CN105454230B

CN105454230B - 倍半萜类化合物在抗植物病原真菌中的应用

Info

Publication number: CN105454230B
Application number: CN201510470488.9A
Authority: CN
Inventors: 陈光英; 韩长日; 周学明; 郑彩娟; 黄辉峰; 刘艳萍
Original assignee: Hainan Normal University
Current assignee: Hainan Normal University
Priority date: 2015-08-04
Filing date: 2015-08-04
Publication date: 2017-09-05
Anticipated expiration: 2035-08-04
Also published as: CN105454230A

Abstract

本发明公开了倍半萜类化合物在抗植物病原真菌中的应用，所述的倍半萜类化合物结构式如下：其中，为双键或单键；当为单键时，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆分别独立选自‑OH或‑CH₃或‑H，当为双键时，R₁、R₂、R₃、R₆分别独立选自‑OH或‑CH₃或‑H，R4和R5不存在。本发明首次发现了倍半萜类化合物具有抗植物病原真菌的活性，可用于制备抗植物病原真菌的药物。

Description

倍半萜类化合物在抗植物病原真菌中的应用

技术领域

本发明涉及植物化学技术领域，具体涉及一种从温莪术提取挥发油后所剩药渣中提取分离的倍半萜类化合物在抗植物病原真菌中的应用。

背景技术

温莪术(Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling)，又名温郁金，是姜科(Zingiberaceae)姜黄属(Curcuma L)植物。是我国的民间用药，是“浙八味”之一，该药味辛、苦，性寒，具有行气化瘀、清心解郁、利胆退黄之功效，主要用于治疗经闭痛经、胸腹胀痛、刺痛、热病神昏、癫病发狂和黄疸尿赤等症。从温莪术植物中分离得到的倍半萜类化合物已有报道，但未见它们有抗植物病原真菌活性的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种从温莪术提取挥发油后所剩药渣中提取分离的倍半萜类化合物在抗植物病原真菌中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

倍半萜类化合物在抗植物病原真菌中的应用，所述的倍半萜类化合物结构式如下：

其中，

为双键或单键；

当为单键时，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆分别独立选自-OH或-CH₃或-H，

当为双键时，R₁、R₂、R₃、R₆分别独立选自-OH或-CH₃或-H，R4和R5不存在。

优选的结构式之一是，为单键，R₁为-OH，R₂为-CH₃，R₃为-H，R₄为-H，R₅为-OH，R₆为-CH₃，所述的倍半萜类化合物结构式如下：

优选的结构式之二是，为单键，R₁为-H，R₂为-CH₃，R₃为-OH，R₄为-H，R₅为-OH，R₆为-CH₃，所述的倍半萜类化合物结构式如下：

优选的结构式之三是，为单键，R₁为-H，R₂为-CH₃，R₃为-OH，R₄为-H，R₅为-CH₃，R₆为-OH，所述的倍半萜类化合物结构式如下：

优选的结构式之四是，为双键，R₁为-H，R₂为-OH，R₃为-CH₃，R₆为-CH₃，所述的倍半萜类化合物结构式如下：

优选的结构式之五是，为单键，R₁为-H，R₂为-OH，R₃为-CH₃，R₄为-H，R₅为-CH₃，R₆为-OH，所述的倍半萜类化合物结构式如下：

优选的结构式之六是，为单键，R₁为-H，R₂为-OH，R₃为-CH₃，R₄为-H，R₅为-CH₃，R₆为-OH，所述的倍半萜类化合物结构式如下：

其中，所述的植物病原真菌为甘蓝黑斑、烟草黑胫、辣椒炭疽、水稻胡麻叶、金桔沙皮、甘蔗凤梨、玉米大斑、茶轮斑或贡柑链格。

上述倍半萜类化合物的制备方法如下：

1、制备温莪术提取物

将温莪术药渣按常规用30～95％v/v的乙醇冷浸或者是热提，得到提取液，减压浓缩成膏状，即为温莪术提取物。

2、分离纯化

将上述提取物用水稀释制成悬浮液后，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩成浸膏并以硅胶拌样，以石油醚-乙酸乙酯混和溶剂(100:0―0:100,V/V)及乙酸乙酯-甲醇(100:0―0:100,V/V)按极性递增进行硅胶柱层析，并按每次约500mL收集馏分再经各种柱层析、薄层层析析分离得到6个倍半萜类化合物为：Wenyujinin O(1)、(1β,4α,5α,10α)-wenyujinins P(2)、Zedoarondiol(3)、Neoprocurcumenol(4)、Isozedoarondiol(5)以及Phaeocaulisin E(6)，其中1和2为新化合物。

其中，柱层析的条件为：用200～300目硅胶上柱，乙酸乙酯体积百分数为15％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为洗脱剂。

其中，薄层层析条件为：以乙酸乙酯体积百分数为20％的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂为展开剂。

其中，分子筛层析条件为：分子筛为Sephadex LH-20，以氯仿体积百分数为50％的氯仿-甲醇混合溶剂为洗脱剂。

有益效果：本发明首次发现了倍半萜化合物具有抗植物病原真菌的活性，可用于制备抗植物病原真菌的药物。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：倍半萜类化合物的制备

温莪术药渣5Kg按常规用70％v/v的乙醇浸提3次每次7天，得到提取液，将提取液减压浓缩成膏状，得到温莪术提取物1000g。将提取物用水稀释成悬浮液，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯萃取液浓缩成浸膏，进行硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯混和溶剂(100:0―0:100,V/V)及乙酸乙酯-甲醇(100:0―0:100,V/V)按极性递增进行硅胶柱层析，并按每次约500mL收集馏分。通过TLC检测合并相似流分，分成9个组分，即Fr.1―9。Fr.2进行分子筛柱层析，再分别用高效液相制备，洗脱剂为甲醇和水其体积配比为4:3，得到Wenyujinin O(22mg)、(1β,4α,5α,10α)-wenyujinins P(19mg)、Zedoarondiol(30mg)、Neoprocurcumenol(27mg)、Isozedoarondiol(15mg)以及Phaeocaulisin E(42mg)。

6个化合物的结构鉴定结果如下：

Wenyujinin O(1)：为淡黄色油状物。紫外254nm有暗斑，5％硫酸-香草醛显色显紫红色。旋光度为HR-ESI-MS m/z 275.1620[M+Na]⁺，分子量为252，结合¹H-NMR和¹³C NMR可知分子式为C₁₅H₂₄O₃，计算不饱和度为4。根据¹H-NMR和DEPT可知化合物中含有4个甲基信号[δ_H2.09(s,13-CH₃)、1.91(s,13-CH₃)、1.17(s,15-CH₃)]，其中1个连在次甲基上[δ_H1.0(d,2.814-CH₃)]；根据¹³C-NMR和DEPT可知化合物中4个亚甲基信号[δ_C23.6(C-2)、27.6(C-3)、28.8(C-6)、50.7(C-9)]；2个次甲基信号[δ_C58.8(C-1)、45.1(C-4)]；5个季碳：包括1个羰基碳信号[δ_C202.8(C-8)]、2个烯季碳信号[δ_C149.9(C-7),129.4(C-11)]、2个连羟基碳信号[δ_C81.7(C-5)，74.3(C-10)]。因此，可知化合物1为愈创木烷型倍半萜。根据HMBC可知：H-12/H-13与C-5/C-11/C-7/C-8/C-9/C-12/C-13相关，因此，从C-11-C-12-C-13-C-7-C-8-C-9相连组成一个α,β-不饱和羰基片段；H-15与C-1/C-8/C-9/C-10相关，表明C-15-C-10-C-1-C-9相连在一起组成一个片段；H-14与C-3/C-4/C-5相关，表明C-14-C-4-C-3-C-5相连组成一个片段；再根据¹H-¹H COSY可知，H-1与H-2与H-3与H-4相关，表明C-1-C-2-C-3-C-4相连组成一个片段。由此可知化合物的平面结构。化合物的相对构型是通过NOESY确定的，H-14、H-15、H-1相关，表明H-1、C-14和C-15为α-取向，化合物1为wenyujinin O。化合物1的¹H-NMR和¹³C-NMR数据见表1。

(1β,4α,5α,10α)-wenyujinins P(2)：为淡黄色油状物。紫外254nm有暗斑，5％硫酸-香草醛显色显紫红色。旋光度为HR-ESI-MS m/z275.1618[M+Na]⁺，分子量为252，结合¹H-NMR和¹³C-NMR谱可知分子式为C₁₅H₂₄O₃，不饱和度为4。根据¹H-NMR可知，化合物中含有4个甲基信号[δ_H1.86(s,13-CH₃)、1.80(s,13-CH₃)、1.08(s,14-CH₃)、1.14(s,15-CH₃)]。根据¹³C-NMR和DEPT可知：化合物含有15个碳信号：其中4个甲基信号[δ_C22.6(C-14)、22.6(C-12)、21.9(C-13)、20.4(C-15)]；4个亚甲基信号[δ_C22.8(C-2)、40.1(C-3)、29.1(C-6)、60.9(C-9)]；2个次甲基信号[δ_C56.7(C-1),52.5(C-5)]；5个季碳包括1个羰基信号[δ_C203.1(C-8)]，2个烯碳信号[δ_C140.0(C-11)、136.3(C-7)]，2个连羟基碳信号[δ_C79.6(C-4)、72.3(C-10)]。因此，可知化合物2为愈创木烷型倍半萜。根据HMBC可知：H-12/H-13与C-11/C-7/C-8/C-12/C-13相关，因此，从C-11-C-12-C-13-C-7-C-8相连组成一个α,β-不饱和基团片段；H-15与C-1/C-9/C-10相关，表明C-15-C-10-C-9相连在一起组成一个片段；H-14与C-3/C-4/C-5相关，表明C-14-C-4-C-3-C-5相连组成一个片段；再根据¹H-¹H COSY可知，H-1与H-2与H-3相关，表明C-1-C-2-C-3相连组成一个片段；H-5与H-6相关，表明C-5-C-6相连在一块。由此可知化合物的平面结构。化合物的相对构型为是通过NOESY确定的，H-14、H-15、H-5相关，表明H-5、C-14和C-15为α-取向，因此，H-1为β取向。故化合物2的相对构型为(1β,4α,5α,10α)-wenyujinins P。化合物2的¹H-NMR和¹³C-NMR数据见表1。

表1 化合物1，2的¹H-NMR和¹³C-NMR数据

Zedoarondiol(3)：为白色粉末；紫外254nm有暗斑，5％硫酸-香草醛显色显紫红色。ESI-MS m/z 253.2[M+H]⁺，可知化合物的分子量为252，结合¹H-NMR和¹³C-NMR可知该化合物的分子式为C₁₅H₂₄O₃。由¹H-NMR分析可知该化合物中至少含有22个H，有4个甲基信号[δ_H1.83(s,13-CH₃)、1.94(s,12-CH₃)、1.19(s,14-CH₃)、1.21(s,15-CH₃)]。由¹³C-NMR和DEPT谱分析可知该化合物中含有15个碳信号，其中4个甲基信号[δ_C22.9(C-14)、22.3(C-13)、22.0(C-12)、20.8(C-15)]；4个亚甲基信号[δ_C60.0(C-9)、39.9(C-3)、28.7(C-6)、23.0(C-2)]；2个次甲基信号[δ_C56.2(C-1)、52.2(C-5)]；5个季碳信号[δ_C202.9(C-8)、142.2(C-11)、134.8(C-7)、80.1(C-4)、72.9(C-10)]。由此可知，化合物3为愈创木烷型倍半萜类化合物。根据¹H-¹H COSY可知，C-1、C-2、C-3相连，C-5与C-6相连。再根据HMQC、HMBC可知化合物的平面结构，再根据NOESY可知，H-1与H-14相关，H-5与H-15相关，所以可以确定化合物的相对构型。以上数据与文献相一致，故化合物3为zedoarondiol。

Neoprocurcumenol(4)：为无色针状晶体；紫外254nm有暗斑，5％硫酸-香草醛显色显紫红色。ESI-MS m/z 235.2[M+H]⁺，可知化合物的分子量为234，结合¹H-NMR和¹³C-NMR分子式为C₁₅H₂₂O₂，计算不饱和度为5。根据¹H-NMR显示有4个甲基信号[δ_H1.90(s,C-13),1.80(s,C-12),1.65(s,C-15),1.13(s,C-14)]。根据¹³C-NMR和DEPT谱分析可知该化合物含有15个碳信号，包含有4个甲基信号[δ_C22.8(C-14)、21.9(C-12)、21.8(C-13)、21.5(C-15)]；4个亚甲基信号[δ_C28.2(C-3)、27.8(C-2)、51.1(C-9)、39.1(C-6)]；1个次甲基信号[δ_C54.1(C-5)]；6个季碳信号[δ_C204.2(C-8)、138.7(C-11)、137.2(C-10)、135.3(C-7)、122.5(C-1)、80.2(C-4)]。由此可知化合物4为愈创木烷型倍半萜类化合物。以上数据与文献一致，故化合物4为Neoprocurcumenol。

Isozedoarondiol(5)：为无色针状晶体；紫外254nm有暗斑，5％硫酸-香草醛显色显紫红色。ESI-MS m/z 253.2[M+H]⁺，可知化合物的分子量为252，结合¹H-NMR和¹³C-NMR可知化合物的分子式为C₁₅H₂₄O₃，计算不饱和度为4。由¹H-NMR分析可知，化合物中至少含有22个H信号，有4个甲基信号[δH 1.99(s,13-CH₃)、1.84(s,12-CH₃)、1.40(s,14-CH₃)、1.20(s,15-CH₃)]。由¹³C-NMR和DEPT谱分析可知，化合物中含有15个碳信号，其中有4个甲基信号[δ_C32.3(C-15)、25.0(C-14)、23.1(C-13)、22.3(C-12)]；4个亚甲基信号[δ_C50.4(C-9)、37.0(C-6)、27.5(C-3)、25.2(C-2)]；2个亚甲基信号[δ_C53.3(C-1)、51.6(C-5)]；5个季碳信号[δ_C203.4(C-8)、144.1(C-11)、134.0(C-7)、82.5(C-4)、73.3(C-10)]。因此，可知化合物5愈创木烷型倍半萜。根据¹H-¹H COSY可知，C-1、C2、C3相连，C5与C6相连。再根据HMQC、HMBC可知化合物的平面结构，再根据NOESY可知，H-1与H-5相关，H-14与H-15相关，所以可以确定化合物的相对构型。以上数据与文献^[10]相一致，故化合物5Isozedoarondiol。

Phaeocaulisin E(6)：为黄色油状物。紫外254nm有暗斑，5％硫酸-硫酸香草醛显色显紫红色。ESI-MS m/z 253.2[M+H]⁺，可知化合物的分子量为252，结合¹H-NMR和¹³C-NMR数据分析可知化合物的分子式为C₁₅H₂₄O₃。在紫外252nm下有最大吸收，表明化合物中含有一个α,β-不饱和羰基结构。红外3422nm下有吸收，表明有羟基存在。对比化合物6¹H-NMR和¹³CNMR数据和化合物2，3的数据可知，他们的结构相类似，具有相同的平面结构。根据NOESY相关判断可知，H-1和Me-14/Me-15相关，可知化合物的相对结构为1R,4S,5S,10S。以上数据与文献相一致，故化合物6为Phaeocaulisin E。

表2 化合物3–6的¹H NMR数据

表3 化合物3–6的¹³C NMR数据

实施例2：药理活性实验

植物病原真菌是农作物主要危害之一，是造成农业损失的主要原因之一。本发明通过检测Wenyujinin O、(1β,4α,5α,10α)-wenyujinins P、Zedoarondiol、Neoprocurcumenol、Isozedoarondiol以及Phaeocaulisin E对植物病原真菌的抑制作用，发现这一类化合物具有较好的抗植物病原真菌的抑制活性。

试验方法：微量稀释法，该方法常用于测定致病菌对敏感性药物或新药对细菌的抑制活性试验。一般使用96孔微量稀释板，其孔底呈U型，每孔容量0.20―0.30mL本法操作较方便，且培养基用量少，可用于大批量药敏试验。一般用MH培养基，将已配制好的药液在试管中作二倍浓度递减稀释，分别装于96孔板内或者用微量加液器直接在板孔内作二倍稀释，然后再接种稀释菌液，另外需留出一列孔作为药液对照，该孔列仅加培养基和菌液作为菌对照，试验完毕后，用微量搅拌器震荡混匀，再将96孔板置于28或37℃培养箱中温孵18―48h，用酶标仪测630nm下吸光度。

致病菌株的准备：

将活化好的9株致病菌分别接种于以灭菌处理过的LB培养基中，再将其放置于恒温振荡器中28摄氏度震荡培养24h。

化合物的初筛：

将培养好的致病菌用培养液进行稀释，稀释度为1:500-1:1000；将稀释后的含菌培养液分别定量加至96孔板的各个孔中；将样品配制成1mg/mL,分别取定量加至各个孔中。加完后置于恒温培养箱中28℃恒温培养48h，而后用酶标仪在630nm下测各孔吸光度。试验结果表明Wenyujinin O、(1β,4α,5α,10α)-wenyujinins P、Zedoarondiol、Neoprocurcumenol、Isozedoarondiol以及Phaeocaulisin E对9株植物病原真菌(甘蓝黑斑、烟草黑胫、辣椒炭疽、水稻胡麻叶、金桔沙皮、甘蔗凤梨、玉米大斑、茶轮斑以及贡柑链格)都有抑制活性。

最小抑菌浓度的测试：

将培养好的致病菌用培养液进行稀释，稀释度为1:500-1:1000；将稀释后的含菌培养液分别定量加至96孔板的第一排各孔中，让后一次向下成倍稀释；然后将各样品分别加入至各列孔中。加完后置于恒温培养箱中28℃恒温培养48h，而后用酶标仪在630nm下测各孔吸光度。其结果见表4。

表4 温莪术中倍半萜类化合物对9株致病菌的最小抑制浓度

试验结果表明倍半萜化合物具有抗植物病原真菌的活性。化合物1–6都表现出广谱的抗菌活性并且大部分都表现出与阳性对照(咪鲜胺)一致的活性。

Claims

1.倍半萜类化合物在抗植物病原真菌中的应用，其特征在于，所述的倍半萜类化合物结构式如下：

其中，

为双键或单键；

当为双键时，R₁、R₂、R₃、R₆分别独立选自-OH或-CH₃或-H，R4和R5不存在；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，为单键，R₁为-OH，R₂为-CH₃，R₃为-H，R₄为-H，R₅为-OH，R₆为-CH₃，所述的倍半萜类化合物结构式如下：

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，为单键，R₁为-H，R₂为-CH₃，R₃为-OH，R₄为-H，R₅为-OH，R₆为-CH₃，所述的倍半萜类化合物结构式如下：

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，为单键，R₁为-H，R₂为-CH₃，R₃为-OH，R₄为-H，R₅为-CH₃，R₆为-OH，所述的倍半萜类化合物结构式如下：

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，为双键，R₁为-H，R₂为-OH，R₃为-CH₃，R₆为-CH₃，所述的倍半萜类化合物结构式如下：

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，为单键，R₁为-H，R₂为-OH，R₃为-CH₃，R₄为-H，R₅为-CH₃，R₆为-OH，所述的倍半萜类化合物结构式如下：

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，R₁为-H，R₂为-OH，R₃为-CH₃，R₄为-H，R₅为-CH₃，R₆为-OH，所述的倍半萜类化合物结构式如下：