CN114558020B - 一种天然抗病毒液及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种天然抗病毒液及其制备方法和应用。本发明精选具有良好抗病毒活性的桃金娘酮和白桦脂酸，并对其进行协同配伍，或者具有良好抗病毒活性的桃金娘提取物和显齿蛇葡萄叶或者米碎花枝叶或者白桦树皮提取物，并对其进行协同配伍，再通过助溶剂助溶得到天然抗病毒液（可以制成喷剂或雾化液，该雾化液通过雾化机雾化后），具有抗流感病毒、普通冠状病毒、新型冠状病毒的活性。

Description

一种天然抗病毒液及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于抗病毒领域，具体涉及一种天然抗病毒液及其制备方法和应用。
背景技术
抗病毒喷剂的主要作用就是对抗病毒，目前临床上比较常用的利巴韦林喷剂，就是一种抗病毒喷剂。应用这种药物喷入口鼻、咽喉部位后，可以有效抑制流感病毒等RNA病毒，从而达到抑制病毒复制和传播的作用。这种药物对呼吸道合胞病毒、流感病毒、甲肝病毒、腺病毒等多种病毒都有一定的抑制作用。
雾化疗法是医学上的一种常见治疗手段，是指经过雾化后的药液随气流吸入直接达到病灶处，以起到抗病毒、消炎消肿、解除痉挛和祛痰止喘等效果，具有疗效好、副作用少和缩短病程等特点，广泛应用于呼吸系统类疾病，且根据药液与用量的不同，也可应用于日常保健中，如清除空气等环境中的细菌和病毒等。
然而，目前西药雾化液存在耐药性和毒副作用大的问题，而中药抗病毒液或雾化液存在质量参差不齐、提取效率低、活性成分雾化效率低等诸多问题。
发明内容
为解决目前存在的问题，本发明提供了一种具有抗流感病毒、普通冠状病毒、新型冠状病毒的、毒副作用小，品质稳定的天然抗病毒液及其制备方法和应用。
本发明的第一个目的是提供：抗病毒活性成分在制备抗病毒药物中的应用；
所述的抗病毒活性成分为以下任一类别中化合物或提取物或组合物：
A、桃金娘酮或其立体异构体、差向异构体、构型异构体或其药学上可以接受的盐、或它们的水合物；
所述的桃金娘酮的结构式如下所述：
Figure 940160DEST_PATH_IMAGE002
B、白桦脂酸或其立体异构体、差向异构体、构型异构体或其药学上可以接受的盐、或它们的水合物；
所述的白桦脂酸的结构式如下所述：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE003
C、桃金娘的部分，包括但不限于叶、茎、花、果、根或者全株的提取物，提取溶剂是水、乙醇或其水溶液、丙酮或其水溶液、甲醇或其水溶液、乙酸乙酯、正己烷等或者以上溶剂不同比例的混合物，或者以上提取物经过物理和化学方法浓缩、分配、富集、纯化的馏分或者部位；
D、显齿蛇葡萄叶、米碎花枝叶或者白桦树皮的部分，包括但不限于叶、茎、花、果、根或者全株的提取物，提取溶剂是水、乙醇或其水溶液、丙酮或其水溶液、甲醇或其水溶液、乙酸乙酯、正己烷等或者以上溶剂不同比例的混合物，或者以上提取物经过物理和化学方法浓缩、分配、富集、纯化的馏分或者部位；
E、A中一种或多种化合物和B中一种或多种化合物的组合物；或A中的一种或多种化合物和D中的一种或多种提取物的组合物；或B中的一种或多种化合物和C中的一种或多种提取物的组合物；或C中的一种或多种提取物和D中的一种或多种提取物的组合物。
优选，所述的类别C是将桃金娘整株粉粹，用乙醇或乙醇水溶液提取，提取液浓缩得乙醇提取物，将其悬浮于水中，用正己烷萃取，萃取部分经溶剂旋干得提取物1。
优选，所述的类别D是取显齿蛇葡萄藤茎粉粹，用水或乙醇水溶液提取，提取液浓缩至乙醇提取物，将其悬浮于水中，用正己烷萃取，萃取部分经溶剂旋干得提取物2。
优选，所述的乙醇水溶液是体积分数95%乙醇水溶液。
优选，所述的桃金娘酮和白桦脂酸按照质量比26:85混合而成的组合物在制备抗病毒药物中的应用。
优选，所述的提取物1和2按照质量比802:1924混合而成的组合物在制备抗病毒药物中的应用。
优选，所述的抗病毒药物是抗流感病毒、普通冠状病毒或新型冠状病毒SARS-CoV-2的药物。
优选，所述的抗病毒药物可以是抗病毒喷剂或抗病毒雾化液。
优选，所述的抗病毒喷剂还包括助溶剂，所述助溶剂包括亚甲基亚砜、PEG等助溶剂。本发明精选具有良好抗病毒活性的桃金娘酮和白桦脂酸，或进行协同配伍，或者具有良好抗病毒活性的桃金娘提取物和显齿蛇葡萄叶或者米碎花枝叶或者白桦树皮提取物，或进行协同配伍；再通过助溶剂助溶得到天然抗病毒液，具有抗流感病毒、普通冠状病毒、新型冠状病毒的活性。抗病毒活性成分在抗病毒喷剂中的含量可以是0.1%-100%。
优选，所述的抗病毒雾化液还包括助溶剂、基液。所述助溶剂包括亚甲基亚砜、PEG等助溶剂。所述基液包括丙二醇、水等雾化剂。本发明精选具有良好抗病毒活性的桃金娘酮和白桦脂酸，或进行协同配伍，或者具有良好抗病毒活性的桃金娘提取物和显齿蛇葡萄叶或者米碎花枝叶或者白桦树皮提取物，或进行协同配伍；再通过助溶剂助溶和雾化剂辅助，得到雾化液，该雾化液通过雾化机雾化后，收集雾化气雾进行抗病毒检测，具有抗流感病毒、普通冠状病毒、新型冠状病毒的活性。抗病毒活性成分在抗病毒雾化液中的含量可以是0.1%-100%。
进一步优选，所述的抗病毒喷剂或雾化液中桃金娘酮或提取物1，与白桦脂酸或提取物2的质量比为：1：1-80。更进一步所述的抗病毒喷剂中桃金娘酮 1mg/40ml和白桦脂酸4mg/40ml、或桃金娘酮 1mg/40ml和提取物2 80mg/40ml、或白桦脂酸4 mg/40ml和和提取物140 mg/40ml、或提取物1 40 mg/40ml和提取物2 80mg/40ml。
本发明还提供了一种抗病毒药物，其含有以下任一类化合物或提取物或组合物作为活性成分；
A、桃金娘酮或其立体异构体、差向异构体、构型异构体或其药学上可以接受的盐、或它们的水合物；
所述的桃金娘酮的结构式如下所述：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
B、白桦脂酸或其立体异构体、差向异构体、构型异构体或其药学上可以接受的盐、或它们的水合物；
所述的白桦脂酸的结构式如下所述：
Figure 899151DEST_PATH_IMAGE006
C、桃金娘的部分，包括但不限于叶、茎、花、果、根或者全株的提取物，提取溶剂是水、乙醇或其水溶液、丙酮或其水溶液、甲醇或其水溶液、乙酸乙酯、正己烷等或者以上溶剂不同比例的混合物，或者以上提取物经过物理和化学方法浓缩、分配、富集、纯化的馏分或者部位；
D、显齿蛇葡萄叶、米碎花枝叶或者白桦树皮的部分，包括但不限于叶、茎、花、果、根或者全株的提取物，提取溶剂是水、乙醇或其水溶液、丙酮或其水溶液、甲醇或其水溶液、乙酸乙酯、正己烷等或者以上溶剂不同比例的混合物，或者以上提取物经过物理和化学方法浓缩、分配、富集、纯化的馏分或者部位；
E、A中一种或多种化合物和B中一种或多种化合物的组合物；或A中的一种或多种化合物和D中的一种或多种提取物的组合物；或B中的一种或多种化合物和C中的一种或多种提取物的组合物；或C中的一种或多种提取物和D中的一种或多种提取物的组合物。
本发明精选具有良好抗病毒活性的桃金娘酮和白桦脂酸，并对其进行协同配伍，或者具有良好抗病毒活性的桃金娘提取物和显齿蛇葡萄叶或者米碎花枝叶或者白桦树皮提取物，并对其进行协同配伍，再通过助溶剂助溶得到天然抗病毒液（可以制成喷剂或雾化液，该雾化液通过雾化机雾化后），具有抗流感病毒、普通冠状病毒、新型冠状病毒的活性。
具体实施方式
以下实施例为本发明的一些举例，不应看作是对本发明的限定。
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1：从桃金娘科植物中分离获得桃金娘酮类化合物
1.1 植物材料
以桃金娘科桃金娘属植物桃金娘为实验原料，该植物在我国南部特别是岭南地区分布广泛。本实验的植物材料采自于江西省赣州市南康县（区）。植物标本现存放于中国科学院华南植物园天然产物与化学生物学研究实验室。
1.2 实验仪器与试剂
旋光数据采用 Perkin-Elmer 341 polarimeter (美国 Perkin-Elmer 公司) 测定。紫外光谱由 Perkin-Elmer Lambda 35 UV-vis spectrophotometer (美国 Perkin-Elmer 公司) 测定，溶剂为甲醇或氯仿。红外光谱由 Bruker Vertex 33 infraredspectrophotometer (德国 Bruker 公司) 测定，测定前需要压片。核磁共振氢谱、碳谱、DEPT-135 谱以及二维谱由 Bruker公司的BrukerAVIII500型超导核磁共振仪测定，TMS 为内标，δ 为 ppm，J为Hz。制备型 HPLC为L3000型 HPLC (北京创新通恒科技有限公司) ，色谱柱为C18柱 (ALLTIMAC1810U，250 nm×10 nm，3 mL/min)，并配有单波长紫外检测器。高分辨质谱由 Bruker 公司的 Bruker Bio TOFIIIQ mass spectrometer 测定。100~200、200~300、300~400 目硅胶和薄层色谱板由青岛谱科分离材料有限公司生产。MCI 凝胶(CHP20P, 75-150 mm) 由日本三菱化学公司生产。Sephadex LH-20 凝胶由瑞典Amersham生物科学公司生产。有机溶剂来自于上海化学材料有限公司。薄层色谱显色剂为 5%浓硫酸-乙醇溶液，有紫外吸收的化合物需要在紫外灯下观测。实验过程中所用的混合溶剂的配比皆为体积比。
1.3 获得提取物
对干燥桃金娘整株（根、茎、枝条、叶、花、果）进行充分粉粹（20 kg），用体积分数95%乙醇水溶液提取3次（30L × 3），合并的溶剂在减压下旋蒸，得到棕色糖浆状残余物为乙醇提取物1（2.5kg），将其悬浮于水中（1：1，重量比），用正己烷萃取（3 L × 3），萃取部分经溶剂旋干得正己烷部320g（提取物1）。
1.4 分离获得单体化合物
本实验选取桃金娘整株（根、茎、枝条、叶、花、果）的正己烷部-用尽量少的氯仿在拌样锅里溶解完全，之后用 500 g 硅胶 (80~100 目) 进行拌样，搅拌均匀，待溶剂挥发完全后干法上样，用正己烷-乙酸乙酯体系 10:1、5:1、 2:1、1:1、0:1 v/v 进行梯度洗脱，最后用甲醇冲柱，经过 TLC 薄层色谱检测后合并主点相同的流分，收集TLC检测（展开溶剂正己烷：乙酸乙酯=5:1 v/v）为紫外灯下显蓝色荧光；硫酸-乙醇显色剂作用下显橘红色的组分Fr. C，再经过 MCI 柱层析脱去色素，然后经过Sephadex LH-20 凝胶柱层析，以正己烷-乙酸乙酯体系 (8:1→1:1 v/v) 进行梯度洗脱，收集经TLC检测（展开溶剂正己烷：乙酸乙酯=5:1 v/v）为紫外灯下显蓝色荧光；硫酸-乙醇显色剂作用下显橘红色的部位Fr. C2。Fr.C2经过Sephadex LH-20 凝胶柱层析，以氯仿:甲醇 (1:1 v/v) 进行洗脱，得到化合物1。TLC 检测（展开溶剂正己烷：乙酸乙酯=4:1 v/v），化合物1的Rf为0.4。
化合物1为桃金娘酮，淡黄色针状晶体,易溶于氯仿;核磁数据：1H NMR (CDCl3,500 MHz): δH 6.12 (1H, s, H-5), 4.27 (1H, t, J = 5.6 Hz, H-9), 2.99 (3H, m,H-1'', H-2''), 2.28 (1H, dp, J = 13.3, 6.6 Hz, H-3'), 1.55, 1.43, 1.41, 1.37(each 3H, s, H-11, H-12, H-13, H-14), 0.98 (6H, d, J = 6.7, Hz, H-4', H-5'),0.87, 0.83 (each 3H, d, J = 6.0 Hz, H-3'', H-4''); 13C NMR (CDCl3, 125 MHz):δC 212.2 (C-3), 206.7 (C-1'), 198.3 (C-1), 167.5 (C-4a), 162.8 (C-8), 158.7(C-6), 155.7 (C-10a),114.3(C-9a), 107.7 (C-7), 106.4 (C-8a), 94.7 (C-5), 56.1(C-2), 53.2 (C-2'), 46.4 (C-4), 45.8(C-1''), 25.5 (C-9), 25.5 (C-2''), 25.2,25.1 (C-13, C-14), 24.7, 24.6 (C-11, C-12), 24.2 (C-3'), 23.5, 23.2 (C-3'',C-4''), 22.8，22.8 (C-4', C-5')。化合物1的结构式如下所示：
Figure 775840DEST_PATH_IMAGE008
实施例2：从葡萄科植物中分离获得白桦脂酸化合物
2.1 植物材料
植物材料采自于江西省赣州市大余县，为葡萄科蛇葡萄属显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata(Hand. -Mazz.) W. T. Wang。植物标本现存放于中国科学院华南植物园天然产物与化学生物学研究实验室。
2.2 实验仪器与试剂
同实施例1的1.2。
2.3 获得提取物
取显齿蛇葡萄藤茎20 kg，充分粉粹，用95%的乙醇室温浸泡3次，每次约3 d，合并滤液减压浓缩至浸膏约2kg。向浸膏中加入水形成悬浊液，然后用正己烷萃取，回收溶剂后得正己烷部160 g（提取物2）。
2.4 分离单体化合物
提取物2经硅胶（100~200目）柱层析，正己烷：丙酮（10:0→1:1 v/v）梯度洗脱，各组分浓缩后采用TLC板检测，合并主点相同组分得到Fr.1～Fr.3共三个组分。展开剂为正己烷：乙酸乙酯2：1，Rf值为0.61，在254nm紫外灯下无荧光，用香草醛-浓硫酸显色后成蓝点的Fr.2经硅胶（200~300目）柱层析，正己烷：丙酮（9:1→5:1 v/v）梯度洗脱，得到Fr.2.1～Fr.2.3三个亚组分，展开剂为正己烷：乙酸乙酯2：1，Rf值为0.61，在254nm紫外灯下无荧光，用香草醛-浓硫酸显色后成蓝点的组分Fr.2.2经Sephadex LH-20柱层析，氯仿：甲醇（1:1v/v）洗脱，得到Fr.2.2.1和Fr.2.2.2两个亚组分，展开剂为正己烷：乙酸乙酯2：1，Rf值为0.61，在254nm紫外灯下无荧光，用香草醛-浓硫酸显色后成蓝点的组分Fr.2.2.1重结晶得到化合物2 (11 mg)。
化合物2白色无定形粉末，易溶于氯仿，无紫外吸收，浓硫酸加热显紫红色，表明为三萜或甾体类化合物。ESI-MS负离子模式给出准分子离子峰m/z 455 [M-H]-，表明该化合物的分子量为456，结合核磁共振数据得到化合物分子式为C30H48O3。1H NMR (CDCl3, 400MHz)δ: 4.74 (1H, s, H-29), 4.61 (1H, s, H-29), 为烯氢质子信号；3.19 (1H, dd, J= 12.0, 4.0 Hz, H-3)，连氧次甲基质子信号；1.69 (3H, s, H-23), 0.98 (3H, s, H-24), 0.97 (3H, s, H-25), 0.94 (3H, s, H-26), 0.83 (3H, s, H-27), 0.76(3H, s,H-30)，为6个单峰甲基质子信号；13C NMR (CDCl3, 126 MHz)δ: 177.7 (C-28), 羰基碳信号；150.8 (C-20), 110.1 (C-29), 2个烯碳信号；77.2 (C-3), 连氧碳信号；化合物共含30个碳信号。根据以上信息判断该化合物为羽扇豆烷型三萜化合物白桦脂酸（betulinicacid），结构如下所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE009
实施例 3: 抗流感病毒活性检测
3.1 细胞和病毒的准备
狗肾细胞MDCK按照常规传代培养，调整细胞密度为2×104个/mL接种到96孔板中，待孔内细胞生长为完整单层备用。细胞培养液为含10%FBS、1%青链霉素混合液的DEME培养液，细胞维持液、病毒维持液为含3%FBS、1%青链霉素混合液的DEME培养液。
甲型流感病毒株A/WSN/33 (H1N1)接种于 MDCK单层细胞，37℃孵育 1 h，去掉上清，更换含有细胞维持液，等细胞发生 100%病变时，反复冻融三次，收集上清作为制备的种毒，TCID50测定病毒的效价。
TCID50的测定：96 孔板培养的 MDCK 单层细胞，移去上清，然后 PBS 洗涤两次，加上倍比稀释的 100 μL 病毒稀释液，每个稀释度设 8 个重复，37 ℃孵育 2 h，移去上清，PBS洗涤两次，加上 150 μL 病毒维持液。三天后，显微镜下观察病变计数病变孔，通过Reed-Muench 方法计算病毒滴度TCID50。
3.2 细胞毒性的测定
将样品（单体化合物初始浓度 20μg/mL, 提取物初始浓度 2000 μg/mL）用细胞维持液连续2倍倍比稀释后，加入到狗肾细胞MDCK长成单层的96孔培养板上，100 μL/孔，每个稀释度重复3孔，另设不加样品的细胞对照组，置5% CO2培养箱37 ℃培养72 h，每天观察记录细胞病变(CPE)情况。待培养到72h后，弃上清，用PBS缓冲液清洗2遍，每孔加入10 μLMTT，继续培养4 h后，用酶标仪测在450nm测定吸光度OD值。以CPE程度和所测得OD值为依据，计算药物致细胞的病变率，然后用软件Prism 8.0计算CC50，CC50是使得50%的细胞发生病变时的药物浓度。
3.3抗流感病毒活性检测
96 孔板中的 MDCK细胞长成单层后，吸去培养液，用 100*TCID50 病毒 100 μL 吸附细胞，37°C孵育 1h，洗去游离病毒，加入用细胞维持液倍比稀释的样品（单体化合物初始浓度 20μg/mL, 提取物初始浓度 2000 μg/mL）100 μL，每个稀释度重复 3 孔，同时设不加样品和病毒的细胞对照组、不加样品加病毒的病毒对照组，37 °C、5% CO2 继续培养，观察细胞病变，确定细胞病变是否为IAV 病毒引起的特异性病变，待病毒对照组CPE达到80%~90%时，结束试验，记录各孔CPE情况，按如上描述操作测定每孔OD450值，用以下公式计算样品对病毒的抑制率，然后用软件Prism 8.0计算EC50。
表1 样品抗A/WSN/33 (H1N1)病毒活性及细胞毒性
Figure 660620DEST_PATH_IMAGE010
实施例 4: 抗普通冠状病毒活性
4.1细胞和病毒的准备
人结肠癌细胞HRT-18培养在RPMI 1640培养液中，补充10%血清FBS，1%双抗PS，1%丙酮酸钠，1%NEAA非必须氨基酸，5% CO2培养箱37 ℃培养细胞生长至完全单层时，胰酶酶解，调整细胞密度为2×104个/mL接种到96孔板中，待孔内细胞生长为90%单层时备用。
人冠状病毒HCoV-OC43在HRT-18细胞中扩增，培养液为RPMI 1640培养液中，补充10%血清FBS，1%双抗PS，1%丙酮酸钠，1%NEAA非必须氨基酸，5% CO2培养箱33℃培养至50%细胞发生马蜂窝样病变。收集上清，根据Reed-Muench法测定病毒的半数组织细胞感染量TCID50，按终质量浓度100*TCID50用量使用。
4.2 细胞毒性检测
将待测样品（单体化合物初始浓度 20μg/mL, 提取物初始浓度 2000 μg/mL）用细胞维持液连续2倍倍比稀释后，加入到人结肠癌细胞HRT-18长成单层的96孔培养板上，100μL/孔，每个稀释度重复3孔，另设细胞对照组，置5% CO2培养箱37 ℃培养72 h，弃上清，用PBS缓冲液清洗2遍，每孔加入10 μL CKK-8，继续培养4 h后，用酶标仪测OD450。以所测得OD值为依据，计算药物致细胞的病变率，CC50是50%的细胞存活时的药物浓度（软件Prism 8.0计算CC50）。
4.3抗普通冠状病毒活性
96 孔板中的人结肠癌细胞HRT-18长成单层后，吸去培养液，用 100*TCID50 病毒100 μL 吸附细胞，37°C孵育 2h，洗去游离病毒，加入用细胞维持液倍比稀释的待测样品（单体化合物初始浓度 20μg/mL, 提取物初始浓度 2000 μg/mL）100 μL，每个稀释度重复3 孔，37 °C、5% CO2 继续培养48 h，去除上清，加入50 ul 4% PFA / PBS 固定15分钟, PBS清洗3次；加入50ul 免疫染色封闭缓冲液封闭 30分钟, PBS清洗3次； 50 ul 稀释1:200的一抗anti-OC43(cat # 40643-T62-200, Sino Biological)免疫染色1小时,用50 ulPBS清洗三次；50 ul 稀释1:400 的二抗anti-rabbit-AlexaFluor488染色 1小时, 用50ul PBS三次。用酶标仪检测荧光OD值（Ex/Em=488/538），用以下公式计算样品对病毒的抑制率，然后用软件Prism 8.0计算EC50。
表2 样品抗HCoV-OC43病毒活性及细胞毒性
Figure DEST_PATH_IMAGE011
实施例5 样品抗新型冠状病毒SARS-CoV-2活性分析
5.1 细胞和病毒
非洲绿猴肾细胞Vero-E6 按照常规传代培养，调整细胞密度为1×105个/mL接种到96孔板中，待孔内细胞生长为完整单层备用。新型冠状病毒SARS-CoV-2为中国科学院武汉病毒研究所保存的病毒。细胞培养液为含10%FBS、1%青链霉素混合液的DEME培养液，细胞维持液、病毒维持液为含2%FBS、1%青链霉素混合液的DEME培养液。
5.2 样品细胞毒性的测定
将样品（单体化合物初始浓度 20μg/mL, 提取物初始浓度 2000 μg/mL）用细胞维持液连续2倍倍比稀释后，加入到非洲绿猴肾细胞Vero-E6长成单层的96孔培养板上，100 μL/孔，每个稀释度重复3孔，另设不加样品的细胞对照组，置5% CO2培养箱37 ℃培养72 h，每天观察记录细胞病变(CPE)情况。待培养到72h后，弃上清，用PBS缓冲液清洗2遍，每孔加入20 μL MTT，继续培养4 h后，弃MTT上清，每孔加入150 μL DMSO, 震荡5-10 min，待结晶完全溶解后用酶标仪测OD570。以CPE程度和所测得OD值为依据，计算药物致细胞的病变率，CC50是使得50%的细胞发生病变时的药物浓度。
5.3 样品对新型冠状病毒SARS-CoV-2病毒复制的抑制作用
24 孔板中的 Vero E6细胞长成单层后，吸去培养液，并添加各种浓度（0，0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10 μM）的样品后，用0.01 MOI 的SARS-CoV-2感染细胞。感染后24小时后，从每个孔的上清液中提取病毒总RNA，并通过实时定量荧光PCR（qRT-PCR）确定病毒的产量，以计算病毒抑制率以及药物的EC50（半数有效浓度）。具体而言，使用带有探针5'-FAM-tggttgacctacacaggtgccatca-BHQ1-3'的引物ORF1ab-F（5'-ccctgtgggttttacacttaa-3'）和ORF1ab-R（5'-acgattgtgcatcagctga-3'）引物用于检测ORF1ab的表达量。最后结合药物的细胞毒性计算出选择指数SI=CC50/EC50。
表3 样品抗SARS-CoV-2病毒活性及细胞毒性
Figure 927653DEST_PATH_IMAGE012
-表示没有检测到
实施例6：协同抗病毒研究作用研究
使用Bliss独立模型体外研究提取物1和2，化合物1和2分别联合对流感病毒、冠状病毒HCoV-OC43、SARS-CoV-2的协同作用。以化合物1和2协同作用抗HCoV-OC43为例，96 孔板中的HRT-18细胞长成单层后，吸去培养液，用 100*TCID50 病毒 100 μL 吸附细胞，37°C孵育 2h，洗去游离病毒，加入用病毒维持液稀释的待测样品 100 μL，待测样品分为3组：A，亚抑制浓度的化合物1（0.26 µg/mL）、B，亚抑制浓度的化合物2（0.85 µg/mL）、C，同时添加亚抑制浓度的化合物1（0.26 µg/mL）和2（0.85 µg/mL）, 每组待测样品重复 8 孔，37 °C、5% CO2 继续培养48 h，去除上清，加入50 ul 4% PFA / PBS 固定15分钟, PBS清洗3次；加入50ul 免疫染色封闭缓冲液封闭 30分钟, PBS清洗3次； 50 ul 稀释1:200 的一抗anti-OC43(cat # 40643-T62-200, Sino Biological)免疫染色1小时,用50 ul PBS清洗三次；50 ul 稀释1:400 的二抗anti-rabbit-AlexaFluor488染色 1小时, 用50 ul PBS三次。用酶标仪检测荧光OD值（Ex/Em=488/538）。
提取物1和2时，待测样品分为3组：A，提取物1（8.02µg/mL）、B，提取物2（19.24 µg/mL）、C，同时添加提取物1（8.02µg/mL）和2（19.24µg/mL），实验方法参照化合物1和2。化合物1（0.26 µg/mL）和提取物2（19.24 µg/mL），化合物2（0.85 µg/mL）和提取物1（8.02µg/mL），按照相同的方法进行测试。
协同作用（S）使用下式计算：S =（OD1/OD0）（OD2/OD0）-（OD12/OD0）。参数OD12指同时存在1和2的情况下的荧光OD值；参数OD1和OD2分别指仅存在1种化合物存在的情况下荧光OD值；参数OD0是指在不存在药物的情况下的荧光OD值。协同度（S）值对应于以下截止值：零表示中性，高于零（正值）表示协同作用，低于零（负值）表示拮抗作用。具有较高正值的药物组合代表高度的协同作用。
表4.协同抗病毒研究（s）
Figure DEST_PATH_IMAGE013
根据表4结果显示，化合物1和2之间，化合物1和提取物2之间，化合物2和提取物1之间，提取物1和2之间都具有显著的协同抗病毒作用。化合物1和2，化合物1和提取物2，化合物2和提取物1，提取物1和2配伍使用，可以进一步提高抗病毒效果，减少样品用量。
实施例7 样品在抗病毒喷剂中的应用和抗病毒效果评价
将上述提取物1和提取物2，或者单体化合物1和单体化合物2按照一定的比例混合，加入少量的二甲基亚砜和PEG400溶解，用丙二醇和水定容，混合均匀，得到抗病毒喷剂（表5）。
表 5 抗病毒喷剂配方表
Figure 188870DEST_PATH_IMAGE014
实施例8：
一种具有抗病毒功效的天然抗病毒喷剂的评价和使用方法，包括如下步骤：
将实施例7的抗病毒喷剂以1%的比例（v/v）添加到感染了病毒的96孔板细胞中进行抗病毒检测。抗流感病毒检测参照实施例3，抗普通冠状病毒检测参照实施例4，抗新型冠状病毒检测参照实施例5。结果如下：
表 6 各组方抗病毒喷剂抗病毒活性
Figure DEST_PATH_IMAGE015
根据检测结果确定添加量，以0.1%-100%的比列添加到雾化产品中。
实施例9 样品在雾化液中的应用和抗病毒效果评价
将上述提取物1和提取物2，或者单体化合物1和单体化合物2按照一定的比例混合（表7），加入少量的二甲基亚砜和PEG400溶解，用丙二醇和水定容，搅拌均匀，得到雾化液。
表 7 雾化液配方表
Figure 409812DEST_PATH_IMAGE016
实施例10 一种具有抗病毒功效的中药雾化液的评价和使用方法，包括如下步骤：
将雾化液通过雾化机形成喷泉和烟雾，将烟雾收集得到待检测的雾化液。将雾化液以1%的比例添加到感染了病毒的96孔板细胞中进行抗病毒检测。抗流感病毒检测参照实施例3，抗普通冠状病毒检测参照实施例4，抗新型冠状病毒检测参照实施例5。结果如下：
表 8 各组方雾化液抗病毒活性
Figure DEST_PATH_IMAGE017
根据检测结果确定添加量，以0.1%-100%的比列添加到雾化产品中。

Claims (5)

1.抗病毒活性成分在制备抗病毒药物中的应用；
所述的抗病毒活性成分是由白桦脂酸或其药学上可以接受的盐，和桃金娘酮或其药学上可以接受的盐组成：
所述的白桦脂酸的结构式如下所述：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
所述的桃金娘酮的结构式如下所述：
Figure 980236DEST_PATH_IMAGE002
所述的抗病毒药物是抗流感病毒、普通冠状病毒或新型冠状病毒SARS-CoV-2的药物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的桃金娘酮和白桦脂酸按照质量比26:85组成的组合物在制备抗病毒药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗病毒药物是抗病毒喷剂或雾化液。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的抗病毒药物中含桃金娘酮 1mg/40ml和白桦脂酸4 mg/40ml。
5.一种抗病毒药物，其特征在于，所述的抗病毒药物由白桦脂酸或其药学上可以接受的盐，和桃金娘酮或其药学上可以接受的盐组成：
所述的白桦脂酸的结构式如下所述：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
所述的桃金娘酮的结构式如下所述：
Figure 694114DEST_PATH_IMAGE004
所述的抗病毒药物是抗流感病毒、普通冠状病毒或新型冠状病毒SARS-CoV-2的药物。
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