CN114948936A - 一种天然抗病毒雾化液及其制备方法和应用 - Google Patents

一种天然抗病毒雾化液及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种天然抗病毒雾化液及其制备方法和应用。本发明精选具有良好抗病毒活性的桃金娘酮和二氢杨梅素，并对其进行协同配伍，或者具有良好抗病毒活性的桃金娘提取物和显齿蛇葡萄提取物，并对其进行协同配伍，再通过助溶剂助溶得到天然抗病毒液(可以制成喷剂或雾化液，该雾化液通过雾化机雾化后)，具有抗流感病毒、普通冠状病毒、新型冠状病毒的活性。

Description

一种天然抗病毒雾化液及其制备方法和应用
技术领域：
本发明属于抗病毒领域，具体涉及一种天然抗病毒雾化液及其制备方法和应用。
背景技术：
抗病毒喷剂的主要作用就是对抗病毒，目前临床上比较常用的利巴韦林喷剂，就是一种抗病毒喷剂。应用这种药物喷入口鼻、咽喉部位后，可以有效抑制流感病毒等RNA病毒，，从而达到抑制病毒复制和传播的作用。这种药物对呼吸道合胞病毒、流感病毒、甲肝病毒、腺病毒等多种病毒都有一定的抑制作用。
雾化疗法是医学上的一种常见治疗手段，是指经过雾化后的药液随气流吸入直接达到病灶处，以起到抗病毒、消炎消肿、解除痉挛和祛痰止喘等效果，具有疗效好、副作用少和缩短病程等特点，广泛应用于呼吸系统类疾病，且根据药液与用量的不同，也可应用于日常保健中，如清除空气等环境中的细菌和病毒等。
然而，目前西药雾化液存在耐药性和毒副作用大的问题，而中药抗病毒液或雾化液存在质量参差不齐、提取效率低、活性成分雾化效率低等诸多问题。
发明内容：
为解决目前存在的问题，本发明提供了一种具有抗流感病毒、普通冠状病毒、新型冠状病毒的、毒副作用小，品质稳定的天然抗病毒雾化液及其制备方法和应用。
本发明的第一个目的是提供：抗病毒活性成分在制备抗病毒药物中的应用；
所述的抗病毒活性成分为以下任一类别中化合物或提取物或组合物：
A、二氢杨梅素或其立体异构体、差向异构体、构型异构体或其药学上可以接受的盐、或它们的水合物；
所述的二氢杨梅素的结构式如下所述：
Figure BDA0003627897040000021
B、A中一种或多种化合物和a1中一种或多种化合物的组合物；所述的a1是桃金娘酮或其立体异构体、差向异构体、构型异构体或其药学上可以接受的盐、或它们的水合物；
所述的桃金娘酮的结构式如下所述：
Figure BDA0003627897040000022
C、A中一种或多种化合物和a2中一种或多种提取物的组合物；
所述的a2是桃金娘的叶、茎、花、果、根或者其他部位、或者全株的提取物，提取溶剂是水、乙醇或其水溶液、丙酮或其水溶液、甲醇或其水溶液、乙酸乙酯、正己烷或者以上溶剂不同比例的混合物，或者以上提取物经过物理和化学方法浓缩、分配、富集、纯化的馏分；
D、a1中一种或多种化合物的组合物和提取物2；
所述的提取物2是取显齿蛇葡萄藤茎粉粹，用水或乙醇水溶液提取，提取液浓缩至乙醇提取物，将其悬浮于水中，用乙酸乙酯萃取，萃取部分经溶剂旋干得提取物2。
优选，所述的a2是将桃金娘整株粉粹，用乙醇或乙醇水溶液提取，提取液浓缩得乙醇提取物，将其悬浮于水中，用正己烷萃取，萃取部分经溶剂旋干得提取物1。
优选，所述的乙醇水溶液是体积分数95％乙醇水溶液。
优选，所述的桃金娘酮和二氢杨梅素按照质量比26∶331混合而成的组合物在制备抗病毒药物中的应用。
优选，所述的提取物1和2按照质量比802∶3973混合而成的组合物在制备抗病毒药物中的应用。
优选，所述的桃金娘酮和提取物2按照质量比26∶3973混合而成的组合物在制备抗病毒药物中的应用。
优选，所述的二氢杨梅素和提取物1按照质量比3973∶802混合而成的组合物在制备抗病毒药物中的应用。
优选，所述的抗病毒药物是抗流感病毒、普通冠状病毒或新型冠状病毒SARS-CoV-2的药物。
优选，所述的抗病毒药物可以是抗病毒喷剂或抗病毒雾化液。
优选，所述的抗病毒喷剂还包括助溶剂，所述助溶剂包括亚甲基亚砜、PEG等助溶剂。本发明精选具有良好抗病毒活性的桃金娘酮和二氢杨梅素，或进行协同配伍，或者具有良好抗病毒活性的桃金娘提取物和显齿蛇葡萄提取物，或进行协同配伍；再通过助溶剂助溶得到天然抗病毒液，具有抗流感病毒、普通冠状病毒、新型冠状病毒的活性。抗病毒活性成分在抗病毒喷剂中的含量可以是0.1％-100％。
优选，所述的抗病毒雾化液还包括助溶剂、基液。所述助溶剂包括亚甲基亚砜、PEG等助溶剂。所述基液包括丙二醇、水等雾化剂。本发明精选具有良好抗病毒活性的桃金娘酮和二氢杨梅素，或进行协同配伍，或者具有良好抗病毒活性的桃金娘提取物和显齿蛇葡萄提取物，或进行协同配伍；再通过助溶剂助溶和雾化剂辅助，得到雾化液，该雾化液通过雾化机雾化后，收集雾化气雾进行抗病毒检测，具有抗流感病毒、普通冠状病毒、新型冠状病毒的活性。抗病毒活性成分在抗病毒雾化液中的含量可以是0.1％-100％。
进一步优选，所述的抗病毒喷剂或雾化液中桃金娘酮或提取物1，与二氢杨梅素或提取物2的质量比为：1∶1-80。更进一步所述的抗病毒喷剂中桃金娘酮1mg/40ml和二氢杨梅素 12mg/40ml、或桃金娘酮1mg/40ml和提取物2 200mg/40ml、或二氢杨梅素12mg/40ml和和提取物1 40mg/40ml、或提取物1 40mg/40ml和提取物2 200mg/40ml。
本发明还提供了一种抗病毒药物，其含有以下任一类化合物或提取物或组合物作为活性成分；
所述的抗病毒活性成分为以下任一类别中化合物或提取物或组合物：
A、二氢杨梅素或其立体异构体、差向异构体、构型异构体或其药学上可以接受的盐、或它们的水合物；
所述的二氢杨梅素的结构式如下所述：
Figure BDA0003627897040000041
B、A中一种或多种化合物和a1中一种或多种化合物的组合物；所述的a1是桃金娘酮或其立体异构体、差向异构体、构型异构体或其药学上可以接受的盐、或它们的水合物；
所述的桃金娘酮的结构式如下所述：
Figure BDA0003627897040000051
C、A中一种或多种化合物和a2中一种或多种化合物的组合物；
所述的a2是桃金娘的叶、茎、花、果、根或者其他部位、或者全株的提取物，提取溶剂是水、乙醇或其水溶液、丙酮或其水溶液、甲醇或其水溶液、乙酸乙酯、正己烷或者以上溶剂不同比例的混合物，或者以上提取物经过物理和化学方法浓缩、分配、富集、纯化的馏分；
D、a1中一种或多种化合物的组合物和提取物2；
所述的提取物2是取显齿蛇葡萄藤茎粉粹，用水或乙醇水溶液提取，提取液浓缩至乙醇提取物，将其悬浮于水中，用乙酸乙酯萃取，萃取部分经溶剂旋干得提取物2。
本发明精选具有良好抗病毒活性的桃金娘酮和二氢杨梅素，并对其进行协同配伍，或者具有良好抗病毒活性的桃金娘提取物和显齿蛇葡萄提取物，并对其进行协同配伍，再通过助溶剂助溶得到天然抗病毒液(可以制成喷剂或雾化液，该雾化液通过雾化机雾化后)，具有抗流感病毒、普通冠状病毒、新型冠状病毒的活性。
具体实施方式
以下实施例为本发明的一些举例，不应看作是对本发明的限定。
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1：从桃金娘科植物种分离获得桃金娘酮类化合物
1.1植物材料
以桃金娘科桃金娘属植物桃金娘为实验原料，该植物在我国南部特别是岭南地区分布广泛。本实验的植物材料采自于江西省赣州市南康县(区)。植物标本现存放于中国科学院华南植物园天然产物与化学生物学研究实验室。
1.2实验仪器与试剂
旋光数据采用Perkin-Elmer 341polarimeter(美国Perkin-Elmer公司)测定。紫外光谱由Perkin-Elmer Lambda 35UV-vis spectrophotometer(美国Perkin-Elmer公司)测定，溶剂为甲醇或氯仿。红外光谱由Bruker Vertex 33infrared spectrophotometer(德国 Bruker公司)测定，测定前需要压片。核磁共振氢谱、碳谱、DEPT-135谱以及二维谱由Bruker公司的BrukerAVIII500型超导核磁共振仪测定，TMS为内标，δ为ppm，J 为Hz。制备型HPLC为L3000型HPLC(北京创新通恒科技有限公司)，色谱柱为C18 柱(ALLTIMAC1810U，250nm×10nm，3mL/min)，并配有单波长紫外检测器。高分辨质谱由Bruker公司的BrukerBio TOFIIIQ mass spectrometer测定。100～200、200～300、 300～400目硅胶和薄层色谱板由青岛谱科分离材料有限公司生产。MCI凝胶(CHP20P, 75-150mm)由日本三菱化学公司生产。Sephadex LH-20凝胶由瑞典Amersham生物科学公司生产。有机溶剂来自于上海化学材料有限公司。薄层色谱显色剂为5％浓硫酸- 乙醇溶液，有紫外吸收的化合物需要在紫外灯下观测。实验过程中所用的混合溶剂的配比皆为体积比。
1.3获得提取物
对干燥桃金娘整株(根、茎、枝条、叶、花、果)进行充分粉粹(20kg)，用体积分数95％乙醇水溶液提取3次(30L×3)，合并的溶剂在减压下旋蒸，得到棕色糖浆状残余物为乙醇提取物1(2.5kg)，将其悬浮于水中(1∶1，重量比)，用正己烷萃取(3L ×3)，萃取部分经溶剂旋干得正己烷部320g(提取物1)。
1.4分离获得单体化合物
本实验选取桃金娘整株(根、茎、枝条、叶、花、果)的正己烷部-用尽量少的氯仿在拌样锅里溶解完全，之后用500g硅胶(80～100目)进行拌样，搅拌均匀，待溶剂挥发完全后干法上样，用正己烷-乙酸乙酯体系10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、0∶1v/v进行梯度洗脱，最后用甲醇冲柱，经过TLC薄层色谱检测后合并主点相同的流分，收集TLC检测(展开溶剂正己烷∶乙酸乙酯＝5∶1v/v)为紫外灯下显蓝色荧光；硫酸-乙醇显色剂作用下显橘红色的组分Fr.C，再经过MCI柱层析脱去色素，然后经过Sephadex LH-20凝胶柱层析，以正己烷-乙酸乙酯体系(8∶1→1∶1v/v)进行梯度洗脱，收集经TLC检测(展开溶剂正己烷∶乙酸乙酯＝5∶1v/v)为紫外灯下显蓝色荧光；硫酸-乙醇显色剂作用下显橘红色的部位Fr.C2。Fr.C2经过SephadexLH-20凝胶柱层析，以氯仿∶甲醇(1∶1v/v)进行洗脱，得到化合物1。TLC检测(展开溶剂正己烷∶乙酸乙酯＝4∶1v/v)，化合物1的 Rf为0.4。
化合物1为桃金娘酮，淡黄色针状晶体,易溶于氯仿；核磁数据：1H NMR(CDCl3,500MHz):δH 6.12(1H,s,H-5),4.27(1H,t,J＝5.6Hz,H-9),2.99(3H,m,H-1”,H-2”),2.28(1H,dp,J＝13.3,6.6Hz,H-3'),1.55,1.43,1.41,1.37(each 3H,s,H-11,H-12,H-13,H-14),0.98 (6H,d,J＝6.7,Hz,H-4',H-5'),0.87,0.83(each 3H,d,J＝6.0Hz,H-3”,H-4”)；13CNMR (CDCl3,125MHz):δC 212.2(C-3),206.7(C-1'),198.3(C-1),167.5(C-4a),162.8(C-8), 158.7(C-6),155.7(C-10a),114.3(C-9a),107.7(C-7),106.4(C-8a),94.7(C-5),56.1(C-2), 53.2(C-2'),46.4(C-4),45.8(C-1”),25.5(C-9),25.5(C-2”),25.2,25.1(C-13,C-14),24.7, 24.6(C-11,C-12),24.2(C-3'),23.5,23.2(C-3”,C-4”),22.8，22.8(C-4',C-5')。化合物1的结构式如下所示：
Figure BDA0003627897040000081
实施例2：从葡萄科植物种分离获得二氢杨梅素化合物
2.1植物材料
植物材料采自于江西省赣州市大余县，为葡萄科蛇葡萄属显齿蛇葡萄Ampelopsisgrossedentata(Hand.-Mazz.)W.T.Wang。植物标本现存放于中国科学院华南植物园天然产物与化学生物学研究实验室。
2.2实验仪器与试剂
同实施例1的1.2。
2.3获得提取物
取显齿蛇葡萄藤茎20kg，充分粉粹，用体积分数95％的乙醇水溶液室温浸泡3次，每次约3d，合并滤液减压浓缩至浸膏约2k g。向浸膏中加入水形成悬浊液，然后用乙酸乙酯萃取，回收溶剂后得乙酸乙酯部380g(提取物2)。
2.4分离单体化合物
乙酸乙酯部经硅胶(100～200目)柱层析，氯仿∶甲醇(49∶1→1∶1v/v)梯度洗脱，各组分浓缩后采用TLC板检测，合并主点相同组分得到Fr.1～Fr.7共七个组分。展开剂为二氯甲烷∶甲醇5∶1，Rf值为0.42，254nm紫外灯下有荧光，用香草醛-浓硫酸显色后成红点的Fr.2经硅胶(200～300目)柱层析，二氯甲烷∶甲醇(19∶1→14∶6v/v)梯度洗脱，得到亚组分Fr.2.1、Fr.2.2、Fr.2.3和Fr.2.4四个亚组分。展开剂为二氯甲烷∶甲醇5∶1， Rf值为0.42，254nm紫外灯下有荧光，用香草醛-浓硫酸显色后成红点的Fr.2.3经Sephadex LH-20柱层析，氯仿∶甲醇(1∶3v/v)洗脱得到Fr.2.3.1和Fr.2.3.2，展开剂为二氯甲烷∶甲醇5∶1，Rf值为0.42，254nm紫外灯下有荧光，用香草醛-浓硫酸显色后成红点的组分 Fr.2.3.2经Sephadex LH-20柱层析，氯仿∶甲醇(1∶1v/v)洗脱，展开剂为二氯甲烷∶甲醇5∶1，Rf值为0.42，254nm紫外灯下有荧光，用香草醛-浓硫酸显色后成红点的得到化合物2(36mg)。
化合物2鉴定为二氢杨梅素(dihydromyricetin)，黄色无定形粉末。ESI-MS负离子模式给出准分子离子峰m/z 319[M-H]-，表明该化合物的分子量为320，结合核磁共振数据得到化合物分子式为C15H12O8。核磁数据：1H NMR(Methanol-d4,500MHz)δ:6.57 (2H,s,H-2′,H-6′),对称取代的芳环质子信号；5.95(1H,d,J＝2.1Hz,H-8),5.90(1H,d,J ＝2.1Hz,H-6),间位耦合的芳环质子信号；4.85(1H,d,J＝11.4Hz,H-3),4.49(1H,d,J ＝11.4Hz,H-2),典型的二氢黄酮醇C环质子信号。13C NMR(Methanol-d4,125MHz)δ: 196.9(C-4),83.8(C-2),72.3(C-3),典型的二氢黄酮醇C环碳信号；145.5(C-3′,C-5′), 133.5(C-4′),127.7(C-1′),106.8(C-2′,C-6′),对称取代的芳环，取代基为羟基；共含有15 个碳信号。结构如下式所示：
Figure BDA0003627897040000101
实施例3:抗流感病毒活性检测
3.1细胞和病毒的准备
狗肾细胞MDCK按照常规传代培养，调整细胞密度为2×104个/mL接种到96孔板中，待孔内细胞生长为完整单层备用。细胞培养液为含10％FBS、1％青链霉素混合液的 DEME培养液，细胞维持液、病毒维持液为含3％FBS、1％青链霉素混合液的DEME培养液。
甲型流感病毒株A/WSN/33(H1N1)接种于MDCK单层细胞，37℃孵育1h，去掉上清，更换含有细胞维持液，等细胞发生100％病变时，反复冻融三次，收集上清作为制备的种毒，TCID50测定病毒的效价。
TCID50的测定：96孔板培养的MDCK单层细胞，移去上清，然后PBS洗涤两次，加上倍比稀释的100μL病毒稀释液，每个稀释度设8个重复，37℃孵育2h，移去上清，PBS洗涤两次，加上150μL病毒维持液。三天后，显微镜下观察病变计数病变孔，通过Reed-Muench方法计算病毒滴度TCID50。
3.2细胞毒性的测定
将样品(单体化合物初始浓度20μg/mL,提取物初始浓度2000μg/mL)用细胞维持液连续2倍倍比稀释后，加入到狗肾细胞MDCK长成单层的96孔培养板上，100μL/ 孔，每个稀释度重复3孔，另设不加样品的细胞对照组，置5％CO2培养箱37℃培养72 h，每天观察记录细胞病变(CPE)情况。待培养到72h后，弃上清，用PBS缓冲液清洗2 遍，每孔加入10μL MTT，继续培养4h后，用酶标仪测在450nm测定吸光度OD值。以CPE程度和所测得OD值为依据，计算药物致细胞的病变率，然后用软件Prism 8.0 计算CC50，CC50是使得50％的细胞发生病变时的药物浓度。
3.3抗流感病毒活性检测
96孔板中的MDCK细胞长成单层后，吸去培养液，用100*TCID50病毒100μL 吸附细胞，37℃孵育1h，洗去游离病毒，加入用细胞维持液倍比稀释的样品(单体化合物初始浓度20μg/mL，提取物初始浓度2000μg/mL)100μL，每个稀释度重复3孔，同时设不加样品和病毒的细胞对照组、不加样品加病毒的病毒对照组，37℃、5％CO2继续培养，观察细胞病变，确定细胞病变是否为IAV病毒引起的特异性病变，待病毒对照组CPE达到80％～90％时，结束试验，记录各孔CPE情况，按如上描述操作测定每孔 OD450值，用以下公式计算样品对病毒的抑制率，然后用软件Prism 8.0计算EC50。
表1样品抗A/WSN/33(H1N1)病毒活性及细胞毒性
样品 EC<sub>50</sub>(μg/mL) CC<sub>50</sub>(μg/mL)
化合物1 0.28 4.74
化合物2 3.55 37.24
提取物1 8.69 116.58
提取物2 36.32 430.15
实施例4：抗普通冠状病毒活性
4.1细胞和病毒的准备
人结肠癌细胞HRT-18培养在RPMI 1640培养液中，补充10％血清FBS，1％双抗 PS，1％丙酮酸钠，1％NEAA非必须氨基酸，5％CO2培养箱37℃培养细胞生长至完全单层时，胰酶酶解，调整细胞密度为2×104个/mL接种到96孔板中，待孔内细胞生长为 90％单层时备用。
人冠状病毒HCoV-OC43在HRT-18细胞中扩增，培养液为RPMI 1640培养液中，补充10％血清FBS，1％双抗PS，1％丙酮酸钠，1％NEAA非必须氨基酸，5％CO2培养箱33℃培养至50％细胞发生马蜂窝样病变。收集上清，根据Reed-Muench法测定病毒的半数组织细胞感染量TCID50，按终质量浓度100*TCID50用量使用。
4.2细胞毒性检测
将待测样品(单体化合物初始浓度20μg/mL,提取物初始浓度2000μg/mL)用细胞维持液连续2倍倍比稀释后，加入到人结肠癌细胞HRT-18长成单层的96孔培养板上， 100μL/孔，每个稀释度重复3孔，另设细胞对照组，置5％CO2培养箱37℃培养72h，弃上清，用PBS缓冲液清洗2遍，每孔加入10μL CKK-8，继续培养4h后，用酶标仪测OD450。以所测得OD值为依据，计算药物致细胞的病变率，CC50是50％的细胞存活时的药物浓度(软件Prism 8.0计算CC50)。
4.3抗普通冠状病毒活性
96孔板中的人结肠癌细胞HRT-18长成单层后，吸去培养液，用100*TCID50病毒 100μL吸附细胞，37℃孵育2h，洗去游离病毒，加入用细胞维持液倍比稀释的待测样品(单体化合物初始浓度20μg/mL,提取物初始浓度2000μg/mL)100μL，每个稀释度重复3孔，37℃、5％CO2继续培养48h，去除上清，加入50ul 4％PFA/PBS固定15分钟，PBS清洗3次；加入50ul免疫染色封闭缓冲液封闭30分钟，PBS清洗3次；50 ul稀释1∶200的一抗anti-OC43(cat#40643-T62-200，Sino Biological)免疫染色1小时，用50ul PBS清洗三次；50ul稀释1∶400的二抗anti-rabbit-AlexaFluor488染色1小时，用50ul PBS三次。用酶标仪检测荧光OD值(Ex/Em＝488/538)，用以下公式计算样品对病毒的抑制率，然后用软件Prism 8.0计算EC50。
表2样品抗HCoV-OC43病毒活性及细胞毒性
样品 EC<sub>50</sub>(μg/mL) CC<sub>50</sub>(μg/mL)
化合物1 0.26 3.31
化合物2 3.31 41.87
提取物1 8.02 97.67
提取物2 39.73 468.22
实施例5样品抗新型冠状病毒SARS-CoV-2活性分析
5.1细胞和病毒
非洲绿猴肾细胞Vero-E6按照常规传代培养，调整细胞密度为1×105个/mL接种到96孔板中，待孔内细胞生长为完整单层备用。新型冠状病毒SARS-CoV-2为中国科学院武汉病毒研究所保存的病毒。细胞培养液为含10％FBS、1％青链霉素混合液的DEME 培养液，细胞维持液、病毒维持液为含2％FBS、1％青链霉素混合液的DEME培养液。
5.2样品细胞毒性的测定
将样品(单体化合物初始浓度20μg/mL，提取物初始浓度2000μg/mL)用细胞维持液连续2倍倍比稀释后，加入到非洲绿猴肾细胞Vero-E6长成单层的96孔培养板上，100μL/孔，每个稀释度重复3孔，另设不加样品的细胞对照组，置5％CO2培养箱37℃培养72h，每天观察记录细胞病变(CPE)情况。待培养到72h后，弃上清，用PBS缓冲液清洗2遍，每孔加入20μLMTT，继续培养4h后，弃MTT上清，每孔加入150μL DMSO，震荡5-10min，待结晶完全溶解后用酶标仪测OD570。以CPE程度和所测得OD值为依据，计算药物致细胞的病变率，CC50是使得50％的细胞发生病变时的药物浓度。
5.3样品对新型冠状病毒SARS-CoV-2病毒复制的抑制作用
24孔板中的Vero E6细胞长成单层后，吸去培养液，并添加各种浓度(0，0.15625、0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10μM)的样品后，用0.01 MOI的SARS-CoV-2感染细胞。感染后24小时后，从每个孔的上清液中提取病毒总RNA，并通过实时定量荧光PCR (qRT-PCR)确定病毒的产量，以计算病毒抑制率以及药物的EC50(半数有效浓度)。具体而言，使用带有探针5′-FAM-tggttgacctacacaggtgccatca-BHQ1-3′的引物ORFlab-F (5′-ccctgtgggttttacacttaa-3′)和ORF1ab-R(5′-acgattgtgcatcagctga-3′)引物用于检测ORF1ab的表达量。最后结合药物的细胞毒性计算出选择指数SI＝CC50/EC50
表3样品抗SARS-CoV-2病毒活性及细胞毒性
样品 EC<sub>50</sub>(μg/mL) CC<sub>50</sub>(μg/mL)
化合物1 0.22 4.54
化合物2 - 35.82
提取物1 8.21 113.32
提取物2 - 402.37
-表示没有检测到
实施例6：协同抗病毒研究作用研究
使用Bliss独立模型体外研究提取物1和2，化合物1和2分别联合对流感病毒、冠状病毒HCoV-OC43、SARS-CoV-2的协同作用。以化合物1和2协同作用抗HCoV-OC43 为例，96孔板中的HRT-18细胞长成单层后，吸去培养液，用100*TCID50病毒100μL 吸附细胞，37℃孵育2h，洗去游离病毒，加入用病毒维持液稀释的待测样品100μL，待测样品分为3组：A，亚抑制浓度的化合物1(0.26μg/mL)、B，亚抑制浓度的化合物 2(3.31μg/mL)、C，同时添加亚抑制浓度的化合物1(0.26μg/mL)和2(3.31μg/mL), 每组待测样品重复8孔，37℃、5％CO2继续培养48h，去除上清，加入50ul 4％PFA /PBS固定15分钟,PBS清洗3次；加入50ul免疫染色封闭缓冲液封闭30分钟,PBS 清洗3次；50ul稀释1:200的一抗anti-OC43(cat#40643-T62-200,Sino Biological)免疫染色1小时,用50ul PBS清洗三次；50ul稀释1:400的二抗anti-rabbit-AlexaFluor488 染色1小时,用50ul PBS三次。用酶标仪检测荧光OD值(Ex/Em＝488/538)。
提取物1和2时，待测样品分为3组：A，提取物1(8.02μg/mL)、B，提取物2(39.73 μg/mL)、C，同时添加提取物1(8.02μg/mL)和2(39.73μg/mL)，实验方法参照化合物 1和2。化合物1(0.26μg/mL)和提取物2(39.73μg/mL)，化合物2(39.73μg/mL) 和提取物1(8.02μg/mL)，按照相同的方法进行测试。
协同作用(S)使用下式计算：S＝(OD1/OD0)(OD2/OD0)-(OD12/OD0)。参数 OD12指同时存在1和2的情况下的荧光OD值；参数OD1和OD2分别指仅存在1种化合物存在的情况下荧光OD值；参数OD0是指在不存在药物的情况下的荧光OD值。协同度(S)值对应于以下截止值：零表示中性，高于零(正值)表示协同作用，低于零 (负值)表示拮抗作用。具有较高正值的药物组合代表高度的协同作用。
表4.协同抗病毒研究(s)
病毒 化合物1和2 提取物1和2 化合物1和提取物2 化合物2和提取物1
流感病毒 0.26 0.23 0.26 0.29
普通冠状病毒 0.31 0.27 0.22 0.29
新型冠状病毒 0.25 0.28 0.21 0.28
根据表4结果显示，化合物1和2之间，化合物1和提取物2之间，化合物2和提取物1之间，提取物1和2之间都具有显著的协同抗病毒作用。化合物1和2，化合物 1和提取物2，化合物2和提取物1，提取物1和2配伍使用，可以进一步提高抗病毒效果，减少样品用量。
实施例7样品在抗病毒喷剂中的应用和抗病毒效果评价
将上述提取物1和提取物2，或者单体化合物1和单体化合物2按照一定的比例混合，加入少量的二甲基亚砜和PEG400溶解，用丙二醇和水定容，混合均匀，得到抗病毒喷剂(表5)。
表5抗病毒喷剂配方表
组方 化合物1 化合物2 提取物1 提取物2 DMSO(mL) PEG400 丙二醇 无菌水
组方1 1mg 12mg - - 0.2 0.8 1 38
组方2 - - 40mg 200mg 0.4 0.8 2 37.8
组方3 1mg - - 200mg 0.4 1.6 2 36
组方4 - 12mg 40mg - 0.3 1.2 1 37.5
实施例8：
一种具有抗病毒功效的天然抗病毒喷剂的评价和使用方法，包括如下步骤：
将实施例7的抗病毒喷剂以1％的比例(v/v)添加到感染了病毒的96孔板细胞中进行抗病毒检测。抗流感病毒检测参照实施例3，抗普通冠状病毒检测参照实施例4，抗新型冠状病毒检测参照实施例5。结果如下：
表6各组方抗病毒喷剂抗病毒活性
病毒 组方1 组方2 组方3 组方4
流感病毒 无病变 无病变 无病变 无病变
普通冠状病毒 无病变 无病变 无病变 无病变
新型冠状病毒 无病变 无病变 无病变 无病变
根据检测结果确定添加量，以0.1％-100％的比列添加到雾化产品中。
实施例9样品在雾化液中的应用和抗病毒效果评价
将上述提取物1和提取物2，或者单体化合物1和单体化合物2按照一定的比例混合(表 7)，加入少量的二甲基亚砜和PEG400溶解，用丙二醇和水定容，搅拌均匀，得到雾化液。
表7雾化液配方表
Figure BDA0003627897040000171
实施例10一种具有抗病毒功效的中药雾化液的评价和使用方法，包括如下步骤：
将雾化液通过雾化机形成喷泉和烟雾，将烟雾收集得到待检测的雾化液。将雾化液以1％的比例添加到感染了病毒的96孔板细胞中进行抗病毒检测。抗流感病毒检测参照实施例3，抗普通冠状病毒检测参照实施例4，抗新型冠状病毒检测参照实施例5。结果如下：
表8各组方雾化液抗病毒活性
病毒 组方1 组方2 组方3 组方4
流感病毒 无病变 无病变 无病变 无病变
普通冠状病毒 无病变 无病变 无病变 无病变
新型冠状病毒 无病变 无病变 无病变 无病变
根据检测结果确定添加量，以0.1％-100％的比列添加到雾化产品中。

Claims (10)

1.抗病毒活性成分在制备抗病毒药物中的应用；
所述的抗病毒活性成分为以下任一类别中化合物或提取物或组合物：
A、二氢杨梅素或其立体异构体、差向异构体、构型异构体或其药学上可以接受的盐、或它们的水合物；
所述的二氢杨梅素的结构式如下所述：
Figure FDA0003627897030000011
B、A中一种或多种化合物和a1中一种或多种化合物的组合物；所述的a1是桃金娘酮或其立体异构体、差向异构体、构型异构体或其药学上可以接受的盐、或它们的水合物；
所述的桃金娘酮的结构式如下所述：
Figure FDA0003627897030000012
C、A中一种或多种化合物和a2中一种或多种提取物的组合物；
所述的a2是桃金娘的叶、茎、花、果、根或者其他部位、或者全株的提取物，提取溶剂是水、乙醇或其水溶液、丙酮或其水溶液、甲醇或其水溶液、乙酸乙酯、正己烷或者以上溶剂不同比例的混合物，或者以上提取物经过物理和化学方法浓缩、分配、富集、纯化的馏分；
D、a1中一种或多种化合物的组合物和提取物2；
所述的提取物2是取显齿蛇葡萄藤茎粉粹，用水或乙醇水溶液提取，提取液浓缩至乙醇提取物，将其悬浮于水中，用乙酸乙酯萃取，萃取部分经溶剂旋干得提取物2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的a2是将桃金娘整株粉粹，用乙醇或乙醇水溶液提取，提取液浓缩得乙醇提取物，将其悬浮于水中，用正己烷萃取，萃取部分经溶剂旋干得提取物1。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的乙醇水溶液是体积分数95％乙醇水溶液。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的桃金娘酮和二氢杨梅素按照质量比26:331混合而成的组合物在制备抗病毒药物中的应用。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的提取物1和2按照质量比802:3973混合而成的组合物在制备抗病毒药物中的应用；或所述的桃金娘酮和提取物2按照质量比26:3973混合而成的组合物在制备抗病毒药物中的应用；或所述的二氢杨梅素和提取物1按照质量比3973：802混合而成的组合物在制备抗病毒药物中的应用。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗病毒药物是抗流感病毒、普通冠状病毒或新型冠状病毒SARS-CoV-2的药物。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗病毒药物是抗病毒喷剂或抗病毒雾化液。
8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抗病毒药物中桃金娘酮或提取物1，与二氢杨梅素或提取物2的质量比为：1：1-80。
9.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抗病毒药物中桃金娘酮1mg/40ml和二氢杨梅素12mg/40ml、或桃金娘酮1mg/40ml和提取物2 200mg/40ml、或二氢杨梅素12mg/40ml和和提取物1 40mg/40ml、或提取物1 40mg/40ml和提取物2 200mg/40ml。
10.一种抗病毒药物，其特征在于，含有以下任一类化合物或提取物或组合物作为活性成分；
A、二氢杨梅素或其立体异构体、差向异构体、构型异构体或其药学上可以接受的盐、或它们的水合物；
所述的二氢杨梅素的结构式如下所述：
Figure FDA0003627897030000031
B、A中一种或多种化合物和a1中一种或多种化合物的组合物；所述的a1是桃金娘酮或其立体异构体、差向异构体、构型异构体或其药学上可以接受的盐、或它们的水合物；
所述的桃金娘酮的结构式如下所述：
Figure FDA0003627897030000032
C、A中一种或多种化合物和a2中一种或多种化合物的组合物；
所述的a2是桃金娘的叶、茎、花、果、根或者其他部位、或者全株的提取物，提取溶剂是水、乙醇或其水溶液、丙酮或其水溶液、甲醇或其水溶液、乙酸乙酯、正己烷或者以上溶剂不同比例的混合物，或者以上提取物经过物理和化学方法浓缩、分配、富集、纯化的馏分；
D、a1中一种或多种化合物的组合物和提取物2；
所述的提取物2是取显齿蛇葡萄藤茎粉粹，用水或乙醇水溶液提取，提取液浓缩至乙醇提取物，将其悬浮于水中，用乙酸乙酯萃取，萃取部分经溶剂旋干得提取物2。
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