CN108129309B - 一类具有抗肿瘤活性的艾里莫芬烷倍半萜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物化学领域，具体涉及一类具有抗肿瘤活性的艾里莫芬烷倍半萜及其制备方法。本发明通过粉碎、干燥、冷浸、脱色、洗脱，从藏橐吾植物中分离出一类全新的具有极佳抗肿瘤活性的艾里莫芬烷倍半萜，为该类倍半萜提供了新的活性结构，为其结构修饰和开发利用提供了新思路。本发明提供的艾里莫芬烷倍半萜，制备方法简单，可实际应用于肝癌、胃癌、宫颈癌、白血病等疾病的防治。

Description

一类具有抗肿瘤活性的艾里莫芬烷倍半萜及其制备方法
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及一类具有抗肿瘤活性的艾里莫芬烷倍半萜及其制备方法。
背景技术
橐吾属植物属于菊科，千里光族，包括130种，主要分布在亚洲地区；其中超过100种分布在我国境内，主要集中在西南地区。很多橐吾属植物的根及根茎在民间被作为山紫菀入药，具有温肺止痰、平喘止咳、润肺降气的功效，尤其在新疆、云南、青海和西藏等地区被经常使用。从橐吾属植物中提取的化合物，具有抗菌活性、细胞毒活性、杀虫和拒食活性、抗肝毒活性等。
倍半萜类成分广泛存在于菊科植物中，也是菊科植物的特色成分之一。因其多变新颖的结构类型和广泛的生物活性，倍半萜类成为各国学者的研究热点之一，其中又以艾里莫芬烷倍半萜为主。目前，从橐吾属植物中分离得到的艾里莫芬烷倍半萜已有500余个。
但在已分离得到的艾里莫芬烷倍半萜中，只有一部分具有抗肿瘤活性。该类倍半萜的哪些结构是其发挥抗肿瘤作用的关键性结构，哪些是辅助结构，哪些是次要甚至无效结构，现在还处于研究的初级阶段。
现有研究中，较为公认的活性结构为内酯环。如申请号为200710067459.3的发明，报道了一个结构新颖的艾里莫芬双内酯二聚体及其制备方法，该化合物可明显抑制人口腔上皮癌细胞(KB)和人肝癌细胞(BEL-7404)生长活性；专利号为ZL.200610051719.3的发明，也报道了一个可抑制人口腔上皮癌细胞(KB)和人肝癌细胞(BEL-7404)生长活性的艾里莫芬双内酯天然产物。
但上述报道均只说明了这类带内酯环的倍半萜具有抗肿瘤活性，并未阐述内酯环与活性的确切关系。直到2008年，一篇名为“艾里莫芬烷倍半萜抗白血病构效关系研究”的报道，通过对比试验，才首次指出，该类倍半萜中，并呋喃结构可能是无效结构，内酯环结构可能是关键的活性基团，但仍需进一步研究证明这一观点。
艾里莫芬烷倍半萜种类繁多，提取或合成新的、具有抗肿瘤活性，且其活性结构未被探讨过的艾里莫芬烷倍半萜，有助于深入认识其抗肿瘤效应的作用机理，对该类倍半萜的结构修饰和开发利用具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是一类具有抗肿瘤活性的艾里莫芬烷倍半萜及其制备方法。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一类艾里莫芬烷倍半萜，化学通式为：C15H20OR1R2；结构通式为：
Figure GDA0002544735990000021
所述的R1基团为H、OH、OCH3、OC2H5、OCOCH3中的一种；
所述的R2基团为一类含有酯基或羟基的基团。
相应的，一种抗肿瘤药物的活性成分，其活性成分为：所述的艾里莫芬烷倍半萜。
优选的，所述的具有抗肿瘤活性的艾里莫芬烷倍半萜，R1基团为H时，R2基团为(3-methylbutanoyl)oxy，化学式为：C20H30O3，结构式为：
Figure GDA0002544735990000022
优选的，所述的具有抗肿瘤活性的艾里莫芬烷倍半萜，R1基团为H时，R2基团为(3-methylpentanoyl)oxy，化学式为：C21H32O3，结构式为：
Figure GDA0002544735990000031
优选的，所述的具有抗肿瘤活性的艾里莫芬烷倍半萜，当所述R1基团为OH、OCH3、OC2H5、OCOCH3中的一种时，R2基团为OH、OCH3、angeloyloxy、tigloyloxy、(3-methylbutanoyl)oxy、(3-methylpentanoyl)oxy、(2-methylbutanoyl)oxy、(3-methylpentanoyl)oxy、senecioyloxy、(4-methylsenecioyl)oxy中的一种。
优选的，所述的具有抗肿瘤活性的艾里莫芬烷倍半萜，R1基团为OH时，R2基团为angeloyloxy，化学式为：C20H28O4，结构式为：
Figure GDA0002544735990000032
优选的，所述的具有抗肿瘤活性的艾里莫芬烷倍半萜，R1基团为OH时，R2基团为angeloyloxy，化学式为：C20H28O4，结构式为：
Figure GDA0002544735990000033
相应的，所述的艾里莫芬烷倍半萜的制备方法，包括如下步骤：
(1)取藏橐吾全株，干燥并粉碎，用甲醇冷浸，将浸取液浓缩为浸膏；
(2)将所述浸膏经MCI柱脱色，得各组分；
(3)将所述各组分，分别经正相色谱柱、反相色谱柱、凝胶色谱柱和HPLC进行洗脱和分离，得所述的艾里莫芬烷倍半萜。
优选的，所述的艾里莫芬烷倍半萜的制备方法，步骤(3)所述的各色谱柱材料包括：硅胶、C18烷基键合硅胶和交联葡聚糖LH-20。
优选的，所述的艾里莫芬烷倍半萜的制备方法，步骤(3)所述的正相色谱柱洗脱的洗脱剂为：石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇中的一种或任意两种的混合溶剂。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明公开了一类全新的艾里莫芬烷倍半萜；
2、本发明提供的艾里莫芬烷倍半萜，结构中不包含常规认为的主要活性结构：内酯环，但仍然对多种肿瘤细胞具有极强的抗肿瘤活性；
3、本发明提供了新的艾里莫芬烷倍半萜的活性结构，为该类倍半萜的结构修饰和开发利用提供了新思路；
4、本发明提供的艾里莫芬烷倍半萜，制备方法简单，可实际应用于肝癌、胃癌、宫颈癌、白血病等疾病的防治。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明技术方案，下面用具有代表性的实施例来进一步说明。本领域技术人员应当明确，在本实施例基础上，适当调整合成原料、工艺方法和参数以达到相同目的，都在本发明保护范围内。
实施例1：制备化合物1～4
因本发明涉及多个名称复杂的化合物，为更方便地进行说明和阐述，全文对重要化合物进行标号处理，标号方式为：化合物+数字，如本例所示，将1α-hydroxyl-petasin简称为：化合物1。
1、分离得到化合物1～4：
干燥藏橐吾全草10kg，粉碎后用100％的甲醇(每次50L)于室温下冷浸3次，每次2天。提取液浓缩后得浸膏2.5kg，用100～200目(约4kg)硅胶拌样，过正相硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯按体积比分别为1:0、100:1、20:1、10:1、5:1、2:1，进行梯度洗脱，经TLC检测合并相同部分，得5个组分，各组分分别经过MCI色谱柱，90％甲醇水溶液洗脱，除去色素得到组分A～E。
其中，C组分以聚酰胺(80～100目)拌样，经RP-18反相色谱柱，以甲醇：水按体积比分别为60:40、70:30、80:20、90:10，进行梯度洗脱，经TLC检测合并相同部分，得到10个组分：C1～C10。所述的C2和C8组分再分别经正相色谱柱、凝胶色谱柱和HPLC分离，得到化合物3(65.2mg)和化合物4(20.0mg)。
所述的D组分以聚酰胺(80～100目)拌样，经RP-18反相色谱柱，以甲醇：水按体积比分别为50:50、60:40、70:30、80:20、90:10，进行梯度洗脱，经TLC检测合并相同部分，得到5个组分：D1～D5。将所述的D1组分再分别经正相色谱柱、凝胶色谱柱和HPLC分离，得到化合物1(6.1mg)和化合物2(4.2mg)。
2、化合物1～4结构解析：
(1)化合物1，无色油状物，[α]20 D+24(c 0.2,MeOH)。ESI-MS谱给出准分子离子峰为m/z 355[M+Na]+，结合高分辨质谱HRESIMS m/z 355.1880[M+Na]+(calcd for C20H28O4Na,355.1880)和13C NMR谱提供的信息，确定其分子式为C20H28O4。
IR光谱显示存在羟基(3475cm-1)和羰基(1710cm-1)基团。分析1H和13C NMR谱，表明化合物1中含有20个碳信号，除了一个AngO酯侧链取代外，剩下15个碳信号归属为3个甲基(1个是双峰)，3个亚甲基(1个末端双键)，5个次甲基(2个被氧化的和一个烯烃的)和4个季碳(1个羰基和2个烯碳)。以上1D NMR数据得出，化合物1为一艾里莫芬烷倍半萜。
结合2D NMR数据，确定化合物为petasin类似物。不同的是C-1位具有羟基取代。根据ROESY相关信号，确定该化合物的相对构象。因此，化合物1确定为1α-hydroxyl-petasin。
(2)化合物2，无色油状物，[α]20 D+15(c 0.2,MeOH)。ESI-MS谱给出准分子离子峰为m/z 355[M+Na]+，结合高分辨质谱HRESIMS m/z 355.1884[M+Na]+(calcd for C20H28O4Na,355.1880)和13C NMR谱提供的信息，确定其分子式为C20H28O4。
仔细分析其NMR谱，发现化合物2是化合物1的差向异构体，不同之处在于C-1位的羟基构象。因为C-1的化学位移在两个化合物中存在ΔδC-7.0的差异。因此确定了化合物2的结构为1β-hydroxyl-petasin。
(3)化合物3，无色油状物，[α]20 D+40(c 0.3,MeOH)。ESI-MS谱给出准分子离子峰为m/z 341[M+Na]+，结合高分辨质谱HRESIMS m/z 341.2088[M+Na]+(calcd for C20H30O3Na,341.2087)和13C NMR谱提供的信息，确定其分子式为C20H30O3。
分析其1H、13C和DEPT NMR谱，得出化合物3为一典型的艾里莫芬烷倍半萜，C-3位的酯基团为(3-methylbutanoyl)oxy，简称为ValO。
(4)化合物4，无色油状物，[α]20 D+30(c 0.3,MeOH)。ESI-MS谱给出准分子离子峰为m/z 355[M+Na]+，结合高分辨质谱HRESIMS m/z 355.2247[M+Na]+(calcd for C21H32O3Na,355.2244)和13C NMR谱提供的信息，确定其分子式为C21H32O3。
分析其1H、13C和DEPT NMR谱，得出化合物4为一典型的艾里莫芬烷倍半萜，C-3位的酯基团为(3-methylpentanoyl)oxy，简称为：MevalO。
3、化合物1～4的1H NMR波谱数据如表1所示。
表1.化合物1～4的1H NMR波谱数据
Figure GDA0002544735990000061
Figure GDA0002544735990000071
4、化合物1～4的13C NMR波谱数据如表2所示。
表2.化合物1～4的13C NMR波谱数据
Figure GDA0002544735990000072
Figure GDA0002544735990000081
5、化合物1～4的结构通式为：
Figure GDA0002544735990000082
化学通式为：C15H20OR1R2。
化合物1～4的具体结构为：
Figure GDA0002544735990000083
实施例2：化合物1～4的抗肿瘤活性
1、准备试剂
(1)RPMI-1640、IMDM和DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司(Life technologiescorporation)；
(2)二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Sigma公司(USA)产品；
(3)taxol购自成都曼斯特公司。
2、准备待测细胞
(1)人白血病细胞株MV4-11、人肺癌细胞株A549、人胃癌细胞株HGC-27、人宫颈癌细胞Hela，均购于美国ATCC公司，由本实验室保存。
(2)各细胞培养基均含10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。用RPMI-1640培养A-549、HGC-27细胞；用IMDM培养MV4-11细胞；用DMEM培养Hela细胞。培养条件为：5％CO2、37℃。
3、肿瘤细胞体外活性抑制
利用MTT法检测化合物1～4对多种肿瘤细胞的体外抑制活性。采用含FBS和抗生素的各培养基分别培养各细胞，具体为：RPMI-1640培养基对A-549、HGC-27进行培养，DMEM对Hela进行培养，IMDM培养基对MV4-11进行培养，待肿瘤细胞生长至对数生长期时，收集细胞，并将其按照3000～15000个细胞/孔的量接种到96孔板内。24小时后，分别将梯度浓度为10μg/mL、3μg/mL、1μg/mL、0.3μg/mL、0.1μg/mL、0.03μg/mL、0.01μg/mL的化合物1～4加入所述各细胞培养基中，并置于细胞培养箱中培养；同时，在旁孔内分别加入梯度浓度为1μg/mL、0.3μg/mL、0.1μg/mL、0.03μg/mL、0.01μg/mL、0.003μg/mL、001μg/mL的taxol作为阳性平行对照，并置于细胞培养箱中培养。72小时后，加入5mg/mL的MTT无菌溶液，加入量为：20μL/孔，并在作用2～4小时后加入SDS三联液，过夜。最后，利用酶标仪检测各加样孔对570nm光束的吸光度值，并利用公式：抑制率＝(1-药物组A570nm值/对照组A570nm值*100％)，计算抑制率，并分别统计化合物1～4对各细胞的半数抑制浓度，各数据重复三次，计算平均值。
4、化合物1～4对各种细胞株的增殖抑制活性(IC50)结果如表3所示：
表3.化合物1～4抑制多种肿瘤细胞生长的IC50值(μg/mL)
No. A549 HGC-27 HeLa MV4-11
1 2.1±0.6 0.7±0.3 0.8±0.3 0.17±0.03
2 4.5±2.4 2.4±0.9 1.9±1.1 0.82±0.27
3 3.1±1.2 1.7±0.6 2.1±0.5 2.38±0.24
4 2.2±0.5 1.2±0.3 1.1±0.4 0.37±0.16
taxol 0.041±0.013 0.023±0.006 0.037±0.018 0.014±0.005
由表3可见，化合物1～4对A549非小细胞肺癌细胞、HGC-27胃癌细胞、HeLa宫颈癌细胞和MV4-11白血病细胞的生长均有明显的抑制作用。尤其是对MV4-11白血病细胞的抑制活性极强，可望成为活性成分用于制备各种抗肿瘤药物制剂。

Claims (1)

1.一类艾里莫芬烷倍半萜的制备方法，其特征在于：所述艾里莫芬烷倍半萜为化合物1、化合物2、化合物3、化合物4中的任意一种；
化合物1的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
，
化合物2的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
，
化合物3的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
，
化合物4的结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
，
所述制备方法包括如下步骤：
（1）取藏橐吾全株，干燥并粉碎，用甲醇冷浸，将浸取液浓缩为浸膏，用100～200目硅胶拌样，过正相硅胶柱，以石油醚：乙酸乙酯按体积比分别为1:0、100:1、20:1、10:1、5:1、2:1，进行梯度洗脱，经TLC检测合并相同部分，得5个组分；
（2）将各组分分别经MCI柱脱色，得组分A～E；
（3）将C组分以聚酰胺拌样，经RP-18反相色谱柱，以甲醇：水按体积比分别为60:40、70:30、80:20、90:10，进行梯度洗脱，经TLC检测合并相同部分，得到10个组分：C1～C10；所述的C2和C8组分再分别经正相色谱柱、凝胶色谱柱和HPLC分离，得到化合物3和化合物4；
（4）将所述的D组分以聚酰胺拌样，经RP-18反相色谱柱，以甲醇：水按体积比分别为50:50、60:40、70:30、80:20、90:10，进行梯度洗脱，经TLC检测合并相同部分，得到5个组分：D1～D5；将所述的D1组分再分别经正相色谱柱、凝胶色谱柱和HPLC分离，得到化合物1和化合物2。
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