CN104996421B - 石斛兰提取物中二芳基乙烷类化合物在抗植物病原真菌中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了石斛兰提取物中二芳基乙烷类化合物在抗植物病原真菌中的应用，所述的二芳基乙烷类化合物结构式如下：其中R₁、R₂、R₃、R₄分别独立选自为‑OCH₃或‑OH或‑H。本发明首次发现了二芳基乙烷类化合物具有抗植物病原真菌的活性，可用于制备抗植物病原真菌的药物。

Description

石斛兰提取物中二芳基乙烷类化合物在抗植物病原真菌中的 应用

技术领域

本发明涉及植物化学技术领域，具体涉及一种从石斛兰中提取分离的二芳基乙烷类化合物在抗植物病原真菌中的应用。

背景技术

石斛兰为兰科石斛属植物石斛兰(Dendrobium nobile)的干燥茎，该植物不仅可以用于观赏也可以以其干燥的茎入药，其具有滋阴养胃、清热生津、润肺止咳以及明目强身的功效。从石斛属植物中分离得到的二芳基乙烷类化合物已有报道，但未见它们有抗植物病原真菌活性的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种从石斛兰中提取分离的二芳基乙烷类化合物在抗植物病原真菌中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

石斛兰提取物中二芳基乙烷类化合物在抗植物病原真菌中的应用，所述的二芳基乙烷类化合物结构式如下：

其中R₁、R₂、R₃、R₄分别独立选自为-OCH₃或-OH或-H。

优选的结构之一是，R₁为-OCH₃，R₂为-OH，R₃为-OH，R₄为-OCH₃。

优选的结构之二是，R₁为-OCH₃，R₂为-OH，R₃为-H，R₄为-H。

优选的结构之三是，R₁为-OCH₃，R₂为-OH，R₃为-H，R₄为-OH。

优选的结构之四是，R₁为-H，R₂为-H，R₃为-H，R₄为-OCH₃。

优选的结构之五是，R₁为-H，R₂为-H，R₃为-H，R₄为-OCH₃。

其中，所述的植物病原真菌为甘蓝黑斑、烟草黑胫、辣椒炭疽、水稻胡麻叶斑、金桔沙皮、甘蔗凤梨、玉米大斑、茶轮斑或贡柑链格孢。

上述二芳基乙烷类化合物的制备方法如下：

1、制备石斛兰提取物

将石斛兰干燥的茎粉碎后，按常规用30～95％v/v的乙醇冷浸或者是热提，得到提取液，减压浓缩成膏状，即为石斛兰提取物。

2、分离纯化

将上述提取物用水稀释制成悬浮液后，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩成浸膏，经柱层析、薄层层析、分子筛层析分离得到5个二芳基乙烷类化合物为：3-hydroxy-5-methoxybibenzyl(1)、山药素III(2)、Gigantol(3)、Tristin(4)以及3，3′，5-trihydroxybibenzyl(5)。

其中，柱层析的条件为：用200～300目硅胶上柱，乙酸乙酯体积百分数为25％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为洗脱剂。

其中，薄层层析条件为：以乙酸乙酯体积百分数为33％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为展开剂。

其中，分子筛层析条件为：分子筛为Sephadex LH-20，以氯仿体积百分数为50％的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱剂。

有益效果：本发明首次发现了二芳基乙烷类化合物具有抗植物病原真菌的活性，可用于制备抗植物病原真菌的药物。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：二芳基乙烷类化合物的制备。

石斛兰干燥的茎粉5Kg碎后，按常规用70％v/v的乙醇浸提3次每次7天，得到提取液，将提取液减压浓缩成膏状，得到石斛兰提取物800g。将提取物用水稀释成悬浮液，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩成浸膏，进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯混和溶剂(100∶0-0∶100，V/V)及乙酸乙酯-甲醇(100∶0-0∶100，V/V)按极性递增进行硅胶柱层析，并按每次约500mL收集馏分。通过TLC检测合并相似流分分成10个组分，即Fr.1-10。Fr.3进行葡聚糖凝胶柱层析，再分别用高效液相制备制备洗脱机为甲醇和水其体积配比为3∶2得到3-hydroxy-5-methoxybibenzyl(69mg)、山药素III(78mg)、Gigantol(85mg)、Tristin(67mg)以及3，3′，5-trihydroxybibenzyl(58mg)。

5个化合物的结构鉴定结果如下：

3-hydroxy-5-methoxybibenzyl：白色粉末，分子式C₁₅H₁₆O₂。易溶于甲醇，微溶于水。ESI-MS m/z：229[M+H]⁺，252[M+Na]⁺。¹H-NMR(CDCl₃)：2.81-2.92(4H，m，-CH₂-CH₂-)，3.75(3H，s，-OCH₃)，一取代苯环上的5个氢信号7.17-7.30(5H，dd，H-2′/3′/4′/5′/6′)，三取代苯环上的3个氢信号6.25-6.32(3H，d，H-2/4/6)。¹³C-NMR(CDCl₃)：144.7(C-1)，108.1(C-2)，161.0(C-3)，99.2(C-4)，156.7(C-5)，106.9(C-6)，38.1(C-7)，37.7(C-8)，141.8(C-1′)，128.5(C-2′，6′)，128.6(C-3′，5′)，126.1(C-4′)，55.4(C-5-OCH₃)。以上数据与文献(Ali，M.A.，Kondo，K.，Tsuda，Y.Synthesisi and nematocidal acitivity ofhydroxystilbenes[J].Chem.Pharm.Bull.，1992，40(5)：1130-1125)报道一致，确定其为3-hydroxy-5-methoxybibenzyl。

山药素III：白色粉末，分子式分子式C₁₅H₁₆O₃。易溶于甲醇，微溶于水。ESI-MS m/z：245[M+H]⁺，267[M+Na]⁺。¹H-NMR(CDCl₃)：2.77-2.86(4H，m，-CH₂-CH₂-)，3.75(3H，s，-OCH₃)，7.14(1H，t，H-5′)，6.75(1H，d，H-6′)，6.67(1H，d，H-4′)，6.65(1H，d，H-2′)，6.31(1H，d，H-6)6.26(2H，d，H-2/4)。¹³C-NMR(CDCl₃)：144.4(C-1)，107.9(C-2)，156.6(C-3)，99.1(C-4)，160.9(C-5)，106.8(C-6)，37.7(C-7)，37.4(C-8)，143.6(C-1′)，115.5(C-2′)，155.5(C-3′)，112.9(C-4′)，129.6(C-5′)，121.0(C-6′)，55.3(C-5-OCH₃)。

Gigantol：白色粉末，分子式分子式C₁₆H₁₈O₄。易溶于甲醇，微溶于水。ESI-MS m/z：275[M+H]⁺，297[M+Na]⁺。¹H-NMR(CDCl₃)：2.76-2.84(4H，m，-CH₂-CH₂-)，3.75(3H，s，-OCH₃)，3.84(3H，s，-OCH₃)，6.83(1H，d，H-5)，6.68(1H，dd，H-6)，6.62(1H，d，H-2)，6.32(1H，s，H-6′)，6.26(2H，d，H-2′/4′)。¹³C-NMR(CDCl₃)：144.7(C-1′)，108.2(C-2′)，156.7(C-3′)，99.2(C-4′)，161.0(C-5′)，107.0(C-6′)，37.4(C-8)，38.4(C-8)，133.8(C-1)，114.4(C-2)，146.4(C-3)，143.9(C-4)，111.3(C-5)，121.1(C-6)，55.4(C-5-OCH₃)，56.0(C-3′-OCH₃)。以上数据与文献(Shimizu，M.，Fukumura，H.，Tsuji，H.，Tanaami，S.，Hayashi，T.，Morita，N.Anti-inflammatory Constituents of Topically Applied Crude Drugs.III.：Constituents and Anti-inflammatory Effect of Paraguayan Crude Drug″Tamandacuna″(Catasetum barbatum LINDLE)[J].Chem.Pharm.Bull.，1988，36：4447-4452)报道一致，确定其为Gigantol。

Tristin：白色粉末，分子式分子式C₁₅H₁₆O₄。易溶于甲醇，微溶于水。ESI-MS m/z：261[M+H]⁺，283[M+Na]⁺。¹H-NMR(Acetone-d₆)：2.76-2.84(4H，m，-CH₂-CH₂-)，3.79(3H，s，-OCH₃)，6.79(1H，d，H-2′)，6.73(1H，d，H-5′)，6.65(1H，dd，H-6′)，6.22(3H，s，H-2/4/6)。¹³C-NMR(Acetone-d₆)：134.2(C-1)，112.8(C-2)，147.9(C-3)，145.3(C-4)，115.4(C-5)，121.5(C-6)，37.9(C-7)，38.9(C-8)，145.2(C-1′)，107.7(C-2′/6′)，159.1(C-3′/5′)，100.9(C-4′)，56.2(C-3-OCH₃)，56.0(C-3′-OCH₃)。以上数据与文献(Leonga，Y.W.，Harrisona，L.J.，Powell，A.D.Phenanthrene and other aromatic constituents of Bulbophyllumvaginatum[J].Phytochemistry，1999，50：1237-1241)报道一致，确定其为Tristin。

3，3′，5-trihydroxybibenzyl：白色粉末，分子式分子式C₁₅H₁₆O₄。易溶于甲醇，微溶于水。ESI-MS m/z：231[M+H]⁺，253[M+Na]⁺。¹H-NMR(Acetone-d₆)：2.70-2.81(4H，m，-CH₂-CH₂-)，7.08(1H，t，H-5′)，6.71(1H，dd，H-6′)，6.65(1H，dd，H-4′)，6.70(1H，d，H-2′)，6.19-6.24(3H，d，H-2/4/6)。¹³C-NMR(Acetone-d₆)：145.1(C-1)，107.3(C-2/6)，159.2(C-3/5)，101.0(C-4)，38.2(C-7)，38.5(C-8)，144.4(C-1′)，116.1(C-2′)，158.2(C-3′)，113.5(C-4′)，130.0(C-5′)，120.4(C-6′)。以上数据与文献(Liu，Y.，Jiang，J.H.，Yin，B.L.，Chen，Y.G.CHEMICAL CONSTITUENTSOF Dendrobium cariniferum[J].Chemistry of NaturalCompounds，2009，45：237-238)报道一致，确定其为3，3′，5-trihydroxybibenzyl。

实施例2：药理活性实验，

植物病原真菌是农作物主要危害之一，是造成农业损失的主要原因之一。本发明通过检测3-hydroxy-5-methoxybibenzyl、山药素III、Gigantol、Tristin以及3，3′，5-trihydroxybibenzyl对植物病原真菌的抑制作用，发现这一类化合物具有较好的抗植物病原真菌的抑制活性。

试验方法：微量稀释法，该方法常用于测定致病菌对敏感性药物或新药对细菌的抑制活性试验。一般使用96孔微量稀释板，其孔底呈U型，每孔容量0.20-0.30mL本法操作较方便，且培养基用量少，可用于大批量药敏试验。一般用MH培养基，将已配制好的药液在试管中作二倍浓度递减稀释，分别装于96孔板内或者用微量加液器直接在板孔内作二倍稀释，然后再接种稀释菌液，另外需留出一列孔作为药液对照，该孔列仅加培养基和菌液作为菌对照，试验完毕后，用微量搅拌器震荡混匀，再将96孔板置于28或37℃培养箱中温孵18-48h，用酶标仪测630nm下吸光度。

致病菌株的准备：

将活化好的9株致病菌分别接种于以灭菌处理过的LB培养基中，再将其放置于恒温振荡器中28摄氏度震荡培养24h。

化合物的初筛：

将培养好的致病菌用培养液进行稀释，稀释度为1∶500-1∶1000；将稀释后的含菌培养液分别定量加至96孔板的各个孔中；将样品配制成1mg/mL，分别取定量加至各个孔中。加完后置于恒温培养箱中28℃恒温培养48h，而后用酶标仪在630nm下测各孔吸光度。试验结果表明3-hydroxy-5-methoxybibenzyl、山药素III、Gigantol、Tristin以及3，3′，5-trihydroxybibenzyl对9株植物病原真菌(甘蓝黑斑、烟草黑胫、辣椒炭疽、水稻胡麻叶斑、金桔沙皮、甘蔗凤梨、玉米大斑、茶轮斑以及贡柑链格孢)都有抑制活性。

最小抑菌浓度的测试：

将培养好的致病菌用培养液进行稀释，稀释度为1∶500-1∶1000；将稀释后的含菌培养液分别定量加至96孔板的第一排各孔中，让后一次向下成倍稀释；然后将各样品分别加入至各列孔中。加完后置于恒温培养箱中28℃恒温培养48h，而后用酶标仪在630nm下测各孔吸光度。其结果见表1

表1石斛兰中二芳基乙烷类化合物对9株致病菌的最小抑制浓度

试验结果表明二芳基乙烷化合物具有抗植物病原真菌的活性。化合物1-5都表现出广谱的抗菌活性并且大部分都表现出与阳性对照一致的活性，有的更强于阳性对照。

Claims (1)

1.石斛兰提取物中二芳基乙烷类化合物在抗植物病原真菌中的应用，其特征在于，所述的二芳基乙烷类化合物结构式为如下结构式之一：

其中，所述的植物病原真菌为甘蓝黑斑、烟草黑胫、辣椒炭疽、水稻胡麻叶斑、金桔沙皮、甘蔗凤梨、玉米大斑、茶轮斑或贡柑链格孢。