CN107805238B - 一种假白榄烷型二萜内酯及制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种假白榄烷型二萜内酯类化合物及其制备方法和用途。所述假白榄烷型二萜内酯是从以对叶大戟的果实为原料,用有机溶剂提取,通过溶剂萃取法、正相硅胶柱层析法、反相硅胶柱层析法、Sephadex LH‑20凝胶柱层析法中的三种至四种方法进行分离,采取薄层层析法检测分析,得到三个新的假白榄烷型二萜内酯类化合物,并对这三个化合物进行了多药耐药逆转活性测定,结果表明:所述三个新的假白榄烷型二萜内酯类化合物具有不同程度的多药耐药逆转活性,与抗肿瘤药物组合使用可不同程度地逆转耐药细胞对抗肿瘤药物的耐药性,可用于制备多药耐药逆转药物。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体涉及三个假白榄烷型二萜内酯类化合物及其制备方法和用途。
背景技术
大环二萜类化合物,即分子中含有六元以上环状结构的二萜类化合物,骨架结构丰富多变,生物活性多种多样,包括细胞毒、多药耐药逆转、抗菌、抗HIV病毒等。目前已经发现的假白榄烷(Jatrophane)二萜的数量最多,假白榄烷二萜的结构特点是骨架由一个五元环和一个十二元环稠合而成,即5/12环系。经过前期研究发现,假白榄烷二萜通常是高氧化态并普遍具有分子量700以上的较大分子结构,其结构之所以丰富,是因为在骨架上常具有各种取代基,如乙酰氧基、丙酰氧基、苯甲酰氧基、异丁酰氧基、吡啶酰氧-3-基等。这些取代基在环上的位置不同,数目不同,构型不同,形成了这类化合物的丰富多变性。目前已报道的从对叶大戟中得到的化合物有50余个,主要包括黄酮及其苷、甾醇、香豆素、大环二萜、三萜、嘧啶、腺苷、神经鞘脂、鞣花酸等。2013年本课题组申请专利“对叶大戟果实中的大环二萜类化合物及其制备方法和用途”中的六个化合物为假白榄烷型大环二萜中的同一类型化合物,而本次研究中的三个新型化合物为对叶大戟中首次发现的假白榄烷型骨架的内酯类化合物,在C-5,6位有一个六元或八元环内酯结构,该内酯环对其生物活性有较大的影响,与前者有根本区别,因此,不能通过现有活性研究结果推测新化合物的生物活性。本研究在前期基础上,对对叶大戟的化学成分进一步挖掘研究,对明确其次生代谢产物提供参考,也为揭示其药效作用的物质基础提供依据。
肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MDR),即一种药物作用于肿瘤使之产生耐药性后,该肿瘤对从未接触、结构无关、靶点不同、机制各异的多种抗肿瘤药也具有交叉耐药性的现象。MDR有多种形成机制,其中最主要的机制之一是ABC家族转运蛋白(目前研究最广泛、最深入的为ABCB1基因编码的P-糖蛋白,P-gp)的过表达,导致药物外排增加,形成耐药性。近年来,许多从植物中分离得到的假白榄烷二萜类化合物被发现具有显著的MDR逆转活性,因而成为研究热点之一。2013年本课题组申请的专利“对叶大戟果实中的大环二萜类化合物及其制备方法和用途”中进行了“抗耐药逆转活性”测定,该活性旨在考察肿瘤耐药细胞对专利中所指化合物的耐药指数,用于评价耐药性,而本研究在前期基础上检测了新化合物的“耐药逆转活性”,旨在考察新化合物与传统抗肿瘤药物联用后,能否通过竞争性结合耐药细胞膜上的转运蛋白,充当其底物,达到逆转耐药细胞耐药性的目的,使得传统抗肿瘤药物能够在细胞内发挥杀伤肿瘤细胞的作用,用于评价新化合物的有效性。
发明内容
本发明目的在于,提供一种假白榄烷型二萜内酯及制备方法和用途,所述假白榄烷型二萜内酯是从对叶大戟(Euphorbia sororia A.Schrenk)的果实中分离得到三个新的假白榄烷型二萜内酯类化合物,并对得到的三个新的假白榄烷型二萜内酯类化合物进行了多药耐药逆转活性测定,结果表明:所述的三个新的假白榄烷型二萜内酯具有不同程度的多药耐药逆转活性,与抗肿瘤药物组合使用可不同程度地逆转耐药细胞对抗肿瘤药物的耐药性,可用于制备多药耐药逆转药物。
本发明所述的一种假白榄烷型二萜内酯类化合物,该化合物的结构式为:
其中:式(Ⅰ)化合物为(2R*,3R*,4R*,5R*,6R*,7R*,8S*,9S*,13S*,14S*,15R*)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮;
式(Ⅱ)化合物为(2R,3R,4R,5R,6S,7R,8S,9S,13S,14S,15R)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮;
式(Ⅲ)化合物为(1S*,2S*,3R*,4S*,5R*,6S*,7R*,8S*,9S*,11S*,12S*,13S*,14S*,15R*)-5-苯甲酰氧基-6,15-二羟基-11,12-环氧-1,2,7,8,9,14-六乙酰氧基假白榄烷-3,6-辛内酯-22-酮。
所述一种假白榄烷型二萜内酯类化合物的制备方法,按下列步骤进行:
a、以对叶大戟的果实为原料,粉碎后用5-10倍量体积浓度为50-99%的乙醇水溶液、无水乙醇、纯丙酮、体积浓度为50-99%的甲醇水溶液、无水甲醇进行室温下的渗漉或冷浸提取,或加热回流提取,浓缩得到对叶大戟的粗提物;
b、将步骤a得到的粗提物用乙醇分散,加入石油醚、正己烷或环己烷萃取,或将粗提物用石油醚、正己烷或环己烷分散,再加入乙醇萃取3-5次,将乙醇萃取液浓缩,得到乙醇萃取物浸膏;
c、将步骤b得到的乙醇萃取物浸膏经正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、SephadexLH-20凝胶柱层析法中的两种或三种进行分离,即得到式(Ⅰ)化合物为(2R*,3R*,4R*,5R*,6R*,7R*,8S*,9S*,13S*,14S*,15R*)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮;式(Ⅱ)化合物为(2R,3R,4R,5R,6S,7R,8S,9S,13S,14S,15R)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮;式(Ⅲ)化合物为(1S*,2S*,3R*,4S*,5R*,6S*,7R*,8S*,9S*,11S*,12S*,13S*,14S*,15R*)-5-苯甲酰氧基-6,15-二羟基-11,12-环氧-1,2,7,8,9,14-六乙酰氧基假白榄烷-3,6-辛内酯-22-酮。
步骤c中所用正相硅胶柱层析法为常压或加压柱层析,所用填料为硅胶,所用洗脱剂为石油醚、环己烷、正己烷、丙酮、三氯甲烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中至少两种溶剂的混合物,采用等度洗脱或梯度洗脱。
步骤c中所用反相硅胶柱层析法为常压或加压柱层析,洗脱剂为体积浓度为65-99%的甲醇水溶液或55-99%的乙腈水溶液,采用等度洗脱或梯度洗脱。
步骤c中所用Sephadex LH-20凝胶柱层析法为常压柱层析,洗脱剂为甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷或它们中至少两种溶剂的混合物,采用等度洗脱或梯度洗脱。
所述一种假白榄烷型二萜内酯类化合物中的式(Ⅰ)和式(Ⅱ)化合物在制备多药耐药逆转药物中的用途。
本发明所述的一种假白榄烷型二萜内酯类化合物,通过所述方法获得的三个新型假白榄烷型二萜内酯类化合物进行了体外细胞毒活性测定及耐药逆转活性测定,实验结果表明:所述式(Ⅰ)-式(Ⅲ)化合物对人乳腺癌细胞株MCF-7及人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR有较弱的细胞毒活性,并且式(Ⅰ)和式(Ⅱ)化合物具有不同程度的多药耐药逆转活性。
本发明所述的一种假白榄烷型二萜内酯类化合物,可通过从植物中分离纯化得到,也可以经本领域技术人员熟知的化学修饰方法合成获得。
本发明所述的一种假白榄烷型二萜内酯类化合物,采用高分辨质谱、一维和二维核磁共振谱等现代波谱手段确定其结构,结构鉴定过程如下:
式(Ⅰ)化合物为白色无定型粉末,+2.0(c 0.1,MeOH);UV(MeOH)λmax(logε)201(2.91),228(2.85),281(1.56)nm;ECD(MeOH)207(Δε-0.64),231(Δε-1.25)nm;通过其HRESI(+)MS数据(m/z 825.3309[M+Na]+,计算值为C41H54O16Na 825.3310)确定其分子式为C41H54O16;根据1H,13C NMR以及二维核磁共振数据确定其结构,骨架类型为假白榄烷(Jatrophane)型,命名为(2R*,3R*,4R*,5R*,6R*,7R*,8S*,9S*,13S*,14S*,15R*)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮。其1H和13C NMR归属见表1[400MHz(1H),100MHz(13C),CDCl3]。
式(Ⅱ)化合物为白色无定型粉末,+21.0(c 0.1,MeOH);UV(MeOH)λmax(logε)201(3.06),231(2.92),283(1.86)nm;ECD(MeOH)201(Δε-0.19),204(Δε+3.28),223(Δε-2.03),248(Δε+2.94)nm;根据其13C NMR和HRESI(+)MS数据(m/z 825.3312[M+Na]+,理论值C41H54O16Na 825.3310)确定其分子式为C41H54O16。根据1H,13C NMR以及二维核磁共振数据确定其结构,骨架类型为假白榄烷(Jatrophane)型,命名为(2R,3R,4R,5R,6S,7R,8S,9S,13S,14S,15R)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮;其1H和13C NMR归属见表1[400MHz(1H),100MHz(13C),CDCl3]。
式(Ⅲ)化合物为白色无定型粉末,-5.0(c 0.1,MeOH);UV(MeOH)λmax(logε)200(3.24),228(3.09),281(1.97)nm;ECD(MeOH)202(Δε-4.68),230(Δε+0.72),245(Δε-2.30)nm;根据其HRESI(+)MS数据(m/z 871.3001[M+Na]+,理论值C41H52O19Na 871.3000)判断其分子式为C41H52O19;根据1H,13C NMR以及二维核磁共振数据确定其结构,骨架类型为假白榄烷(Jatrophane)型,命名为(1S*,2S*,3R*,4S*,5R*,6S*,7R*,8S*,9S*,11S*,12S*,13S*,14S*,15R*)-5-苯甲酰氧基-6,15-二羟基-11,12-环氧-1,2,7,8,9,14-六乙酰氧基假白榄烷-3,6-辛内酯-22-酮;其1H和13C NMR数据归属见表1[400MHz(1H),100MHz(13C),溶剂:CD3COCD3]。
表1.式(Ⅰ)、式(Ⅱ)、式(Ⅲ)化合物的1H和13C NMR数据[δ(ppm),J(Hz)]
附图说明
图1为本发明式(Ⅰ)化合物的1H NMR(400MHz,CDCl3)谱图;
图2为本发明式(Ⅰ)化合物的13C NMR(100MHz,CDCl3)谱图;
图3为本发明式(Ⅱ)化合物的1H NMR(400MHz,CDCl3)谱图;
图4为本发明式(Ⅱ)化合物的13C NMR(100MHz,CDCl3)谱图;
图5为本发明式(Ⅲ)化合物的1H NMR(400MHz,CD3COCD3)谱图;
图6为本发明式(Ⅲ)化合物的13C NMR(100MHz,CD3COCD3)谱图。
具体实施方式
所用试剂均为分析纯,高效液相色谱中乙腈为HPLC级别(美国Thermo Fisher公司)。柱层析硅胶(100-200目,200-300目):青岛海洋化工厂生产;薄层层析硅胶为HSGF254,烟台市黄务硅胶开发试验厂生产;Sephadex LH-20凝胶:Pharmacia Company生产。高效液相色谱(美国DIONEX公司):P680HPLC泵,ASI-100自动进样器,TCC-100柱温箱,UVD170U紫外检测器(四波长),四元溶剂系统,在线脱气机,Chromeleon色谱工作站。制备高效液相色谱(美国DIONEX公司):P680HPLC泵,UVD170U紫外检测器(四波长),四元溶剂系统,在线脱气机,Chromeleon色谱工作站。质谱用QSTAR Elite质谱仪(Applied Biosystems/MDSSciex公司)测定;核磁共振用Varian Vnmrs 600/400型核磁共振仪(美国Varian公司)测定。
对叶大戟果实采自新疆维吾尔自治区吉木萨尔县,由中国科学院新疆生态地理研究所标本馆冯缨副研究员鉴定为Euphorbia sororia A.Schrenk。
实施例1
a、取对叶大戟的果实10kg,粉碎后用50L的浓度为50%的乙醇-水溶液室温下冷浸提取,减压蒸干溶剂得到对叶大戟粗提物;
b、将步骤a得到的粗提物用乙醇分散,加入石油醚进行萃取,合并乙醇层并减压蒸干得到乙醇萃取物浸膏;
c、将步骤b得到的乙醇萃取物浸膏用正相硅胶柱分离,用体积比10:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱,流分经硅胶薄层层析(TLC)分析,合并相同流分,得到6个组分(F1-F6);将组分F4进行正相硅胶柱分离,以体积比为100:0-0:100的氯仿-丙酮进行梯度洗脱,得到组分F4A-F4D;将组分F4B经RP-18反相柱分离,以浓度为65%-100%的甲醇-水溶液梯度洗脱,收集65%甲醇-水溶液(F4B1)和80%甲醇-水溶液(F4B3),减压蒸干,F4B1段采用正相硅胶柱分离,采用体积比为20:1-0:1的正己烷-丙酮进行梯度洗脱,得到组分F4B1A-F4B1K,对F4B1K段采用制备反相柱(C18 5μm 10×250mm)分离,以浓度为55%的乙腈-水溶液等度洗脱,得到式(Ⅰ)化合物为(2R*,3R*,4R*,5R*,6R*,7R*,8S*,9S*,13S*,14S*
,15R*)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮和式(Ⅱ)化合物为(2R,3R,4R,5R,6S,7R,8S,9S,13S,14S,15R)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮;将组分F5进行正相硅胶柱分离,以体积比为100:0-0:100的正己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱,得到组分F5A-F5D,将组分F5B经Sephadex LH-20凝胶柱分离,用体积比为1:1的二氯甲烷-甲醇洗脱,得到式(Ⅲ)化合物为(1S*,2S*,3R*,4S*,5R*,6S*,7R*,8S*,9S*,11S*,12S*,13S*,14S*,15R*)-5-苯甲酰氧基-6,15-二羟基-11,12-环氧-1,2,7,8,9,14-六乙酰氧基假白榄烷-3,6-辛内酯-22-酮。
实施例2
a、取对叶大戟的果实10kg,粉碎后用60L浓度为99%的乙醇-水溶液温度80℃下回流提取,减压蒸干溶剂得到对叶大戟粗提物;
b、将步骤a得到的粗提物用乙醇分散,加入正己烷进行萃取,合并乙醇层并减压蒸干得到乙醇萃取物浸膏;
c、将步骤b得到的乙醇萃取物浸膏用正相硅胶柱分离,用体积比10:1-0:1的正己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱,流分经硅胶薄层层析(TLC)分析,合并相同流分,得到6个组分(F1-F6);将组分F4进行正相硅胶柱分离,以体积比为100:0-0:100的氯仿-甲醇进行梯度洗脱,得到组分F4A-F4D;将组分F4B经RP-18反相柱分离,以浓度为80%-100%的乙腈-水溶液梯度洗脱,收集80%乙腈-水溶液(F4B1)和90%乙腈-水溶液(F4B3),减压蒸干,F4B1段采用正相硅胶柱分离,采用体积比为20:1-0:1的正己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱,得到组分F4B1A-F4B1K,对F4B1K段采用制备反相柱(C18 5μm 10×250mm)分离,以浓度为70%的甲醇-水溶液等度洗脱,得到式(Ⅰ)化合物为(2R*,3R*,4R*,5R*,6R*,7R*,8S*,9S*,13S*,14S*,15R*)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮和式(Ⅱ)化合物为(2R,3R,4R,5R,6S,7R,8S,9S,13S,14S,15R)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮;将组分F5进行正相硅胶柱分离,以体积比为100:0-0:100的正己烷-丙酮进行梯度洗脱,得到组分F5A-F5D,将组分F5B经Sephadex LH-20凝胶柱分离,用无水甲醇洗脱,得到式(Ⅲ)化合物为(1S*,2S*,3R*,4S*,5R*,6S*,7R*,8S*,9S*,11S*,12S*,13S*,14S*,15R*)-5-苯甲酰氧基-6,15-二羟基-11,12-环氧-1,2,7,8,9,14-六乙酰氧基假白榄烷-3,6-辛内酯-22-酮。
实施例3
a、取对叶大戟的果实10kg,粉碎后用80L的无水乙醇室温下渗漉提取,减压蒸干溶剂得到对叶大戟粗提物;
b、将步骤a得到的粗提物用乙醇分散,加入环己烷进行萃取,合并乙醇层并减压蒸干得到乙醇萃取物浸膏;
c、将步骤b得到的乙醇萃取物浸膏用正相硅胶柱分离,用体积比10:1-0:1的环己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱,流分经硅胶薄层层析(TLC)分析,合并相同流分,得到6个组分(F1-F6);将组分F4进行正相硅胶柱分离,以体积比为100:0-0:100的二氯甲烷-丙酮进行梯度洗脱,得到组分F4A-F4D;将组分F4B经RP-18反相柱分离,以浓度为65%-100%的甲醇-水溶液梯度洗脱,收集65%甲醇-水溶液(F4B1)和80%甲醇-水溶液(F4B3),减压蒸干,F4B1段采用正相硅胶柱分离,采用体积比为20:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱,得到组分F4B1A-F4B1K,对F4B1K段采用制备反相柱(C18 5μm 10×250mm)分离,以浓度为55%的乙腈-水溶液等度洗脱,得到式(Ⅰ)化合物为(2R*,3R*,4R*,5R*,6R*,7R*,8S*,9S*,13S*,14S*,15R*)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮和式(Ⅱ)化合物为(2R,3R,4R,5R,6S,7R,8S,9S,13S,14S,15R)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮;将组分F5进行正相硅胶柱分离,以体积比为100:0-0:100的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱,得到组分F5A-F5D,将组分F5B经Sephadex LH-20凝胶柱分离,用体积比为1:1的氯仿-甲醇洗脱,得到式(Ⅲ)化合物为(1S*,2S*,3R*,4S*,5R*,6S*,7R*,8S*,9S*,11S*,12S*,13S*,14S*,15R*)-5-苯甲酰氧基-6,15-二羟基-11,12-环氧-1,2,7,8,9,14-六乙酰氧基假白榄烷-3,6-辛内酯-22-酮。
实施例4
a、取对叶大戟的果实10kg,粉碎后用80L纯丙酮室温下渗漉提取,减压蒸干溶剂得到对叶大戟粗提物;
b、将步骤a得到的粗提物用石油醚分散,加入乙醇萃取3次,合并乙醇层并减压蒸干得到乙醇萃取物浸膏;
c、将步骤b得到的乙醇萃取物浸膏用正相硅胶柱分离,用体积比10:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱,流分经硅胶薄层层析(TLC)分析,合并相同流分,得到6个组分(F1-F6);将组分F4进行正相硅胶柱分离,以体积比为100:0-0:100的氯仿-丙酮进行梯度洗脱,得到组分F4A-F4D;将组分F4B经RP-18反相柱分离,以浓度为80%-100%的乙腈-水溶液梯度洗脱,收集80%乙腈-水溶液(F4B1)和90%乙腈-水溶液(F4B3),减压蒸干,F4B1段采用正相硅胶柱分离,采用体积比为20:1-0:1的正己烷-丙酮进行梯度洗脱,得到组分F4B1A-F4B1K,对F4B1K段采用制备反相柱(C18 5μm 10×250mm)分离,以浓度为70%的甲醇-水溶液等度洗脱,得到式(Ⅰ)化合物为(2R*,3R*,4R*,5R*,6R*,7R*,8S*,9S*,13S*,14S*,15R*)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮和式(Ⅱ)化合物为(2R,3R,4R,5R,6S,7R,8S,9S,13S,14S,15R)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮;将组分F5进行正相硅胶柱分离,以体积比为100:0-0:100的正己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱,得到组分F5A-F5D,将组分F5B经Sephadex LH-20凝胶柱分离,用体积比为1:1的二氯甲烷-甲醇洗脱,得到式(Ⅲ)化合物为(1S*,2S*,3R*,4S*,5R*,6S*,7R*,8S*,9S*,11S*,12S*,13S*,14S*,15R*)-5-苯甲酰氧基-6,15-二羟基-11,12-环氧-1,2,7,8,9,14-六乙酰氧基假白榄烷-3,6-辛内酯-22-酮。
实施例5
a、取对叶大戟的果实10kg,粉碎后用90L的浓度为50%的甲醇-水溶液温度80℃下回流提取,减压蒸干溶剂得到对叶大戟粗提物;
b、将步骤a得到的粗提物用正己烷分散,加入乙醇萃取4次,合并乙醇层并减压蒸干得到乙醇萃取物浸膏;
c、将步骤b得到的乙醇萃取物浸膏用正相硅胶柱分离,用体积比10:1-0:1的正己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱,流分经硅胶薄层层析(TLC)分析,合并相同流分,得到6个组分(F1-F6);将组分F4进行正相硅胶柱分离,以体积比为100:0-0:100的氯仿-甲醇进行梯度洗脱,得到组分F4A-F4D;将组分F4B经RP-18反相柱分离,以浓度为65%-100%的甲醇-水溶液梯度洗脱,收集65%的甲醇-水溶液(F4B1)和80%的甲醇-水溶液(F4B3),减压蒸干,F4B1段采用正相硅胶柱分离,采用体积比为20:1-0:1的正己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱,得到组分F4B1A-F4B1K,对F4B1K段采用制备反相柱(C18 5μm 10×250mm)分离,以浓度为55%的乙腈-水溶液等度洗脱,得到式(Ⅰ)化合物为(2R*,3R*,4R*,5R*,6R*,7R*,8S*,9S*,13S*,14S*,15R*)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮和式(Ⅱ)化合物为(2R,3R,4R,5R,6S,7R,8S,9S,13S,14S,15R)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮;将组分F5进行正相硅胶柱分离,以体积比为100:0-0:100的正己烷-丙酮进行梯度洗脱,得到组分F5A-F5D,将组分F5B经Sephadex LH-20凝胶柱分离,用无水甲醇洗脱,得到式(Ⅲ)化合物为(1S*,2S*,3R*,4S*,5R*,6S*,7R*,8S*,9S*,11S*,12S*,13S*,14S*,15R*)-5-苯甲酰氧基-6,15-二羟基-11,12-环氧-1,2,7,8,9,14-六乙酰氧基假白榄烷-3,6-辛内酯-22-酮。
实施例6
a、取对叶大戟的果实10kg,粉碎后用100L的无水甲醇室温下渗漉提取,减压蒸干溶剂得到对叶大戟粗提物;
b、将步骤a得到的粗提物用正己烷分散,加入乙醇萃取5次,合并乙醇层并减压蒸干得到乙醇萃取物浸膏;
c、将步骤b得到的乙醇萃取物浸膏用正相硅胶柱分离,用体积比10:1-0:1的环己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱,流分经硅胶薄层层析(TLC)分析,合并相同流分,得到6个组分(F1-F6);将组分F4进行正相硅胶柱分离,以体积比为100:0-0:100的二氯甲烷-丙酮进行梯度洗脱,得到组分F4A-F4D;将组分F4B经RP-18反相柱分离,以浓度为80%-100%的乙腈-水溶液梯度洗脱,收集80%乙腈-水溶液(F4B1)和90%乙腈-水溶液(F4B3),减压蒸干,F4B1段采用正相硅胶柱分离,采用体积比为20:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱,得到组分F4B1A-F4B1K,对F4B1K段采用制备反相柱(C18 5μm 10×250mm)分离,以浓度为85%的甲醇-水溶液等度洗脱,得到式(Ⅰ)化合物为(2R*,3R*,4R*,5R*,6R*,7R*,8S*,9S*,13S*,14S*,15R*)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮和式(Ⅱ)化合物为(2R,3R,4R,5R,6S,7R,8S,9S,13S,14S,15R)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮;将组分F5进行正相硅胶柱分离,以体积比为100:0-0:100的石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱,得到组分F5A-F5D,将组分F5B经Sephadex LH-20凝胶柱分离,用体积比为1:1的氯仿-甲醇洗脱,得到式(Ⅲ)化合物为(1S*,2S*,3R*,4S*,5R*,6S*,7R*,8S*,9S*,11S*,12S*,13S*,14S*,15R*)-5-苯甲酰氧基-6,15-二羟基-11,12-环氧-1,2,7,8,9,14-六乙酰氧基假白榄烷-3,6-辛内酯-22-酮。
实施例7
本发明所述的从对叶大戟果实中分离的假白榄烷型二萜内酯化合物在制备多药耐药逆转药物或与抗肿瘤药物组合制备抗肿瘤药物中的用途,以人乳腺癌细胞株及其阿霉素耐药株为例。
式(Ⅰ)—式(Ⅲ)化合物的细胞毒和耐药指数测试:
材料与试剂:RPMI 1640培养基购自HyClone公司;双抗和胎牛血清购自Hyclone公司;胰蛋白酶购自Gibco公司;噻唑蓝(MTT)购自Biosharp公司;二甲基亚砜(DMSO)购自Amresco公司;罗丹明123购于Sigma公司;盐酸维拉帕米购自Sigma公司;盐酸阿霉素购自上海生工有限公司;
细胞株:人乳腺癌细胞株MCF-7(购自中国科学院上海细胞库)及人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR(购自上海桥杜生物科技有限公司);
细胞培养:人乳腺癌细胞株MCF-7及其阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR在RPMI 1640完全培养基(RPMI 1640培养基+10%FBS+1%双抗)中培养。所有细胞均置于CO2培养箱(温度37℃,5%CO2)维持传代培养,耐药株(MCF-7/ADR细胞)在阿霉素终浓度为500ng/mL的完全培养基中耐药培养一周,再在1000ng/mL的完全培养基中耐药培养一周后,于无抗肿瘤药的完全培养基中培养两周后用于实验;
实验方法:MTT法,以5000个/孔的密度将处于对数生长期的MCF-7或MCF-7/ADR细胞接种于96孔微量培养板内,在温度37℃培养箱孵育24h后加入供试单体化合物,每孔100μL,设6个浓度梯度,设6个复孔;另设无细胞调零组,溶剂(DMSO)对照组及阳性药物对照组;肿瘤细胞在温度37℃、5%CO2条件下培养48h后弃去上清液,加入MTT液(5mg/mL,用生理盐水配制,以1:9的比例与完全培养基混匀,每孔100μL),在温度37℃、5%CO2条件下继续培养4h;弃去上清液,每孔加入150μL DMSO,待甲臜溶解后,用酶标仪检测各孔570nm的吸光度值(A);按下列公式计算供试单体化合物对肿瘤细胞生长的抑制率(IC10值和半数抑制量IC50值采用GraphPad Prism 5.0软件计算)和耐药指数:抑制率(%)=(A对照组-A给药组)/A对照组×100%;抗肿瘤药阿霉素耐药指数(RI)=IC50(MCF-7)/IC50(MCF-7/ADR);
实验结果:对叶大戟果实中分得假白榄烷型二萜内酯的式(Ⅰ)-式(Ⅲ)化合物的半数生长抑制率,见表2:
表2.假白榄烷型二萜内酯式(Ⅰ)-式(Ⅲ)化合物对人乳腺癌细胞株MCF-7和人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR的半数生长抑制率
由表2可知,式(Ⅰ)-式(Ⅲ)化合物对人乳腺癌细胞株MCF-7和人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR均未表现出细胞毒性(IC50>60μM),对人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR的抗肿瘤药阿霉素的耐药指数经计算得39.83;
式(Ⅰ)-式(Ⅲ)化合物逆转肿瘤多药耐药活性测试:
本实验选择对叶大戟果实中分得的假白榄烷型二萜内酯化合物(Ⅰ)-(Ⅲ)与抗肿瘤药阿霉素(DOX)联用,检测联用前后对耐药细胞的生长抑制,进行多药耐药逆转活性测试;
实验方法:将处于对数生长期的MCF-7/ADR细胞以5000个/孔的密度接种于96孔微量培养板(每孔100μL),在37℃培养箱中孵育24h后加入阿霉素和供试单体化合物或阳性对照药维拉帕米,每孔100μL,设7个浓度梯度,设6个复孔,并设空白对照组和溶剂(DMSO)对照组;肿瘤细胞在温度37℃、5%CO2条件下培养48h后弃去上清液,加入MTT液(5mg/mL,用生理盐水配制,以1:9的比例与完全培养基混匀,每孔100μL),在温度37℃、5%CO2条件下继续培养4h后弃去上清液,每孔加入150μL DMSO,待甲臜溶解后,用酶标仪检测各孔570nm的吸光度值(A),按下列公式计算供试单体化合物对肿瘤细胞生长的抑制率:抑制率(%)=(A对照组-A给药组)/A对照组×100%;抗肿瘤药阿霉素耐药指数(RI)=IC50(MCF-7)/IC50(MCF-7/ADR)。并按下列公式计算逆转倍数;
逆转倍数(RF)=IC50(阿霉素)/IC50(阿霉素+化合物)
实验结果:式(Ⅰ)-式(Ⅲ)化合物与阿霉素联用对MCF-7/ADR细胞的半数生长抑制率及其逆转倍数见表3-表4:
表3式(Ⅰ)、(Ⅲ)化合物与阿霉素联用对人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR的半数生长抑制率
如表3所示,式(Ⅰ)化合物与阿霉素联用后与阿霉素单独作用相比,IC50值降低,降低程度以逆转倍数表示,也即显示出一定程度的多药耐药逆转活性;式(Ⅲ)化合物与阿霉素联用后未表现出多药耐药逆转活性;
表4式(Ⅱ)化合物与阿霉素联用对人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR的半数生长抑制率
由表4可知,阿霉素与式(Ⅱ)化合物联用后与阿霉素单独作用相比,IC50值显著降低,降低程度以逆转倍数表示,10μM的式(Ⅱ)化合物的逆转倍数(12.96倍)与10μM阳性对照药维拉帕米相当(10.35倍),即式(Ⅱ)化合物具有较强的逆转肿瘤多药耐药的活性。
Claims (3)
1.一种假白榄烷型二萜内酯类化合物,其特征在于该化合物的结构式为:
其中:式(Ⅰ)化合物为(2R*,3R*,4R*,5R*,6R*,7R*,8S*,9S*,13S*,14S*,15R*)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮;
式(Ⅱ)化合物为(2R,3R,4R,5R,6S,7R,8S,9S,13S,14S,15R)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮;
式(Ⅲ)化合物为(1S*,2S*,3R*,4S*,5R*,6S*,7R*,8S*,9S*,11S*,12S*,13S*,14S*,15R*)-5-苯甲酰氧基-6,15-二羟基-11,12-环氧-1,2,7,8,9,14-六乙酰氧基假白榄烷-3,6-辛内酯-22-酮。
2.根据权利要求1所述的一种假白榄烷型二萜内酯类化合物的制备方法,其特征在于按下列步骤进行:
a、以对叶大戟的果实为原料,粉碎后用5-10倍量体积浓度为50-99%的乙醇水溶液、无水乙醇、纯丙酮、体积浓度为50-99%的甲醇水溶液、无水甲醇进行室温下的渗漉或冷浸提取,或加热回流提取,浓缩得到对叶大戟的粗提物;
b、将步骤a得到的粗提物用乙醇分散,加入石油醚、正己烷或环己烷萃取,或将粗提物用石油醚、正己烷或环己烷分散,再加入乙醇萃取3-5次,将乙醇萃取液浓缩,得到乙醇萃取物浸膏;
c、将步骤b得到的乙醇萃取物浸膏用正相硅胶柱分离,用体积比10:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯、正己烷-乙酸乙酯或环己烷-乙酸乙酯进行梯度洗脱,流分经硅胶薄层层析分析,合并相同流分,得到6个组分F1-F6;将组分F4进行正相硅胶柱分离,以体积比为100:0-0:100的氯仿-丙酮、氯仿-甲醇或二氯甲烷-丙酮进行梯度洗脱,得到组分F4A-F4D;将组分F4B经RP-18反相柱分离,以浓度为65%-100%的甲醇-水溶液或80-100%乙腈-水溶液梯度洗脱,收集65%甲醇-水溶液F4B1和80%甲醇-水溶液F4B3,减压蒸干,F4B1段采用正相硅胶柱分离,采用体积比为20:1-0:1的正己烷-丙酮、正己烷-乙酸乙酯或石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱,得到组分F4B1A-F4B1K,对F4B1K段采用制备反相柱C185μm 10×250mm分离,以浓度为55%的乙腈-水溶液、甲醇-水溶液等度洗脱,得到式(Ⅰ)化合物为(2R*,3R*,4R*,5R*,6R*,7R*,8S*,9S*,13S*,14S*,15R*)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮和式(Ⅱ)化合物为(2R,3R,4R,5R,6S,7R,8S,9S,13S,14S,15R)-6-苯甲酰氧基-3,15-二羟基-7-异丁酰氧基-11E-烯-2,8,9,14-四乙酰氧基假白榄烷-5,6-己内酯-22-酮;将组分F5进行正相硅胶柱分离,以体积比为100:0-0:100的正己烷-乙酸乙酯、正己烷-丙酮或石油醚-乙酸乙酯进行梯度洗脱,得到组分F5A-F5D,将组分F5B经Sephadex LH-20凝胶柱分离,用体积比为1:1的二氯甲烷-甲醇、无水甲醇或氯仿-甲醇洗脱,得到式(Ⅲ)化合物为(1S*,2S*,3R*,4S*,5R*,6S*,7R*,8S*,9S*,11S*,12S*,13S*,14S*,15R*)-5-苯甲酰氧基-6,15-二羟基-11,12-环氧-1,2,7,8,9,14-六乙酰氧基假白榄烷-3,6-辛内酯-22-酮。
3.根据权利要求1所述的假白榄烷型二萜内酯类化合物中的式Ⅰ和式Ⅱ化合物在制备多药耐药逆转活性的药物中的用途。
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对叶大戟大环二萜类化合物L2逆转肿瘤多药耐药的实验研究;方艳芬等;《2015医学前沿论坛暨第十四届全国肿瘤药理与化疗学术会议》;20150424 * |
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