蓝萼甲素的丁二酸酯，随后将所得蓝萼甲素的丁二酸酯按照实施例13～17进行衍生化，特别是根据实施例15，制备得到蓝萼甲素的丁二酸酯与甘氨酸的衍生物。
采用高效液相色谱(HPLC)和质谱检测上述蓝萼甲素的丁二酸酯与甘氨酸的衍生物结构，所得HPLC谱图和质谱图分别如图4a和图4b所示。经HPLC和质谱检测表明，上述蓝萼甲素的丁二酸酯与甘氨酸的衍生物结构如下。
实施例30：
根据实施例6～7制备得到蓝萼甲素，并将所得蓝萼甲素按照实施例18～22进行衍生化，特别是根据实施例20，制备得到蓝萼甲素的戊二酸酯。
采用高效液相色谱(HPLC)和质谱检测上述蓝萼甲素的戊二酸酯结构，所得HPLC谱图和质谱图分别如图6a和图6b所示。经HPLC和质谱检测表明，上述蓝萼甲素的戊二酸酯结构如下。
实施例31：
根据实施例6～7制备得到蓝萼甲素，并将所得蓝萼甲素按照实施例18～22进行衍生化，特别是根据实施例20，制备得到蓝萼甲素的戊二酸酯，随后将所得蓝萼甲素的戊二酸酯按照实施例23～27进行衍生化，特别是根据实施例25，制备得到蓝萼甲素的戊二酸酯与甘氨酸的衍生物。
采用高效液相色谱(HPLC)检测上述蓝萼甲素的戊二酸酯与甘氨酸的衍生物结构，所得HPLC谱图如图8所示。经HPLC检测表明，上述蓝萼甲素的戊二酸酯与甘氨酸的衍生物结构如下。
实施例32：蓝萼甲素酸酯衍生物制剂的制备
按照上述实施例制备得到具有实施例28的分子式结构的蓝萼甲素的丁二酸酯，或按照上述实施例制备具有实施例29的分子式结构的蓝萼甲素的丁二酸酯与甘氨酸的衍生物，或按照上述实施例制备得到具有实施例30的分子式结构的蓝萼甲素的戊二酸酯，或按照上述实施例制备具有实施例31的分子式结构的蓝萼甲素的戊二酸酯与甘氨酸的衍生物。
将所得上述蓝萼甲素酸酯衍生物，采用药剂学上的常规药物载体，并采用药剂学上的常规制备方法，制备成药剂学上的常规剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、软胶剂、喷雾剂、凝胶剂、凝胶吸入剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、脂质体注射剂、靶向给药注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。
实施例33：蓝萼甲素酸酯衍生物对于肺癌A549肿瘤细胞的影响
1、材料：
四氮唑兰(MTT)、二氧化碳孵化箱、显微镜、酶标仪
2、方法：
2.1A549细胞培养
A549细胞用含20％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，置于37℃、5％CO2孵化箱中进行培养。
2.2细胞传代
取出已长满细胞的25cm2培养瓶，倒去培养液，先注入胰蛋白酶消化液1ml，轻轻摇晃后弃去。再加入胰蛋白酶消化液2ml，将其浸润细胞后，放入CO2孵化箱中消化2～3分钟。注入5ml培养液，用滴管吸取培养瓶中的培养液反复吹打培养瓶基面。取2只无菌的培养瓶，将含有细胞的培养液均匀分入培养瓶中，分别加入10ml新鲜培养液后培养。
2.3细胞冻存
先制成含细胞50万/ml的细胞悬液，后加10％DMSO(二甲基亚砜)，装入冻存管中火封，放置于-20℃冰箱内3h后取出，置于-60℃冰箱内过夜，取出后装入固定架后投入液氮中保存。
2.4细胞复苏
取出冻存管后，迅速投入37℃的温水化冻，吸出细胞液，以1000rpm的转速离心10分钟，弃上清液，除去DMSO，换入含20％胎牛血清的培养液，稀释细胞数为20～50万/ml分种于培养瓶中，置于CO2孵化箱中培养。
2.5药品配制
取按照上述实施例制备得到的蓝萼甲素的丁二酸酯、蓝萼甲素的丁二酸酯与甘氨酸的衍生物、蓝萼甲素的戊二酸酯、蓝萼甲素的戊二酸酯与甘氨酸的衍生物，分别加入相应体积的二甲基亚砜(DMSO)溶解，得到浓度为约50mg/ml的药物溶液，随后震荡溶解，所得药物溶液可在-20℃条件下储存
2.6实验方法
细胞培养于含10％FBS的F-12培养基中。取对数生长期的A549细胞，按常规消化后进行细胞计数。细胞计数后调整细胞浓度为1×104接种于96孔细胞培养板上，置于培养箱中培养24小时后加药。24小时后对照组换培养液，实验组加入不同浓度的受试物，于48小时后应用MTT法比色检测细胞活力。每孔中加入浓度为5mg/ml的MTT20μl，培养4小时后吸去培养液，加DMSO150μl，摇床振荡使蓝紫色沉淀颗粒完全溶解，在酶标仪上490nm处测吸光度(A)值。
3、实验结果：
蓝萼甲素酸酯衍生物对于肺癌A549肿瘤细胞的影响如下表所示
| 组别 | 浓度 | A值(490nm) | 抑制率(％) |
| 空白对照 | 0.4420+0.0355 | ||
| GLA-Su | 1μmol/ml | 0.155+0.026＊＊△△ | 82.14 |
| 0.1μmol/ml | 0.197+0.0041＊＊△△ | 80.93 | |
| 0.01μmol/ml | 0.322+0.044＊＊△△ | 73.25 | |
| GLA-GA | 1μmol/ml | 0.249+0.028＊＊△△ | 87.32 |
| 0.1μmol/ml | 0.324+0.082＊＊△△ | 92.21 | |
| 0.01μmol/ml | 0.404+0.071＊＊△△ | 77.48 | |
| GLA-Su-gly | 1μmol/ml | 0.124+0.042＊＊△△ | 86.12 |
| 0.1μmol/ml | 0.402+0.0932＊＊△△ | 77.14 | |
| 0.01μmol/ml | 0.456+0.0112＊＊△△ | 59.32 | |
| GLA-Ga-gly | 1μmol/ml | 0.147+0.031＊＊△△ | 82.88 |
| 0.1μmol/ml | 0.362+0.0932＊＊△△ | 79.45 | |
| 0.01μmol/ml | 0.506+0.0112＊＊△△ | 50.43 | |
| 阿霉素 | 1μl/ml | 0.370+0.087 | 81.21 |
| 0.1μl/ml | 0.406+0.075 | 73.31 | |
| 0.01l/ml | 0.452+0.057 | 59.46 | |
| DMSO对照 | 1μl/ml | 0.384+0.066 | 15.76 |
注：＊表示与空白对照组比较，P＜0.05；
＊＊表示与空白对照组比较，P＜0.01；
△表示与阳性对照(阿霉素)比较，P＜0.01；
GLA-Su表示蓝萼甲素的丁二酸酯；
GLA-Su-gly表示蓝萼甲素的丁二酸酯与甘氨酸的衍生物；
GLA-GA表示蓝萼甲素的戊二酸酯；
GLA-Ga-gly表示蓝萼甲素的戊二酸酯与甘氨酸的衍生物。
结果表明，蓝萼甲素酸酯衍生物(蓝萼甲素的丁二酸酯、蓝萼甲素的丁二酸酯与甘氨酸的衍生物、蓝萼甲素的戊二酸酯、蓝萼甲素的戊二酸酯与甘氨酸的衍生物)能明显抑制肺癌A549肿瘤细胞的增殖，此作用与助溶剂DMSO无关。
实施例34：蓝萼甲素酸酯衍生物对于SMMC-7721人肝癌细胞、MCF-7乳腺癌肿瘤细胞、Eca-109人食管癌肿瘤细胞、KB肿瘤细胞、宫颈癌HeLa肿瘤细胞、人结肠癌SW480肿瘤细胞的生长抑制作用
1、实验材料：
1.1药物与试剂：
受试样品、F-12培养基、10％灭活胎牛血清(FBS)、二甲基亚砜(DMSO)、噻唑盐、阿霉素(阳性药)
1.2仪器：
培养箱、超静工作台、多功能倒置显微镜、离心机、自动酶标仪、96孔培养板
1.3细胞株：
SMMC-7721人肝癌细胞、MCF-7乳腺癌肿瘤细胞、Eca-109人食管癌肿瘤细胞、KB肿瘤细胞、宫颈癌HeLa肿瘤细胞、人结肠癌SW480肿瘤细胞
2、样品配制：
取按照上述实施例制备得到的蓝萼甲素的丁二酸酯、蓝萼甲素的丁二酸酯与甘氨酸的衍生物、蓝萼甲素的戊二酸酯、蓝萼甲素的戊二酸酯与甘氨酸的衍生物，分别加入相应体积的二甲基亚砜(DMSO)溶解，得到浓度为约50mg/ml的药物溶液，随后震荡溶解，所得药物溶液可在-20℃条件下储存
3、实验方法：
将上述肿瘤细胞培养于含10％FBS的F-12培养基中。取对数生长期的上述肿瘤细胞，按常规消化后进行细胞计数。细胞计数后调整细胞浓度为1×104并接种于96孔细胞培养板上，置于培养箱中培养24小时后加药。24小时后对照组换培养液，实验组加入不同浓度的受试物，于48小时后应用MTT法(MTT比色法、噻唑蓝法)比色检测细胞活力。每孔中加入浓度为5mg/ml的MTT(噻唑蓝)20μl，培养4小时后吸去培养液，加DMSO150μl，摇床振荡使蓝紫色沉淀颗粒完全溶解，在酶标仪上490nm处测吸光度(A)值。
4、实验结果：
蓝萼甲素酸酯衍生物对于SMMC-7721人肝癌细胞、MCF-7乳腺癌肿瘤细胞、Eca-10g人食管癌肿瘤细胞、KB肿瘤细胞、宫颈癌HeLa肿瘤细胞、人结肠癌SW480肿瘤细胞的生长抑制作用如下表所示
注：GLA-Su表示蓝萼甲素的丁二酸酯；
GLA-Su-gly表示蓝萼甲素的丁二酸酯与甘氨酸的衍生物；
GLA-GA表示蓝萼甲素的戊二酸酯；
GLA-Ga-gly表示蓝萼甲素的戊二酸酯与甘氨酸的衍生物。
结果表明，蓝萼甲素酸酯衍生物(蓝萼甲素的丁二酸酯、蓝萼甲素的丁二酸酯与甘氨酸的衍生物、蓝萼甲素的戊二酸酯、蓝萼甲素的戊二酸酯与甘氨酸的衍生物)能明显抑制SMMC-7721人肝癌细胞、MCF-7乳腺癌肿瘤细胞、Eca-109人食管癌肿瘤细胞、KB肿瘤细胞、宫颈癌HeLa肿瘤细胞、人结肠癌SW480肿瘤细胞的增殖，此作用与助溶剂DMSO无关。
实施例35：蓝萼甲素酸酯衍生物制剂的应用
根据实施例33～34，按照实施例8～12制备得到具有实施例28的分子式结构的蓝萼甲素的丁二酸酯、或按照实施例13～17制备具有实施例29的分子式结构的蓝萼甲素的丁二酸酯与甘氨酸的衍生物、或按照实施例18～22制备得到具有实施例30的分子式结构的蓝萼甲素的戊二酸酯、或按照实施例23～27制备具有实施例31的分子式结构的蓝萼甲素的戊二酸酯与甘氨酸的衍生物，用于癌症的治疗，特别是在治疗肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、鼻咽癌、宫颈癌、结肠癌中的应用。
上述内容为本发明的具体实施例的例举，对于其中未详尽描述的试剂、设备、操作方法等，应当理解为采取本领域已有的普通及常规试剂、设备、操作方法等来予以实施。
同时本发明上述实施例仅为说明本发明技术方案之用，仅为本发明技术方案的列举，并不用于限制本发明的技术方案及其保护范围。采用等同技术手段、等同试剂等对本发明权利要求书及说明书所公开的技术方案的改进应当认为是没有超出本发明权利要求书及说明书所公开的范围。
Claims (11)
1.一种蓝萼甲素酸酯衍生物，其特征在于，是一种贝壳杉烷型四环二萜类物质，具有贝壳杉烷型结构、羰基和羟基，是蓝萼甲素与羧酸的酯化物，其分子结构的通式如下：
其中，R1为丁二酸取代基-C4H5O4、戊二酸取代基-C5H7O4、丁二酸的甘氨酸衍生物取代基-C6H8NO5、戊二酸的甘氨酸衍生物取代基-C7H10NO5或-OH，R2为丁二酸取代基-C4H5O4、戊二酸取代基-C5H7O4、丁二酸的甘氨酸衍生物取代基-C6H8NO5、戊二酸的甘氨酸衍生物取代基-C7H10NO5或-OH，R1和R2中至少有一个为-OH。
2.如权利要求1所述的蓝萼甲素酸酯衍生物，其特征在于，所述R1为-C4H5O4、所述R2为-OH，或者所述R1为-OH、所述R2为-C4H5O4，其分子结构分别如下：
3.如权利要求1所述的蓝萼甲素酸酯衍生物，其特征在于，所述R1为-C5H7O4、所述R2为-OH，或者所述R1为-OH、所述R2为-C5H7O4，其分子结构分别如下：
4.如权利要求1所述的蓝萼甲素酸酯衍生物，其特征在于，所述R1为-C6H8NO5、所述R2为-OH，或者所述R1为-OH、所述R2为-C6H8NO5，其分子结构分别如下：
5.如权利要求1所述的蓝萼甲素酸酯衍生物，其特征在于，所述R1为-C7H10NO5、所述R2为-OH，或者所述R1为-OH、所述R2为-C7H10NO5，其分子结构分别如下：
6.一种如权利要求1所述的蓝萼甲素酸酯衍生物的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
步骤1：提取
步骤1.1：取香茶菜药材(地上部分)粉碎至20目～50目；
步骤1.2：将所得的粉碎物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶5～1∶15混合，加热，在80℃～90℃温度条件下回流1～2小时，提取、过滤，得到提取液和剩余物；
步骤1.3：将步骤1.2所得的剩余物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶5～1∶15混合，加热，在80℃～90℃温度条件下回流1～2小时，提取、过滤，得到提取液和剩余物，重复该步骤1～3次；
步骤1.4：合并步骤1.2和1.3所得的提取液；
步骤2：溶剂处理
步骤2.1：将步骤1所得的提取液加热，在55℃～65℃温度条件下加热减压浓缩，回收乙醇并得到粘稠的初级浓缩物；
步骤2.2：将步骤2.1所得的初级浓缩物与水按照体积比1∶8～1∶10混合，在室温条件下以60～120转/分的速度搅拌10分钟，随后静置6～12小时，弃去上清液得到下层固体；
步骤2.3：将步骤2.2所得的固体与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶4～1∶6混合，在25℃～35℃温度条件下以60～120转/分的速度搅拌溶解，静置1～3小时，过滤得到滤液和不溶物；
步骤2.4：将步骤2.3所得的不溶物与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶4～1∶6混合，在25℃～35℃温度条件下以60～120转/分的速度搅拌溶解，静置1～3小时，过滤得到滤液和不溶物，重复该步骤1～3次；
步骤2.5：合并步骤2.3和2.4所得的滤液；
步骤2.6：将步骤2.5所得的滤液加热，在35℃～45℃温度条件下加热减压浓缩，回收乙酸乙酯(A.R.)，得到固体浓缩物；
步骤3：树脂处理
步骤3.1：将步骤2所得的固体浓缩物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶4～1∶6混合溶解，得到溶液；
步骤3.2：将步骤3.1所得的溶液缓慢加到7号树脂柱中，起观察树脂的颜色，在树脂柱有2/3变色时，停止加样，并采用200ml～400ml的95％乙醇(A.R.)冲洗该树脂柱，收集所有流出液，所述树脂柱的填充物为强碱性阴离子树脂并用氢氧化钠饱和至pH值中性；
步骤3.3：将步骤3.2所得流出液加热，并在55℃～65℃温度条件下加热减压回流，直至溶剂干，得到固体残留物；
步骤4：重结晶
步骤4.1：将上述残留物与30℃～40℃的极性溶剂按照体积比1∶4～1∶6混合，得到初级溶液，加热，在30℃的～40℃温度条件下减压浓缩，在-23℃～-13℃温度条件下静置析晶，过滤得到浅黄色针状结晶；
所述极性溶剂为按照体积比1∶1～1∶2混合的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液；
步骤4.2：将步骤4.1所得的结晶与极性溶剂按照体积比1∶4～1∶6混合，在-23℃～-13℃温度条件下反复重结晶2～4次，每次12～24小时，得到中间产物蓝萼甲素；
所述极性溶剂为按照体积比1∶1～1∶4混合的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液；
步骤5：衍生化
将步骤4所得蓝萼甲素溶于四氢呋喃(THF)中，在室温下，加入丁二酸或戊二酸和4-二甲氨基吡啶(DMAP)，室温下搅拌，减压蒸馏除去四氢呋喃，随后采用乙酸乙酯萃取得到有机相，蒸去溶剂干燥得到蓝萼甲素酸酯及其衍生物。
7.如权利要求6所述的蓝萼甲素酸酯衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤5进一步包含以下步骤：
步骤5.1：将0.96～1.16g步骤4所得蓝萼甲素溶于25～35ml四氢呋喃中，并在室温条件下，依次加入0.857～1.057g丁二酸和0.067～0.087gDMAP，在室温条件下搅拌反应10～14小时；
步骤5.2：将步骤5.1的反应溶液加热至40℃～50℃并减压蒸馏，除去四氢呋喃；
步骤5.3：向步骤5.2的反应溶液中加入25～35ml水稀释，随后采用25～35ml乙酸乙酯萃取2～4次，合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥；
步骤5.4：将步骤5.3中经洗涤干燥后的有机相加热至40℃～50℃并减压蒸馏，出去溶剂，随后在室温条件下干燥，得到淡黄色油状粗产物；
步骤5.5：采用硅胶柱层析分离步骤5.4所得淡黄色油状粗产物，随后将所得馏分加热至30℃～40℃减压浓缩蒸去溶剂，得到蓝萼甲素的丁二酸酯的无色晶体；
所述层析分离过程中，采用体积比为9∶1～11∶1的氯仿丙酮混合溶液作为洗脱液。
8.如权利要求6所述的蓝萼甲素酸酯衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤5进一步包含以下步骤：
步骤5.1：将0.96～1.16g步骤4所得蓝萼甲素溶于25～35ml四氢呋喃中，并在室温条件下，依次加入1.025～1.225g戊二酸和0.080～1.000gDMAP，在室温条件下搅拌反应10～14小时；
步骤5.2将步骤5.1的反应溶液加热至40℃～50℃并减压蒸馏，除去四氢呋喃；
步骤5.3：向步骤5.2的反应溶液中加入25～35ml水稀释，随后采用25～35ml乙酸乙酯萃取2～4次，合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥；
步骤5.4：将步骤5.3中经洗涤干燥后的有机相加热至40℃～50℃并减压蒸馏，出去溶剂，随后在室温条件下干燥，得到淡黄色油状粗产物；
步骤5.5：采用硅胶柱层析分离步骤5.4所得淡黄色油状粗产物，随后将所得馏分加热至30℃～40℃减压浓缩蒸去溶剂，得到蓝萼甲素的戊二酸酯的无色晶体；
所述层析分离过程中，采用体积比为9∶1～11∶1的氯仿丙酮混合溶液作为洗脱液。
9.如权利要求7所述的蓝萼甲素酸酯衍生物的制备方法，其特征在于，进一步包括步骤6，所述步骤6包括以下步骤：
步骤6.1：将113.5～133.5mg蓝萼甲素的丁二酸酯溶于1～5ml四氢呋喃(THF)，将19.3～21.3mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于3～7ml磷酸盐缓冲溶液(PBS缓冲溶液)；
步骤6.2：在室温条件下，将所得NHS的PBS溶液滴加到蓝萼甲素的丁二酸酯的THF溶液中，室温搅拌反应10～20分钟，随后将所得反应溶液加热至30℃～40℃减压蒸馏，除去THF，得到黄色油状粗产物；
步骤6.3：采用ODS-C18填料反相中压柱分离步骤6.3的粗产物，得到中间产物；
步骤6.4：将所得中间产物溶于0.5～1.5mlTHF，将15-20mg甘氨酸溶于4～6mlPBS缓冲液；
步骤6.5：在室温条件下，将所得中间产物的THF溶液滴加到甘氨酸的PBS溶液中，室温搅拌反应10～20分钟，随后将所得反应溶液在30℃～40℃条件下减压蒸馏，除去THF，得到溶液；
步骤6.6：将所得溶液在-45℃～-35℃条件下冷冻干燥20～28小时得到白色粉末状的蓝萼甲素的丁二酸酯与甘氨酸的衍生物。
10.如权利要求8所述的蓝萼甲素酸酯衍生物的制备方法，其特征在于，进一步包括步骤6，所述步骤6包括以下步骤：
步骤6.1：将130～140mg蓝萼甲素的戊二酸酯溶于1～5ml四氢呋喃(THF)，将19.3～21.3mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于3～7ml(PBS缓冲溶液)；
步骤6.2：在室温条件下，将所得NHS的PBS溶液滴加到蓝萼甲素的戊二酸酯的THF溶液中，室温搅拌10～20分钟，随后将所得反应溶液加热至30℃～40℃减压蒸馏，除去THF，得到黄色油状粗产物；
步骤6.3：采用ODS-C18填料反相中压柱分离步骤6.3的粗产物，得到中间产物；
步骤6.4：将所得中间产物溶于0.5～1.5mlTHF，将15-20mg甘氨酸溶于4～6mlPBS缓冲液；
步骤6.5：在室温条件下，将所得中间产物的THF溶液滴加到甘氨酸的PBS溶液中，室温搅拌反应10～20分钟，随后将所得反应溶液在30℃～40℃条件下减压蒸馏，除去THF，得到溶液；
步骤6.6：将所得溶液在-45℃～-35℃条件下冷冻干燥20～28小时得到白色粉末状的蓝萼甲素的戊二酸酯与甘氨酸的衍生物。
11.如权利要求1～5所述的蓝萼甲素酸酯衍生物在治疗癌症中的应用，特别是在治疗肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、鼻咽癌、宫颈癌、结肠癌中的应用。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110330 |