CN110075096A

CN110075096A - 王枣子乙素在制备用于治疗肝癌的药物中的用途

Info

Publication number: CN110075096A
Application number: CN201910398042.8A
Authority: CN
Inventors: 薛宏宇; 苗诗雨; 牛蕾; 连显会; 王宁; 周玉荣; 刘勇; 姜丽丽; 刘亚军
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2019-05-14
Filing date: 2019-05-14
Publication date: 2019-08-02

Abstract

本发明公开了王枣子乙素在制备用于治疗肝癌的药物中的用途，具体地，本发明公开了王枣子乙素作用于肝癌细胞可以通过破坏线粒体膜电位、造成Cyto‑C外流、抑制抗凋亡蛋白Bcl‑2，促进促凋亡蛋白Bax表达、引发Caspase级联反应诱导细胞凋亡，为肝癌治疗提供新的治疗药物的选择。

Description

王枣子乙素在制备用于治疗肝癌的药物中的用途

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学技术领域，具体涉及王枣子乙素在制备用于治疗肝癌的药物中的用途。

背景技术

原发性肝癌(primary liver cancer,PLC)是中国最常见的恶性肿瘤之一，具有高发病率及高致死率的特点。由于PLC起因较为隐患，初期症状不明显，许多患者确诊时，大多已经为中晚期，严重威胁人类的生命和健康。

PLC包括肝细胞癌和肝内胆管癌。其中肝细胞癌是最普遍且最具有侵略性的，其发病率在逐年增加。肝细胞癌的发病原因是多种多样的，主要包括慢性肝炎、酗酒以及肥胖。肝内胆管癌是第二常见的原发性肝癌，可在胆管树内的解剖位置分为肝内癌，门静脉癌和远端胆管癌三种不同类型。目前PLC最主要的治疗手段是手术切除、肝移植和药物放化疗。但由于并非所有肝癌患者都适合手术治疗，即使经过手术治疗也不一定能较好地改善患者的生活质量；目前临床常用的抗肿瘤化疗药物对人体的副作用较大，治疗过程中会损害人体的自身免疫力等不良因素。因此，临床上迫切需要通过寻找新的肝癌治疗药物来延长肝癌患者生存时间。

近年来植物天然产物的抗癌活性受到广泛关注，王枣子属于唇形科香茶菜属植物，是少有的药食两用中草药。CN105585471A(发明名称：一种王枣子活性成分的提取方法；申请号：201610031386.1；申请日：2016年1月18日)公开了一种王枣子活性成分的提取方法。由王枣子的根部分离提取得到天然活性化合物——王枣子乙素(glaucocalyxin A)具有抗炎活性、免疫抑制以及抗菌作用。王枣子乙素分子式为C₂₀H₂₈O₄，相对分子质量为332.43，是一种二萜类化合物，无色针晶状，易溶于乙醇、甲醇。

发明内容

鉴于本领域的上述需求，在本发明中的一些实施方案中，提供王枣子乙素在制备用于治疗肝癌的药物中的用途。

在一个具体的实施方案中，所述肝癌是原发性肝癌。

在一个更具体的实施方案中，所述原发性肝癌选自肝细胞癌和肝内胆管癌。

在一个更具体的实施方案中，所述肝内胆管癌选自肝内癌、门静脉癌和远端胆管癌。

在一个具体的实施方案中，所述肝癌是肝母细胞瘤。

在一个具体的实施方案中，所述肝癌是哺乳动物中的肝癌。

在一个具体的实施方案中，所述哺乳动物是人类。

在一个具体的实施方案中，所述药物通过破坏线粒体膜电位、造成Cyto-C外流、抑制抗凋亡蛋白Bcl-2，促进促凋亡蛋白Bax表达、引发Caspase级联反应诱导肝癌细胞凋亡以治疗。

在一个更具体的实施方案中，所述肝癌细胞是HepG2细胞。

另一方面，本发明提供了王枣子乙素在制备用于促进人肝癌细胞凋亡的药物中的用途。

在一个具体的实施方案中，所述肝癌细胞是HepG2细胞。

本发明的效果和益处是：本发明公开了王枣子乙素作用于肝癌细胞可以通过破坏线粒体膜电位、造成Cyto-C外流、抑制抗凋亡蛋白Bcl-2，促进促凋亡蛋白Bax表达、引发Caspase级联反应诱导细胞凋亡，为肝癌治疗提供新的治疗药物的选择。

附图说明

图1为王枣子乙素对HepG2细胞的细胞活力的影响示意图。

图2为王枣子乙素对HepG2细胞氧化损伤作用的示意图。

图3为王枣子乙素对HepG2细胞LDH释放的影响示意图。

图4为王枣子乙素对HepG2细胞质中Cyto-C含量的影响示意图，其中C_{王枣子乙素}表示王枣子乙素的浓度。

图5A、图5B和图5C为王枣子乙素对HepG2细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达的影响示意图，其中图5A为Western Blot电泳图，图5B为Bax蛋白的统计图，图5C为Bcl-2蛋白的统计图。

图6A至图6D显示王枣子乙素对HepG2细胞AV/PI染色结果示意图；其中，图6A为对照(DMSO)；图6B为2.5μM王枣子乙素；图6C为5μM王枣子乙素；图6D为20μM王枣子乙素。

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明以下实施例及测试例中使用的细胞、试剂以及试剂盒：HepG2购自动物生物技术与营养研究室)，HepG2为人肝母细胞瘤细胞；胎牛血清(FBS)(16000-044)、胰酶(TE，25200-072)、DMEM培养基(C11330500BT)购自Gibco Life Technologies公司；双抗(青霉素/链霉素)(PS)(S7691)购自Selleck公司；磷酸盐缓冲液(PBS)(G2460)、HRP辣根过氧化物酶(ab181658)购自Solarbio Life Science公司；二甲基亚砜(DMSO，D5879)、Annexin V-EGFP染液(AV40526)、PI染液(P4170)、MTT(M2128)购自Sigma Aldrich公司；PMSF细胞裂解液(ST505)、JC-1染液(C2006)、ROS试剂盒(编号：S0033)、LDH试剂盒(编号：C0016)、BCA试剂盒(编号：P0012)购自Beyotime Biotechnology公司。

实施例：王枣子乙素的提取及验证

参考CN105585471A提取并验证王枣子乙素，简要地，其提取步骤如下：(1)王枣子根用普通粉碎机粉碎，过40目筛得到王枣子根粗粉；(2)精确称量王枣子根粗粉5.0kg，加入60gNaHCO₃助剂混合均匀，在超级磨中研磨40min后，过300目筛，精确称量2.0kg放于烧杯中，按料液比1:24加入质量百分比为80％的乙醇水溶液，搅拌均匀；(3)在45℃，频率43kHz，功率250W的超声波条件下超声提取50min，提取液真空抽滤，得滤液，在40℃、60r/min的条件下减压浓缩得浓缩液；(4)浓缩液依次经石油醚、氯仿萃取；(5)取氯仿浓缩物进行硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯，二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱成分进行薄层色谱检测，三氯化锑/乙酸试剂显色，二氯甲烷-甲醇-乙酸展开，收集合并含相同点的馏分，减压浓缩得到的结晶为王枣子乙素。经验证得到王枣子乙素分子式为C₂₀H₂₈O₄，相对分子质量(Molecular Weight)为332.43，准确分子量(Exact Mass)为332.20。结构式为：

结构验证：

经液相色谱-质谱联用检测得到：333[M+H]，315[M⁺—OH]，314[M—H₂O]，299[M—H₂O—CH₃]，271，257，253，229，215，201，163，258，135，105。红外光谱(IR)分析：3150(—OH)，1723 1709(C＝O)，1653(C＝CH₂)，1250，1126，1082，943。

核磁共振波谱数据如下¹HNMR(CDCl₃)δppm：1.08(6H，S，2×CH₃)，1.12(3H，S，CH₃)，3.02(1H，m，C₁₃—H)，4.10(1H，dd，J＝10，5.5Hz，C₇—H)，4.82(1H，brs，C₁₄—H)，5.49，6.25(各1H，S，C₁₇—2H)。

测试例

细胞培养：将保存于-80℃冻存管的HepG2细胞置于37℃水中，完全融化后，将细胞吸出加入到15mL离心管中；在1000r/min的转速下，离心5min，弃掉上清；将HepG2细胞重新悬浮于新鲜完全培养基(10％胎牛血清+90％DMEM培养基+1％双抗)中，置于体积浓度为5％CO₂、相对湿度为90％、温度为37℃的恒温培养箱中培养；细胞贴壁生长至培养瓶底面积的80～90％时传代1次。

药物配制：上述实施例中提取的王枣子乙素用DMSO溶解至4000μM作为储备液，密封保存于-20℃。每次实验用无血清DMEM培养基稀释药品。

药物处理细胞：几次传代培养后收集处于对数生长期生长状态稳定的HepG2细胞，加入新鲜完全培养基，稀释细胞密度为2×10⁵个/ml，接种于96孔板中；待细胞长至贴壁，进行给药处理。设置不同药物浓度实验组及1个空白对照组，每组6个复孔，空白对照组：无细胞组；实验组：分别向各组中加入不同浓度的药物及培养基，继续孵育12h，检测细胞活力、ROS水平、LDH释放率、线粒体膜电位、Cyto-C含量、Bax和Bcl-2蛋白含量，观察AV/PI染色结果，记录数据并进行处理。

测试例1

王枣子乙素对HepG2细胞的毒性作用：将复苏好的HepG2细胞培养于新鲜完全培养基中，在CO₂细胞培养箱中孵育，细胞长至80～90％左右传代1次。待HepG2细胞生长状态良好，用PBS洗去含有血清的培养基，用胰酶消化1min，加入适量血清终止消化，吹打并收集细胞，1000r/min离心5min，将用完全培养基稀释细胞至密度为2×10⁵个/ml的细胞悬液接种在96孔板上，设立无细胞空白对照组，为200μL无血清培养基。处理组王枣子乙素终浓度为：0、0.625、1.25、2.5、5、10、20μM，各6个平行复孔，放入培养箱中分别培养6、12、24、36、48、72h。用MTT法进行细胞活力检测，终止给药后每孔加入20μL、50mg/mL的MTT，放入培养箱培养4h后，吸弃上清，加入150μL DMSO于水平摇床上振荡20min，使用酶标仪在490nm波长下检测OD值记录并处理数据，计算细胞存活率(Cell Viability)。

结果如图1所示，细胞活力随着王枣子乙素浓度增大、作用时间的增长而减弱，表明了王枣子乙素对HepG2细胞的生长抑制作用随着时间增长、药物浓度的增加而增强，呈现出明显的时间和浓度依赖性。

测试例2

王枣子乙素对HepG2细胞氧化损伤影响：收集处于对数生长期的HepG2细胞，以2×10⁵个/mL的细胞密度接种于96孔板上，细胞生长稳定后进行药物处理：设立无细胞空白对照组。王枣子乙素药物终浓度分别为：0、0.625、1.25、2.5、5、10、20μM，每个浓度设置6个平行复孔，培养12h。去上清液，每孔加入200μL DCFH-DA探针，孵育20min，去掉上清液，用无血清DMEM培养基洗涤三次，加入100μL胰酶消化10min，加入100μL血清终止消化，每孔吸取150μL，加入到ROS孔板中，放入酶标仪中，测定激发波长488nm与发射波长525nm下的吸光度。结果如图2所示，细胞内的ROS会随着药物浓度的增加而上升，呈现明显的浓度依赖性，表明王枣子乙素能够造成HepG2细胞的氧化损伤。

测试例3

王枣子乙素对HepG2细胞LDH释放率的影响：收集处于对数生长期的HepG2细胞，以2×10⁵个/mL的细胞密度接种于96孔板，生长稳定后，进行药物处理，王枣子乙素药物终浓度分别为0、0.625、1.25、2.5、5、10、20μM，每个浓度设置6个平行复孔，培养12h。取出孔板，使用孔板离心机离心5min，每孔吸取120μL的上清液，加入新的培养板，每孔加入60μL LDH检测工作液，吹打混匀，在水平摇床摇匀30min。用酶标仪于490nm处测量吸光值，根据试剂盒说明书计算LDH释放率。结果如图3所示，使用不同浓度的王枣子乙素作用于HepG2细胞，细胞培养基上清中都有LDH释放率，并且随着药物浓度的增加，LDH释放率也明显增加，呈现出浓度依赖性，表明王枣子乙素能够破坏HepG2细胞的细胞膜，具有明显的细胞毒性。

测试例4

王枣子乙素对HepG2细胞线粒体膜电位的影响：收集处于对数生长期的HepG2细胞，用完全培养基稀释至细胞密度为4×10⁵个/mL，接种于24孔板上孵育12h，控制王枣子乙素终浓度分别为0、2.5、5和20μM，每个浓度设置6个平行复孔，培养12h。给药结束后，PBS洗2次，每孔加入200μL、5μg/ml的JC-1染液放置于细胞培养箱中继续培养，直至每孔呈现均一的红紫色。加入1mL PBS洗去多余染液。用激光共聚焦显微镜观察：检测JC-1单体时最大激发波长为514nm，最大发射波长为529nm；检测JC-1聚合物时最大激发波长为585nm，最大发射波长为590nm。结果表明，经王枣子乙素作用后，细胞内红色荧光逐渐减弱，绿色荧光逐渐增强，并且随王枣子乙素作用浓度的增加，绿色荧光强度增加更大。说明王枣子乙素可引起HepG2细胞线粒体膜电位下降，使线粒体功能缺失，这是细胞凋亡的前期特征。

测试例5

王枣子乙素对HepG2细胞中Cyto-C含量的影响：首先进行细胞质中蛋白的提取：处理组王枣子乙素终浓度分别为0、2.5、5和20μM，作用12h后，倒净培养基，加入3mL、4℃的PBS摇动1min，重复洗涤3次，PBS弃净后置于冰上。每2×10⁶个细胞加入400μL、100mM的PMSF的裂解液，裂解30min后，用干净的细胞刮棒将细胞收集至1.5mL离心管中，4℃恒温、12000r/min离心5min，-80℃保存。用BCA试剂盒测定蛋白浓度。进行Western Blot实验：配置10％PAGE的分离胶和5％PAGE的浓缩胶。在收集的蛋白样品中加入适量浓缩(5X)的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃水浴加热5min，以充分变性蛋白。冷却到室温后，把蛋白样品直接上到SDS-PAGE胶加样孔内即可。上层胶浓缩胶时使用60V低电压恒压电泳；而下层分离胶时使用120V高电压恒压电泳。PVDF膜使用前放入甲醇中活化15s。转膜电流为200mA，转膜时间按照每1KD蛋白1.5min。转膜过程在冰浴中完成。转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的TBST中，漂洗30min，以洗去膜上的转膜液。加入5％脱脂奶粉，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60min。按照适当比例稀释一抗，加入一抗，4℃孵育过夜。TBST洗涤30min。加入二抗，室温孵育2h。TBST洗涤30min。结果如图4所示，未加王枣子乙素的对照组细胞胞质内几乎不含Cyto-C；加入2.5μM王枣子乙素作用，胞质中Cyto-C的含量升高；20μM王枣子乙素作用后，Cyto-C的含量进一步增多。说明王枣子乙素能使线粒体膜通透性发生改变，导致在正常状态下存在于线粒体中的Cyto-C从外流至胞质中。此结果与线粒体膜电位的下降的结果相一致。

测试例6

王枣子乙素对HepG2细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响：首先进行细胞蛋白的提取：处理组王枣子乙素终浓度分别为0、2.5、5和20μM。然后进行WesternBlot实验。结果如图5A至图5C所示，与对照组(0μM)相比，20μM王枣子乙素作用后，Bcl-2蛋白表达明显降低。对Bax蛋白的分析可以看出，在与各浓度王枣子乙素共培养12h后，Bax蛋白表达明显增加，说明王枣子乙素可以通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2，促进促凋亡蛋白Bax表达，诱导细胞凋亡。

测试例7

王枣子乙素对HepG2细胞经AV/PI染色的观察：取对数生长期的HepG2细胞，以2×10⁵个/mL的浓度接种在6孔板上，待细胞生长稳定后，分别加入0、2.5、5和20μM的王枣子乙素处理细胞，培养12h。用PBS洗涤细胞三次，在2000r/min的转速下离心5min，收集1×10⁵个细胞；用500μL的Binding Buffer重新悬浮细胞，每加入加入5μL AnnexinV-EGFP、5μLPropidium Iodide混合均匀，置于含5％CO₂，温度为37℃的恒温CO₂培养箱中继续培养15min，在1h内进行流式细胞仪的观察和检测：激发波长488nm，发射波长530nm。AnnexinV-EGFP的绿色荧光通道FITC通道(FL1)检测；PI红色荧光通过PI通道(FL3)检测。荧光补偿调节：使用未经凋亡诱导处理的正常细胞，作为对照组进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设置十字门位置。结果如图6A至图6D所示，2.5μM王枣子乙素作用HepG2细胞12h，早期凋亡细胞率为6.54％，晚期凋亡细胞率为2.56％；20μM王枣子乙素作用后，早期凋亡细胞率增加至15.11％，晚期凋亡细胞率为4.13％。表明在大剂量王枣子乙素应用后，王枣子乙素对细胞的损伤是由于细胞凋亡增加。

以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本发明的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本发明限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述教导做出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本发明的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本发明的保护范围意在由所附权利要求书及其等效形式所限定。

Claims

1.王枣子乙素在制备用于治疗肝癌的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述肝癌是原发性肝癌。

3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述原发性肝癌选自肝细胞癌和肝内胆管癌。

4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述肝癌是肝母细胞瘤。

5.根据权利要求1所述的用途，其中，所述肝癌是哺乳动物中的肝癌。

6.根据权利要求5所述的用途，其中，所述哺乳动物是人类。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中，所述药物通过破坏线粒体膜电位、造成Cyto-C外流、抑制抗凋亡蛋白Bcl-2，促进促凋亡蛋白Bax表达、引发Caspase级联反应诱导肝癌细胞凋亡以治疗肝癌。

8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述肝癌细胞是HepG2细胞。

9.王枣子乙素在制备用于促进人肝癌细胞凋亡的药物中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其中，所述肝癌细胞是HepG2细胞。