CN115626906B - 一种高纯度桃金娘酮的工业化提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高纯度桃金娘酮的工业化提取方法。将桃金娘进行干燥、粉碎、挤压成型，制成易于亚临界提取或超临界提取生产操作的桃金娘颗粒；桃金娘颗粒进行低温超临界(亚临界)丁烷提取工艺处理，提取出低极性浸膏O1，残余部分为脱油桃金娘颗粒DO1；脱油桃金娘颗粒DO1采用二氯甲烷进一步提取，用冰乙酸沉淀胶质，溶剂层调pH值至中性或弱碱性后分液，溶剂层脱水后，浓缩回收二氯甲烷后得到浸膏；以浸膏为原料，用洗脱剂体积比正己烷：乙酸乙酯＝90‑99:10‑1溶解后泵入半连续循环硅胶层析系统，收集分离度高的桃金娘单色谱峰，当检测到混合峰时，维持其在层析系统内流动，继续循环分离，如此周而复始，获得桃金娘酮馏分，经重结晶法得高纯度桃金娘酮。

Description

一种高纯度桃金娘酮的工业化提取方法

技术领域：

本发明属于植物提取成分应用领域，具体涉及一种高纯度桃金娘植物活性成分桃金娘酮的工业化提取方法。

背景技术：

桃金娘酮(Rhodomyrtone)为酰基间苯三酚类化合物，是药用植物桃金娘(Rhodomyrtus tomentosa)中的主要化学成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗病毒等药理作用。广泛应用于食品防腐剂、化妆品领域以及医药领域。

桃金娘酮的分子式为C₂₆H₃₄O₆，化学名称为6,8-二羟基-7-(3-甲基丁酰基)-9-异丁基-2,2,4,4-四甲基-4,9-二氢-1-氢-氧杂蒽-1,3(2-氢)-二酮，为淡黄色粉固体，易溶于氯仿、甲醇等有机溶剂，可以通过天然化合物提取纯化和合成的方法得到。由于目前桃金娘酮的合成方法的合成路线长、总产率低、残留物不明确等因素使其难以规模化生产。而常规的提取方法因其提取周期长难以满足市场的需求。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种适于工业化实施的从桃金娘中提取利用桃金娘酮的方法，即一种桃金娘酮的工业化提取方法。

本发明的桃金娘酮的工业化提取方法，包括以下步骤：

A、桃金娘挤压成型：将桃金娘进行干燥、粉碎、挤压成型，制成易于亚临界提取或超临界提取生产操作的桃金娘颗粒；

B、桃金娘颗粒的低温脱油：桃金娘颗粒进行低温超临界(亚临界)丁烷提取工艺处理，提取出低极性浸膏O1，残余部分为脱油桃金娘颗粒DO1；

C、二氯甲烷提取桃金娘酮：脱油桃金娘颗粒DO1采用二氯甲烷进一步提取，用冰乙酸沉淀胶质，溶剂层调pH值至中性或弱碱性后分液，溶剂层脱水后，浓缩回收二氯甲烷后得到浸膏；

D、半连续循环层析工艺纯化桃金娘酮：以浸膏为原料，用洗脱剂体积比正己烷：乙酸乙酯＝90-99:10-1溶解后泵入半连续循环硅胶层析系统，收集分离度高的桃金娘单色谱峰，当检测到混合峰时，维持其在层析系统内流动，继续循环分离，如此周而复始，实现半连续进料、洗脱杂质和收集桃金娘酮的程序化过程，由此获得桃金娘酮馏分(HPLC≥80％)。

E、含桃金娘酮馏分经重结晶法得高纯度桃金娘酮。

优选，所述的步骤A的桃金娘颗粒大小控制在直径3mm，长度5-15mm，颗粒的含水率控制在10％以下，有利于提高溶剂渗透提取率。

进一步优选，所述的步骤A的桃金娘为夏秋季节的桃金娘地上部分。

优选，所述的步骤B为桃金娘颗粒在0.6MPa，50℃条件下进行低温超临界(亚临界)丁烷提取工艺处理，以20分钟每次的周期连续提取3-8次，提取出低极性浸膏O1，残余部分为脱油桃金娘颗粒DO1。

通过过程压力(P)、温度(T)和提取时间(t)的控制，可以使LAW1原料中所含有的挥发油95％以上进入到O1部分，而桃金娘酮99％以上保留在DO1中。

优选，所述的步骤C的溶剂层调pH值至中性或弱碱性后分液是用质量分数1％氢氧化钠溶液调pH值。

优选，所述的步骤D为：

建立层析系统：所述的层析系统是由第一平流泵、第一通阀、第一不锈钢填充柱、第二不锈钢填充柱、第二平流泵、DAD检测器、第二通阀、第一单向阀、第三不锈钢填充柱、第三通阀、第四不锈钢填充柱、ELSD检测器、第四通阀、第二单向阀和第一通阀通过管道顺序相连，第三通阀还连有第三平流泵，不锈钢填充柱中填充硅胶；

以浸膏为原料，用洗脱剂按体积比正己烷：乙酸乙酯＝90-99:10-1溶解后通过第一平流泵泵入循环硅胶层析系统中，经过第一和第二不锈钢填充柱中的色谱柱分离后，通过DAD检测器确认的所有不含桃金娘酮的洗脱液均作为杂质从第二通阀的洗脱口排出，接近桃金娘酮流经时间时，无法确认是否含有桃金娘酮的混合洗脱液和确认含有桃金娘酮的洗脱液继续在系统内循环，继续经第三不锈钢填充柱中的色谱柱分离，按杂质排出体积通过第三平流泵补充相同体积的新鲜洗脱剂，混合流体继续进入第四不锈钢填充柱中的色谱柱分离；从第四不锈钢填充柱流出的洗脱液经过ELSD检测器时，根据分离度，收集分离度高的单色谱峰，其中，确认为桃金娘酮的馏分作为目标物收集，不是桃金娘酮的馏分就作为杂质收集；当检测到混合峰时，维持其在色谱通道流动，继续循环分离；并进行下一轮进料，周而复始，实现半连续进料、洗脱杂质和收集桃金娘酮的程序化过程，最终收集到桃金娘酮。

优选，下一轮进料的体积与本轮ELSD检测器后收集和排出的总体积保持相等，并且进料的时间与ELSD检测器后循环的混合成分洗脱液保持同步。

优选地，所述的洗脱剂是正己烷：乙酸乙酯＝95:5～96:4v/v，以此混合溶剂为洗脱剂几乎完全分离出桃金娘酮，桃金娘酮馏分含量≥80％。

优选，所述的步骤E为：

含桃金娘酮馏分用二氯甲烷加热至完全溶解，然后加入1倍量的甲醇置于室温中静置结晶，待溶剂挥发完全，使用正己烷：二氯甲烷＝5:1v/v混合溶剂洗涤，得到高纯度的桃金娘酮(HPLC≥95％)。

本发明的有益效果是：

半连续循环层析工艺具有分离效率高，溶剂用量少的明显优势。在天然桃金娘酮分离制备的工业化提取中证明这是一种分离天然低丰度化合物的高效方法。该工艺方案截至目前，尚未见文献报道，具有重要的工业化技术价值。

附图说明

图1是桃金娘酮提取技术路线示意图；

图2是二氯甲烷提取物DCM1高效液相色谱图；

图3是用于桃金娘酮制备的半连续循环液相层析系统；

图4是过程取样的高效液相色谱图(作为桃金娘酮收集)；

图5是收集到的某杂质的高效液相色谱图(不含桃金娘酮，作为杂质排出系统)；

图6是收集到的某杂质的高效液相色谱图(不含桃金娘酮，作为杂质排出系统)；

图7是收集到的某杂质的高效液相色谱图(不含桃金娘酮，作为杂质排出系统)；

图8是过程取样的高效液相色谱图(含有桃金娘酮和杂质，保留在系统中)；

图9是过程取样的高效液相色谱图(含有桃金娘酮和杂质，保留在系统中)；

图10是过程取样的高效液相色谱图(含有桃金娘酮和杂质，保留在系统中)。

图11为本发明桃金娘酮的¹H-NMR核磁谱图。

图12为本发明桃金娘酮的¹³C-NMR核磁谱图；

图13为高纯度桃金娘酮HPLC图。

具体实施方式

下面对本发明的技术方案作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所述的任何变换和替换，均属于本发明的保护范围。

本发明的桃金娘酮提取技术路线如图1所示，下面就此进行详细阐述。

实施例1.桃金娘挤压成型

采集夏秋季节的桃金娘地上部分10000千克，预先进行晾晒干燥，然后，使用植物粉碎机将干叶枝条粉碎至60目-300目。粉碎筛分后采用通用饲料颗粒机(制粒孔径3mm)将粉末连续挤压制成易于亚临界提取生产操作的桃金娘叶颗粒LAW1，制得颗粒直径3mm，长度5-15mm。为了提高溶剂渗透提取率，颗粒的含水率控制在10％以下。最后得到桃金娘颗粒9845千克。

实施例2.桃金娘颗粒的低温脱油

将实施例1获得的9845千克桃金娘颗粒LAW1颗粒在0.6MPa，50℃条件下进行亚临界丁烷提取，以20分钟每次的周期连续提取5-8次，提取出低极性精油和油脂部分O1共计610.39千克，浸膏得率6.2％。残余9233千克脱油桃金娘颗粒DO1。通过过程压力(P)、温度(T)和提取时间(t)的控制，可以使LAW1原料中所含有的挥发油95％以上进入到O1部分，而桃金娘酮99％以上保留在DO1中。

实施例3.二氯甲烷提取，冰乙酸去除胶质沉淀

将上述实施例所得的脱油桃金娘颗粒DO1进一步用各种溶剂进行提取，本部分首先研究对比了各种溶剂的常温超声30min/次的多次提取率和最终所获得的浸膏的桃金娘酮含量。

提取率值以同一批次颗粒粉化后分别取样50g同时进行提取操作的测定为准，以离心过滤后滤液质量与测定桃金娘酮含量与50g颗粒样品中桃金娘总含量(以多种溶剂5次提取最高值为总含量)的比率计算，每次提取的料液比为1:20g/ml。

表1各种溶剂提取桃金娘破壁提取率和浸膏含量

从表1中数据和图2可以看出，二氯甲烷提取率虽然不及乙醇，但是其提取物的含量相对乙醇而言高出许多。另一方面，正己烷显示出很高的选择性，然而，由于其提取率非常低，所以意味着需要非常大量的溶剂才能进行工业意义的提取，因此，综合各方面的因素，最终选择了二氯甲烷作为桃金娘酮的提取溶剂并进行有关的中试提取。由此可见得到桃金娘酮含量为1-2％含量的浸膏，优于乙酸乙酯、乙醇、正己烷等其它常用溶剂，并且桃金娘酮桃金娘酮提取率可达95％以上。

2吨桃金娘颗粒DO1使用二氯甲烷进行浸提，最终获得桃金娘二氯甲烷提取物(浓缩液)DCM1总重量为199.2千克(固含量51％)，取样挥干测定桃金娘酮含量为0.89％。将199.2千克DCM1提取物(浓缩液)用二氯甲烷溶剂稀释至固含量20％，稀释后溶液重量为507.9千克。然后用冰乙酸4.5千克混合搅拌20分钟后，静置24小时，弃去沉淀胶质后，溶剂层用1％浓度的氢氧化钠水溶液洗涤至中性或弱碱性后分液，溶剂层用无水硫酸钠脱水后进入单效蒸发器，回收溶剂，得浸膏41.2千克，取样测定，浸膏桃金娘酮含量达到2.13％。

实施例4.半连续循环液相层析分离纯化制备桃金娘酮

中试规模的层析系统使用3台200ml/min平流泵、4根长度为800mm，内直径为的不锈钢填充柱1(填充600-800目层析硅胶)、1组DAD(二极管整列检测器)、1组ELSD(蒸发光散射检测器)、两个单向阀2和四个4通阀3组成搭建了如图3所示的中型半连续循环层析系统。两个检测器均与计算机色谱工作站连接。

具体结构和连接关系是：

第一平流泵11、第一通阀5、第一不锈钢填充柱1、第二不锈钢填充柱2、第二平流泵12、DAD检测器、第二通阀6、第一单向阀9、第三不锈钢填充柱3、第三通阀7、第四不锈钢填充柱4、ELSD检测器、第四通阀8、第二单向阀10和第一通阀5通过管道顺序相连，第三通阀还连有第三平流泵13。

首先，将30kg上述实施例中的浸膏用360kg洗脱液(正己烷：乙酸乙酯＝90-99:10-1)复溶，制备成进料液。然后，通过第一平流泵间歇向循环层析系统供料。经过第一段和第二段色谱柱(即第一不锈钢填充柱和第二不锈钢填充柱中的硅胶层析)分离后，通过DAD检测器(二极管整列检测器)确认的所有不含桃金娘酮的洗脱液均作为杂质从第二通阀的洗脱口排出(排出大部分杂质)。接近桃金娘酮流经时间时，无法确认是否含有桃金娘酮的混合洗脱液和确认含有桃金娘酮的洗脱液继续在系统内循环，继续进行第三段色谱柱(第三不锈钢填充柱的硅胶)分离；按杂质排出体积通过第三平流泵13补充相同体积的新鲜洗脱剂，混合流体继续进入第四段色谱柱(第四不锈钢填充柱中的硅胶)；从第四段色谱柱流出的洗脱液经过ELSD检测器时，根据分离度，收集分离度高的单色谱峰(收集进行HPLC确认定性，图4)，其中，确认为桃金娘酮的馏分作为目标物收集，不是桃金娘酮的馏分就作为杂质收集(用于其它研究)；当检测到混合峰时，维持其在色谱通道流动，继续循环分离。下一轮进料的体积与本轮ELSD检测器后收集(排出)的总体积保持相等(通过第一平流泵补充)，并且进料的时间与ELSD检测器后循环的混合成分洗脱液保持同步。周而复始，实现半连续进料、洗脱杂质和收集桃金娘酮(目标化合物)的程序化过程。

图4是过程取样的高效液相色谱图(作为桃金娘酮收集)；图5是收集到的某杂质的高效液相色谱图(不含桃金娘酮，作为杂质排出系统)；图6是收集到的某杂质的高效液相色谱图(不含桃金娘酮，作为杂质排出系统)；图7是收集到的某杂质的高效液相色谱图(不含桃金娘酮，作为杂质排出系统)；图8是过程取样的高效液相色谱图(含有桃金娘酮和杂质，保留在系统中)；图9是过程取样的高效液相色谱图(含有桃金娘酮和杂质，保留在系统中)；图10是过程取样的高效液相色谱图(含有桃金娘酮和杂质，保留在系统中)。

表3四周期桃金娘酮中试循环层析试验(20210907)

20210907#试验，循环运行4周期，总运行时间1.6h，处理原料2000ml，分离得到桃金娘酮(以纯物质计)3957mg。

表4四周期桃金娘酮中试循环层析试验(20210911)

20210911#试验，循环运行4周期，总运行时间2.7h，总处理物料8000ml，分离得到桃金娘酮(以纯物质计)15992mg。

表5八周期桃金娘酮中试循环层析试验(20210926)

20210926#试验，循环运行8周期，总运行时间5.5h，总处理物料16000ml，分离得到桃金娘酮(以纯物质计)30396mg。

表6八周期桃金娘酮中试循环层析试验(20220122)

20220122#试验，循环运行8周期，总运行时间5.8h，总处理物料24000ml，分离得到桃金娘酮(以纯物质计)49691mg。

在2021年9月至2022年2月期间，共在中试装置上进行循环分离层析试验26次，中试分离制备桃金娘酮4306g(以纯品计)，合并后干燥，测定其平均纯度为82.76％。

实施例5.重结晶法得高纯度桃金娘酮

称取上述实施例获得的桃金娘酮固体116.84g，用适量的二氯甲烷加热至完全溶解，然后加入1倍量的甲醇置于室温中静置结晶，待溶剂挥发完全，使用正己烷：二氯甲烷＝5:1v/v混合溶剂洗涤三遍，得到高纯度的桃金娘酮(HPLC测定，纯度98％，图13)，其核磁数据如下和图11和12所示。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃):δ_H 13.40(1H,s,OH),8.22(1H,s,OH),6.20(1H,s,H-5),4.30(1H,s,9-H),3.01(2H,m,J＝3Hz,H-2'),2.30(1H,m,J＝2.30Hz,H-3'),1.57(3H,s,4-CH₃),1.46(3H,s,4-CH₃),1.43(3H,s,2-CH₃),1.40(3H,s,2-CH₃),0.90(6H,d,J＝1.01Hz,H-3,H-4'),0.85(6H,dd,J＝0.9Hz,H-3",H-4")；

¹³C NMR(125MHz,CDCl₃):δ_C 212.2(C-3),206.8(C-1'),198.6(C-1),167.7(C-4a),162.9(C-8),158.8(C-6),155.7(C-10a),114.4(C-9a),107.7(C-7),106.3(C-8a),94.8(C-5),56.1(C-2),53.2(C-2'),47.3(C-4),45.8(C-1"),25.3(C-9),25.2(C-3'),25.1(C-2"),24.8,24.6(×2)and 24.2(Me(2)×2,Me(4)×2),23.6(2"-Me),23.2(3'-Me),22.8(3'-Me),22.7(2"-Me)。

Claims (7)

1.一种桃金娘酮的工业化提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、桃金娘挤压成型：将桃金娘进行干燥、粉碎、挤压成型，制成易于亚临界提取或超临界提取生产操作的桃金娘颗粒；

B、桃金娘颗粒的低温脱油：桃金娘颗粒进行低温超临界（亚临界）丁烷提取工艺处理，提取出低极性浸膏O1，残余部分为脱油桃金娘颗粒DO1；

C、二氯甲烷提取桃金娘酮：脱油桃金娘颗粒DO1采用二氯甲烷进一步提取，用冰乙酸沉淀胶质，溶剂层调pH值至中性或弱碱性后分液，溶剂层脱水后，浓缩回收二氯甲烷后得到浸膏；

D、半连续循环层析工艺纯化桃金娘酮：以浸膏为原料，用洗脱剂体积比正己烷：乙酸乙酯=90-99:10-1溶解后泵入半连续循环硅胶层析系统，收集分离度高的桃金娘单色谱峰，当检测到混合峰时，维持其在层析系统内流动，继续循环分离，如此周而复始，实现半连续进料、洗脱杂质和收集桃金娘酮的程序化过程，由此获得桃金娘酮；

E、含桃金娘酮馏分经重结晶法得桃金娘酮；

所述的步骤B为桃金娘颗粒在0.6MPa，50℃条件下进行低温超临界（亚临界）丁烷提取工艺处理，以20分钟每次的周期连续提取3-8次，提取出低极性浸膏O1，残余部分为脱油桃金娘颗粒DO1；

所述的步骤D为：

建立层析系统：所述的层析系统是由第一平流泵、第一通阀、第一不锈钢填充柱、第二不锈钢填充柱、第二平流泵、DAD检测器、第二通阀、第一单向阀、第三不锈钢填充柱、第三通阀、第四不锈钢填充柱、ELSD检测器、第四通阀、第二单向阀和第一通阀通过管道顺序相连，第三通阀还连有第三平流泵，不锈钢填充柱中填充硅胶；

以浸膏为原料，用洗脱剂按体积比正己烷：乙酸乙酯=90-99:10-1溶解后通过第一平流泵泵入循环硅胶层析系统中，经过第一和第二不锈钢填充柱中的色谱柱分离后，通过DAD检测器确认的所有不含桃金娘酮的洗脱液均作为杂质从第二通阀的洗脱口排出，接近桃金娘酮流经时间时，无法确认是否含有桃金娘酮的混合洗脱液和确认含有桃金娘酮的洗脱液继续在系统内循环，继续经第三不锈钢填充柱中的色谱柱分离，按杂质排出体积通过第三平流泵补充相同体积的新鲜洗脱剂，混合流体继续进入第四不锈钢填充柱中的色谱柱分离；从第四不锈钢填充柱流出的洗脱液经过ELSD检测器时，根据分离度，收集分离度高的单色谱峰，其中，确认为桃金娘酮的馏分作为目标物收集，不是桃金娘酮的馏分就作为杂质收集；当检测到混合峰时，维持其在色谱通道流动，继续循环分离；并进行下一轮进料，周而复始，实现半连续进料、洗脱杂质和收集桃金娘酮的程序化过程，最终收集到桃金娘酮馏分；

所述的桃金娘酮，其结构式如下所示：

。

2.根据权利要求1所述的桃金娘酮的工业化提取方法，其特征在于，所述的步骤A的桃金娘颗粒大小控制在直径3mm，长度5-15mm，颗粒的含水率控制在10%以下。

3.根据权利要求1或2所述的桃金娘酮的工业化提取方法，其特征在于，所述的步骤A的桃金娘为夏秋季节的桃金娘地上部分。

4.根据权利要求1所述的桃金娘酮的工业化提取方法，其特征在于，所述的步骤C的溶剂层调pH值至中性或弱碱性后分液是用质量分数1%氢氧化钠溶液调pH值。

5.根据权利要求1所述的桃金娘酮的工业化提取方法，其特征在于，下一轮进料的体积与本轮ELSD检测器后收集和排出的总体积保持相等，并且进料的时间与ELSD检测器后循环的混合成分洗脱液保持同步。

6.根据权利要求1或5所述的桃金娘酮的工业化提取方法，其特征在于，所述的洗脱剂是正己烷：乙酸乙酯=95:5 ~96:4 v/v。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含桃金娘酮馏分经重结晶法得桃金娘酮是含桃金娘酮馏分用二氯甲烷加热至完全溶解，然后加入1倍量的甲醇置于室温中静置结晶，待溶剂挥发完全，使用正己烷：二氯甲烷=5:1 v/v混合溶剂洗涤，得到桃金娘酮。