CN101851273A - 蓝萼甲素衍生物、制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蓝萼甲素(GLA)衍生物、制备方法及其用途。所述蓝萼甲素(GLA)衍生物以蓝萼甲素(GLA)为主体，是二萜类物质，具有贝壳杉烷型结构、羰基、多肽cNGQGEQc和/或羟基。本发明采用香茶菜药材(地上部分)作为原料，进行粉碎、提取、溶液处理、过柱、重结晶等得到蓝萼甲素(GLA)，再和多肽cNGQGEQc进行进一步的乙酰化反应，得到所述蓝萼甲素(GLA)衍生物。所述蓝萼甲素(GLA)衍生物具有较高的抗癌活性，对于肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、黑色素瘤和骨髓性白血病多种肿瘤细胞均有显著的抑制，尤其对于肺癌具有靶向作用，可以针对性地治疗肺癌。
Description
技术领域
本发明涉及蓝萼甲素(GLA)衍生物，特别涉及含有多肽的蓝萼甲素(GLA)衍生物。
本发明还涉及所述含有多肽的蓝萼甲素(GLA)衍生物的制备方法及其在治疗癌症中的应用。
背景技术
香茶菜为唇形科香茶菜属植物，广泛分布于河南、湖北、四川、贵州、陕西、山西、河北等省。全草具有抗菌、消炎等作用，民间用于治疗急性黄疽型肝炎、急性胆囊炎、跌打损伤、毒蛇咬伤、脓疙疹等。其药理作用未见报道。对鄂西香茶菜粗制剂进行了药理作用的研究，结果表明其对体内和体外的艾氏腹水癌肿瘤细胞有明显的抑制作用。
唇形科香茶菜属植物。在亚洲东部和非洲西部广为分布，全世界约有150种，我国约有90种25个变种。其中约有30种民间作为药用，作为清热解毒、抗癌消炎、健脾、活血、杭菌药来使用。人们对该属植物的-菇类成分作了研究，已从中提取了百余种药类成分。经药理筛选发现许多二萜化合物具有细胞毒、抗肿瘤、杭炎活性作用。在研究中还发现该属植物除含二萜成分外，还富含三萜，脂肪酸以及少量的黄酮、倍半萜、链烃等。
蓝萼香茶菜是唇形科香茶菜属植物，分布在我国的东北、华北，朝鲜.日本，原苏联远东地区，吉林省资源尤其丰富。蓝萼香茶菜具有健胃、清热解毒、活血、抗菌消炎和抗癌活性，用于胃炎、肝炎初起、感冒发热、乳腺炎、关节痛等疾病。现代研究发现全草对心血管有一定的作用，而其中的有效成分对血小板聚集及癌症有一定的影响。从上世纪80年代至今各国学者对其药理及化学等各方面进行了研究，以我国学者研究的较多。
1981年许云龙等人从蓝萼香茶菜中提取出蓝萼甲素(glaucocalyxinA)和蓝萼乙素(glaucocalyxinB)，从光谱中推断蓝萼甲素具有香茶菜属二萜典型的巧一氧-16一贝壳杉烯(ent-15-oxo-I6-kaurene)骨架，而蓝萼乙素是蓝萼甲素的14一乙酰化物，把两者分别乙酰化，得到相同的乙酰化物，从而证实了两者的相互关系。随后赵全成也从吉林产蓝萼香茶菜中分得这两种二萜。
1988年刘晨江等从北京地区产蓝萼香茶菜中分得甲素和乙素外，还分得蓝萼丙素(glaucocalyxinC)，结构为对映-7p，14a，15a-三羟基-16-贝壳杉-3-酮。Dongsa kimls，除了从中分出蓝萼甲素、蓝萼乙素和蓝萼丙素，还分出了两种新二萜glaucocalyxinD和glaucocalyxinE并列出了这五种化合物的结构红外紫外吸收值、最主要的1H一核磁共振、13C一核磁共振化学位移值及质谱数据值。
金永日等从蓝萼香茶菜根中分得了蓝萼甲素，另外王先荣等从安徽产王枣子〔Isodonamethystoides(Benth)CyWuetHsuan〕中也分得蓝萼甲素。王慧芬等人用反相高效液相色谱法外标法对不同部位及不同采集期的蓝萼香茶菜中蓝萼甲素的含量进行了测定，结果表明叶中蓝萼甲素远高于根、茎。不同采集期以7-8月份含量高，9月末含量下降。张元桐等也采用反相HPLC测定蓝萼甲素含量，测得蓝萼甲素含量为1.03％，平均回收率为99.2％。赵全成从蓝萼香茶菜中分得p一谷甾醇和熊果酸。蓝萼香茶菜用乙醇提取后经硅胶柱层析和HPLC制备柱层析分离得到4个化合物齐墩果酸，阿江榄仁酸，毛花猕猴酸B和熊果酸。代桂明玉等人从蓝萼香茶菜中还分得芦丁和和胡萝卜甙。
杨学俭等用日本岛津AA-670型原子吸收分光光度计，以中科院环化所提供的桃叶为标准参照物，对蓝萼香茶菜的根、茎、叶分别进行测定发现蓝尊香茶菜的茎、叶中Fe，Cu，Mn，Se的含量都是较高的，现代医学研究已经证明，这些元素的存在对防治癌症及其它一些疾病是有作用的，提示蓝萼香茶菜在此方面有一定作用。后有人用ICP-AES仪测定了河北蓝萼香茶菜不同部位多种元素的含量，发现其叶中5种宏量元素K，Na，P，Ca，Mg的含量高于根和茎，8种微量元素Zn，Fe，S，Ba，Li，Al，V，Ti的含量也是叶中偏高，首次发现香茶菜叶中含有稀土元素Ce，Y，Yb，数据提示多年生草本植物蓝萼香茶菜的最佳药用部分可能是叶。
刘兰娣等研究了蓝萼香茶菜对大鼠全心缺血一再灌注时心肌C-FOS基因表达的影响。采用dortl离体全心缺血一再灌注损伤模型，免疫组化法，用相应C-fos抗体检测心肌细胞中C-fos基因表达情况，用计算机图像分析系统分析C-fos基因表达情况，蓝萼香茶菜生药用乙醇回流3次提取，提取液回收乙醇，浓缩后加到0.5％淀粉糊中，挥去乙醇，浓度为1Kg/L，分为高中低三种不同浓度的香茶菜对缺血一再灌注全心进行预灌注，结果发现其能明显减少凋亡相关基因C-fos基因的表达，表明心肌缺血一再灌注损伤轻，心肌受到一定的保护，同时发现高浓度蓝萼香茶菜具有一定的心肌细胞毒性作用。其具有与剂量相关的心肌保护作用，但并非浓度越大越有效。
综上所述，蓝萼香茶菜在我国资源丰富。化学研究表明其含有二萜和三萜成分，但其中以二萜成分蓝萼甲素为其主要的活性成分，具有抗血小板聚集的作用。因其母核为对映贝壳杉烯型的，相似于冬凌草甲素(oridonin)，故可能具有一定的抗癌作用。
发明内容
本发明的目的之一在于提供能治疗癌症、特别是治疗肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、黑色素瘤和骨髓性白血病的蓝萼甲素(GLA)衍生物，该蓝萼甲素(GLA)衍生物特别对肺癌具有靶向作用，从而提供一种即可以治疗多种癌症就可以针对性的治疗肺癌的药物。
本发明的目的之二在于提供一种制备蓝萼甲素(GLA)衍生物的制备方法，从而避免单纯的采用有机合成所带来的毒副作用较大的缺陷，并且避免单纯的采用原料提纯多带来的药效较低、无法针对性治疗某一特定癌症的缺陷。
本发明所公开的蓝萼甲素(GLA)衍生物是一种二萜类物质，具有贝壳杉烷型结构、羰基、多肽cNGQGEQc和/或羟基，其分子结构的通式如下：
其中，R1为-cNGQGEQc或-OH，R2为-cNGQGEQc或-OH。
其中，以下三种结构对治疗癌症、特别是治疗肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、黑色素瘤和骨髓性白血病具有良好的效果。其中通过乙酰化反应引入多肽cNGQGEQc，来对主体二萜进行结构修饰，从而使得修饰后的蓝萼甲素(GLA)，即蓝萼甲素(GLA)衍生物对肺癌具有靶向作用。
所述蓝萼甲素(GLA)(C20H28O4)的分子结构如下：
本发明采用香茶菜药材(地上部分)作为原料，进行粉碎、提取、溶液处理、过柱、重结晶等得到蓝萼甲素(GLA)，再和多肽cNGQGEQc进行进一步的乙酰化反应，得到所述蓝萼甲素(GLA)衍生物。所述的蓝萼甲素(GLA)衍生物的制备方法，具体包含以下步骤：
步骤1：粉碎
取香茶菜药材(地上部分)粉碎至20目～50目。
步骤2：提取
步骤2.1：将步骤1所得的粉碎物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶6至1∶10混合，加热，在80℃～90℃温度条件下回流1～2小时，提取、过滤，得到提取液和剩余物。
步骤2.2：将步骤2.1所得的剩余物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶6至1∶10混合，加热，在80℃～90℃温度条件下回流1～2小时，提取、过滤，得到提取液和剩余物，重复该步骤1～3次。
步骤2.3：合并步骤2.1和2.2所得的提取液。
步骤3：溶剂处理
步骤3.1：将步骤2所得的提取液加热，在55℃～65℃温度条件下减压浓缩，回收乙醇并得到粘稠的初级浓缩物。
步骤3.2：将步骤3.1所得的初级浓缩物与水按照体积比1∶8～1∶10混合，在室温条件下以60～120转/分的速度搅拌10分钟，随后静置6～12小时，弃去上清液得到下层固体。
步骤3.3：将步骤3.2所得的固体与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶4～1∶6混合，在25℃～35℃温度条件下以60～120转/分的速度搅拌溶解，静置1～3小时，过滤得到滤液和不溶物。
步骤3.4：将步骤3.3所得的不溶物与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶4～1∶6混合，在25℃～35℃温度条件下以60～120转/分的速度搅拌溶解，静置1～3小时，过滤得到滤液和不溶物，重复该步骤1～3次。
步骤3.5：合并步骤3.3和3.4所得的滤液。
步骤3.6：将步骤3.5所得的滤液加热，在35℃～45℃温度条件下减压浓缩，回收乙酸乙酯(A.R.)，得到固体浓缩物。
步骤4：过柱
步骤4.1：将步骤3所得的固体浓缩物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶4～1∶6混合溶解，得到溶液。
步骤4.2：将步骤4.1所得的溶液缓慢加到树脂柱中，观察树脂的颜色，在树脂柱有2/3变色时，停止加样，并采用200ml～400ml的95％乙醇(A.R.)冲洗该树脂柱，收集所有流出液，所述树脂柱的填充物为强碱性阴离子树脂并用氢氧化钠饱和至pH值中性。
步骤4.3：将步骤4.2所得流出液加热，并在55℃～65℃温度条件下减压回流，直至溶剂干，得到固体残留物。
步骤5：重结晶
步骤5.1：将上述残留物与30℃的～40℃的极性溶剂按照体积比1∶4～1∶6混合，得到初级溶液，加热，在30℃的～40℃温度条件下减压浓缩，在-5℃～-8℃温度条件下静置析晶，过滤得到黄色针状结晶。
所述极性溶剂为按照体积比1∶1～1∶2混合的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液。
步骤5.2：将步骤5.1所得的结晶与极性溶剂按照体积比1∶4～1∶6混合，在-5℃～-8℃温度条件下反复重结晶2～4次，得到浓缩物。
所述极性溶剂为按照体积比1∶1～1∶4混合的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液。
步骤6：分离提纯
步骤6.1：将步骤5所得的浓缩物加入20ml乙酸乙酯(A.R.)溶解，加入200-300目硅胶，混合均匀，室温挥发干燥，除去溶剂乙酸乙酯(A.R.)。
所述硅胶的加入量为所述浓缩物重量的3倍。
步骤6.2：湿法填装一根层析硅胶柱，所述硅胶用量为步骤5所得的浓缩物重量的20倍，柱子径高比为1∶12，并采用2BV氯仿(A.R.)反复冲洗硅胶柱。
步骤6.3：将步骤6.1所得的混有硅胶的浓缩物加入到步骤6.2所得的硅胶柱中，采用2BV氯仿(A.R.)冲洗且流速为1.5BV/小时。
步骤6.4：采用3BV氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液冲洗所述硅胶柱，并采用TLC薄层分析方法检验目标馏分蓝萼甲素(GLA)，在检验到相应馏分的时候，采用6BV氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液冲洗，收集含有蓝萼甲素(GLA)主成分的馏分。
所述的3BV的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液中，氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的体积比为20∶1。
所述的6BV的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液中，氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的体积比为10∶1。
步骤6.5：将步骤6.4所得的馏分合并，在30℃～40℃温度条件下减压浓缩，回收溶剂，将所得的浓缩物用氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液重结晶，得到白色针状晶体蓝萼甲素(GLA)。
所述氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液的用量与所述馏分的体积比为8∶1～12∶1。
所述的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液中，氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的体积比为1∶1～1∶4。
步骤7：合成
步骤7.1：将步骤6所得的蓝萼甲素(GLA)和多肽(cNGQGEQc)按照每8～17g蓝萼甲素(GLA)、0.7～2.3g多肽(cNGQGEQc)和80～150ml无水极性溶剂的比例混合得到混合液，所述无水极性溶剂为甲醇(A.R.)、乙醇(A.R.)、二氯甲烷(A.R.)中的一种。
步骤7.2：将步骤7.1所得的混合溶液加热，在60℃～80℃温度条件下搅拌冷凝回流6～10小时，趁热抽滤，室温下静置，析出晶体，过滤，分离出晶体，得到蓝萼甲素(GLA)衍生物。
经高效液相色谱、LC-MS、NMR分析确认所得晶体为含有多肽cNGQGEQc的蓝萼甲素(GLA)衍生物。
本发明同时公开了所述含有多肽cNGQGEQc的蓝萼甲素(GLA)衍生物在治疗癌症中的应用，特别是在治疗肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、黑色素瘤和骨髓性白血病中的应用。由于该蓝萼甲素(GLA)衍生物是以蓝萼甲素(GLA)为基础并采用多肽cNGQGEQc通过乙酰化反应对蓝萼甲素(GLA)进行结构修饰所得到，其对于肺癌具有良好的靶向作用。
本发明所公开的前述任一结构的蓝萼甲素(GLA)衍生物可以采用药剂学上的常规药物载体制成任何一种剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、软胶剂、喷雾剂、凝胶剂、凝胶吸入剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、脂质体注射剂、靶向给药注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。优选为冻干注射剂。
附图说明
图1是本发明的蓝萼甲素(GLA)的分子结构式。
图2是本发明的蓝萼甲素(GLA)衍生物的分子结构通式。
图3a～3c是本发明的三种蓝萼甲素(GLA)衍生物的分子结构式。
具体实施方式
根据本发明的权利要求和发明内容所公开的内容，本发明的技术方案具体如下所述。
实施例一蓝萼甲素(GLA)衍生物的制备：
以下所制备过程中所采用的各化学试剂如无特别标注，则为分析纯。
采用香茶菜药材(地上部分)作为原料，提纯蓝萼甲素(GLA)，并采用多肽cNGQGEQc修饰其结构，制备蓝萼甲素(GLA)衍生物的制备方法，具体包含以下步骤：
步骤1：粉碎
取香茶菜药材(地上部分)粉碎至20目～50目。
步骤2：提取
步骤2.1：将步骤1所得的粉碎物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶6至1∶10混合，加热，在80℃～90℃温度条件下回流1～2小时，提取、过滤，得到提取液和剩余物。
步骤2.2：将步骤2.1所得的剩余物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶6至1∶10混合，加热，在80℃～90℃温度条件下回流1～2小时，提取、过滤，得到提取液和剩余物，重复该步骤1～3次。
步骤2.3：合并步骤2.1和2.2所得的提取液。
步骤3：溶剂处理
步骤3.1：将步骤2所得的提取液加热，在55℃～65℃温度条件下减压浓缩，回收乙醇并得到粘稠的初级浓缩物。
步骤3.2：将步骤3.1所得的初级浓缩物与水按照体积比1∶8～1∶10混合，在室温条件下以60～120转/分的速度搅拌10分钟，随后静置6～12小时，弃去上清液得到下层固体。
步骤3.3：将步骤3.2所得的固体与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶4～1∶6混合，在25℃～35℃温度条件下以60～120转/分的速度搅拌溶解，静置1～3小时，过滤得到滤液和不溶物。
步骤3.4：将步骤3.3所得的不溶物与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶4～1∶6混合，在25℃～35℃温度条件下以60～120转/分的速度搅拌溶解，静置1～3小时，过滤得到滤液和不溶物，重复该步骤1～3次。
步骤3.5：合并步骤3.3和3.4所得的滤液。
步骤3.6：将步骤3.5所得的滤液加热，在35℃～45℃温度条件下减压浓缩，回收乙酸乙酯(A.R.)，得到固体浓缩物。
步骤4：过柱
步骤4.1：将步骤3所得的固体浓缩物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶4～1∶6混合溶解，得到溶液。
步骤4.2：将步骤4.1所得的溶液缓慢加到树脂柱中，观察树脂的颜色，在树脂柱有2/3变色时，停止加样，并采用200ml～400ml的95％乙醇(A.R.)冲洗该树脂柱，收集所有流出液，所述树脂柱的填充物为强碱性阴离子树脂并用氢氧化钠饱和至pH值中性。
所述树脂柱采用7号树脂柱，柱径比1∶12。
步骤4.3：将步骤4.2所得流出液加热，并在55℃～65℃温度条件下减压回流，直至溶剂干，得到固体残留物。
步骤5：重结晶
步骤5.1：将上述残留物与30℃的～40℃的极性溶剂按照体积比1∶4～1∶6混合，得到初级溶液，加热，在30℃的～40℃温度条件下减压浓缩，在-5℃～-8℃温度条件下静置析晶，过滤得到黄色针状结晶。
所述极性溶剂为按照体积比1∶1～1∶2混合的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液。
步骤5.2：将步骤5.1所得的结晶与极性溶剂按照体积比1∶4～1∶6混合，在-5℃～-8℃温度条件下反复重结晶2～4次，得到蓝萼甲素(GLA)。
所述极性溶剂为按照体积比1∶1～1∶4混合的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液。
步骤6：分离提纯
步骤6.1：将步骤5所得的浓缩物加入20ml乙酸乙酯(A.R.)溶解，加入200-300目硅胶，混合均匀，室温挥发干燥，除去溶剂乙酸乙酯(A.R.)。
所述硅胶的加入量为所述浓缩物重量的3倍。
步骤6.2：湿法填装一根层析硅胶柱，所述硅胶用量为步骤5所得的浓缩物重量的20倍，柱子径高比为1∶12，并采用2BV氯仿(A.R.)反复冲洗硅胶柱。
步骤6.3：将步骤6.1所得的混有硅胶的浓缩物加入到步骤6.2所得的硅胶柱中，采用2BV氯仿(A.R.)冲洗且流速为1.5BV/小时。
步骤6.4：采用3BV氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液冲洗所述硅胶柱，并采用TLC薄层分析方法检验目标馏分蓝萼甲素(GLA)，在检验到相应馏分的时候，采用6BV氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液冲洗，收集含有蓝萼甲素(GLA)主成分的馏分。
所述的3BV的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液中，氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的体积比为20∶1。
所述的6BV的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液中，氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的体积比为10∶1。
步骤6.5：将步骤6.4所得的馏分合并，在30℃～40℃温度条件下减压浓缩，回收溶剂，将所得的浓缩物用氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液重结晶，得到白色针状晶体蓝萼甲素(GLA)。
所述氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液的用量与所述馏分的体积比为8∶1～12∶1。
所述的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液中，氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的体积比为1∶1～1∶4。
步骤7：合成
步骤7.1：将步骤6所得的蓝萼甲素(GLA)和多肽(cNGQGEQc)按照每8～17g蓝萼甲素(GLA)、0.7～2.3g多肽(cNGQGEQc)和80～150ml无水极性溶剂的比例混合得到混合液，所述无水极性溶剂为甲醇(A.R.)、乙醇(A.R.)、二氯甲烷(A.R.)中的一种。
步骤7.2：将步骤7.1所得的混合溶液加热，在60℃～80℃温度条件下搅拌冷凝回流6～10小时，趁热抽滤，室温下静置，析出晶体，过滤，分离出晶体，得到蓝萼甲素(GLA)衍生物。
经高效液相色谱、LC-MS、NMR分析确认所得晶体为含有多肽cNGQGEQc的蓝萼甲素(GLA)衍生物。
实施例二蓝萼甲素(GLA)衍生物的制备：
采用以下技术参数改进实施例一的制备方法：
所述步骤2.1中，是将所述粉碎物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶6.5混合，加热，在82℃温度条件下回流1.8小时，再提取过滤。
所述步骤2.2中，是将所述剩余物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶9.5混合，加热，在88℃温度条件下回流1.2小时，再提取过滤，重复该步骤1次。
所述步骤3.1中，是将所述提取液加热，在57℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤3.2中，是将所述初级浓缩物与水按照体积比1∶8.5混合，在室温条件下搅拌并随后静置11小时才分离上清液和固体。
所述步骤3.3中，是将所述固体与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶5.5混合，在27℃温度条件下搅拌溶解，静置1.5小时再过滤。
所述步骤3.4中，是将所述不溶物与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶4.5混合，在33℃温度条件下搅拌溶解，静置2.5小时再过滤，重复该步骤3次。
所述步骤3.6中，是将所述滤液加热，在37℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤4.1中，是将所述固体浓缩物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶4.5混合溶解。
所述步骤4.2中，采用的树脂柱为填充物为强碱性阴离子树脂、并用氢氧化钠饱和至pH值中性的树脂柱。
所述步骤4.2中，当所述树脂柱有2/3变色时，停止加样，并采用240ml的95％乙醇(A.R.)冲洗所述树脂柱。
所述步骤4.3中，是将所述流出液加热，并在57℃温度条件下减压回流。
所述步骤5.1和5.2中，所述极性溶剂混合为按照体积比1∶1.2混合的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液。
所述步骤5.1中，是将所述残留物与31℃的极性溶剂按照体积比1∶5.5混合。
所述步骤5.1中，是将所述初级溶液加热，在31℃温度条件下减压浓缩，在-7℃温度条件下静置析晶。
所述步骤5.2中，是将所述结晶与极性溶剂按照体积比1∶4.5混合，在-6℃温度条件下反复重结晶4次。
所述步骤6.5中，是在32℃温度条件下减压浓缩，减压浓缩过程中所述氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液的用量与所述馏分的体积比为11.5∶1。
所述步骤6.5中，所述的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液中，氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的体积比为1∶2。
所述步骤7.1中，是按照每10g蓝萼甲素(GLA)、0.9g多肽(cNGQGEQc)和90ml无水极性溶剂的比例混合。
所述步骤7.1中，所述无水极性溶剂为甲醇(A.R.)。
所述步骤7.2中，是将所述混合溶液加热，在64℃温度条件下搅拌冷凝回流9.5小时，趁热抽滤，室温下静置析晶。
经高效液相色谱、LC-MS、NMR分析确认所得晶体为含有多肽cNGQGEQc的蓝萼甲素(GLA)衍生物。
实施例三蓝萼甲素(GLA)衍生物的制备：
采用以下技术参数改进实施例一的制备方法：
所述步骤2.1中，是将所述粉碎物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶7.5混合，加热，在84℃温度条件下回流1.6小时，再提取过滤。
所述步骤2.2中，是将所述剩余物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶8.5混合，加热，在86℃温度条件下回流1.4小时，再提取过滤，重复该步骤1次。
所述步骤3.1中，是将所述提取液加热，在59℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤3.2中，是将所述初级浓缩物与水按照体积比1∶8.5混合，在室温条件下搅拌并随后静置10小时才分离上清液和固体。
所述步骤3.3中，是将所述固体与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶5.5混合，在29℃温度条件下搅拌溶解，静置1.5小时再过滤。
所述步骤3.4中，是将所述不溶物与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶4.5混合，在31℃温度条件下搅拌溶解，静置2.5小时再过滤，重复该步骤3次。
所述步骤3.6中，是将所述滤液加热，在39℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤4.1中，是将所述固体浓缩物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶4.5混合溶解。
所述步骤4.2中，采用的树脂柱为填充物为强碱性阴离子树脂、并用氢氧化钠饱和至pH值中性的树脂柱。
所述步骤4.2中，当所述树脂柱有2/3变色时，停止加样，并采用280ml的95％乙醇(A.R.)冲洗所述树脂柱。
所述步骤4.3中，是将所述流出液加热，并在59℃温度条件下减压回流。
所述步骤5.1和5.2中，所述极性溶剂混合为按照体积比1∶1.4混合的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液。
所述步骤5.1中，是将所述残留物与33℃的极性溶剂按照体积比1∶5.5混合。
所述步骤5.1中，是将所述初级溶液加热，在33℃温度条件下减压浓缩，在-7℃温度条件下静置析晶。
所述步骤5.2中，是将所述结晶与极性溶剂按照体积比1∶4.5混合，在-7℃温度条件下反复重结晶4次。
所述步骤6.5中，是在34℃温度条件下减压浓缩，减压浓缩过程中所述氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液的用量与所述馏分的体积比为10.5∶1。
所述步骤6.5中，所述的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液中，氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的体积比为1∶2。
所述步骤7.1中，是按照每12g蓝萼甲素(GLA)、1.3g多肽(cNGQGEQc)和105ml无水极性溶剂的比例混合。
所述步骤7.1中，所述无水极性溶剂为乙醇(A.R.)。
所述步骤7.2中，是将所述混合溶液加热，在68℃温度条件下搅拌冷凝回流8.5小时，趁热抽滤，室温下静置析晶。
经高效液相色谱、LC-MS、NMR分析确认所得晶体为含有多肽cNGQGEQc的蓝萼甲素(GLA)衍生物。
实施例四蓝萼甲素(GLA)衍生物的制备：
采用以下技术参数改进实施例一的制备方法：
所述步骤2.1中，是将所述粉碎物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶8.5混合，加热，在86℃温度条件下回流1.4小时，再提取过滤。
所述步骤2.2中，是将所述剩余物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶7.5混合，加热，在84℃温度条件下回流1.6小时，再提取过滤，重复该步骤3次。
所述步骤3.1中，是将所述提取液加热，在61℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤3.2中，是将所述初级浓缩物与水按照体积比1∶9.5混合，在室温条件下搅拌并随后静置8小时才分离上清液和固体。
所述步骤3.3中，是将所述固体与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶4.5混合，在31℃温度条件下搅拌溶解，静置2.5小时再过滤。
所述步骤3.4中，是将所述不溶物与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶5.5混合，在29℃温度条件下搅拌溶解，静置1.5小时再过滤，重复该步骤1次。
所述步骤3.6中，是将所述滤液加热，在41℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤4.1中，是将所述固体浓缩物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶5.5混合溶解。
所述步骤4.2中，采用的树脂柱为填充物为强碱性阴离子树脂、并用氢氧化钠饱和至pH值中性的树脂柱。
所述步骤4.2中，当所述树脂柱有2/3变色时，停止加样，并采用320ml的95％乙醇(A.R.)冲洗所述树脂柱。
所述步骤4.3中，是将所述流出液加热，并在61℃温度条件下减压回流。
所述步骤5.1和5.2中，所述极性溶剂混合为按照体积比1∶1.6混合的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液。
所述步骤5.1中，是将所述残留物与37℃的极性溶剂按照体积比1∶4.5混合。
所述步骤5.1中，是将所述初级溶液加热，在37℃温度条件下减压浓缩，在-6℃温度条件下静置析晶。
所述步骤5.2中，是将所述结晶与极性溶剂按照体积比1∶5.5混合，在-6℃温度条件下反复重结晶2次。
所述步骤6.5中，是在36℃温度条件下减压浓缩，减压浓缩过程中所述氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液的用量与所述馏分的体积比为9.5∶1。
所述步骤6.5中，所述的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液中，氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的体积比为1∶3。
所述步骤7.1中，是按照每14g蓝萼甲素(GLA)、1.7g多肽(cNGQGEQc)和125ml无水极性溶剂的比例混合。
所述步骤7.1中，所述无水极性溶剂为乙醇(A.R.)。
所述步骤7.2中，是将所述混合溶液加热，在72℃温度条件下搅拌冷凝回流7.5小时，趁热抽滤，室温下静置析晶。
经高效液相色谱、LC-MS、NMR分析确认所得晶体为含有多肽cNGQGEQc的蓝萼甲素(GLA)衍生物。
实施例五蓝萼甲素(GLA)衍生物的制备：
采用以下技术参数改进实施例一的制备方法：
所述步骤2.1中，是将所述粉碎物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶9.5混合，加热，在88℃温度条件下回流1.2小时，再提取过滤。
所述步骤2.2中，是将所述剩余物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶6.5混合，加热，在82℃温度条件下回流1.8小时，再提取过滤，重复该步骤3次。
所述步骤3.1中，是将所述提取液加热，在63℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤3.2中，是将所述初级浓缩物与水按照体积比1∶9.5混合，在室温条件下搅拌并随后静置7小时才分离上清液和固体。
所述步骤3.3中，是将所述固体与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶4.5混合，在33℃温度条件下搅拌溶解，静置2.5小时再过滤。
所述步骤3.4中，是将所述不溶物与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶5.5混合，在27℃温度条件下搅拌溶解，静置1.5小时再过滤，重复该步骤1次。
所述步骤3.6中，是将所述滤液加热，在43℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤4.1中，是将所述固体浓缩物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶5.5混合溶解。
所述步骤4.2中，采用的树脂柱为填充物为强碱性阴离子树脂、并用氢氧化钠饱和至pH值中性的树脂柱。
所述步骤4.2中，当所述树脂柱有2/3变色时，停止加样，并采用360ml的95％乙醇(A.R.)冲洗所述树脂柱。
所述步骤4.3中，是将所述流出液加热，并在63℃温度条件下减压回流。
所述步骤5.1和5.2中，所述极性溶剂混合为按照体积比1∶1.8混合的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液。
所述步骤5.1中，是将所述残留物与39℃的极性溶剂按照体积比1∶4.5混合。
所述步骤5.1中，是将所述初级溶液加热，在39℃温度条件下减压浓缩，在-6℃温度条件下静置析晶。
所述步骤5.2中，是将所述结晶与极性溶剂按照体积比1∶5.5混合，在-7℃温度条件下反复重结晶2次。
所述步骤6.5中，是在38℃温度条件下减压浓缩，减压浓缩过程中所述氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液的用量与所述馏分的体积比为8.5∶1。
所述步骤6.5中，所述的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液中，氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的体积比为1∶3。
所述步骤7.1中，是按照每16g蓝萼甲素(GLA)、2.1g多肽(cNGQGEQc)和140ml无水极性溶剂的比例混合。
所述步骤7.1中，所述无水极性溶剂为甲醇(A.R.)。
所述步骤7.2中，是将所述混合溶液加热，在76℃温度条件下搅拌冷凝回流6.5小时，趁热抽滤，室温下静置析晶。
经高效液相色谱、LC-MS、NMR分析确认所得晶体为含有多肽cNGQGEQc的蓝萼甲素(GLA)衍生物。
实施例六蓝萼甲素(GLA)衍生物的制备(优选实施例)：
采用以下技术参数改进实施例一的制备方法：
所述步骤2.1中，是将所述粉碎物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶8混合，加热，在85℃温度条件下回流1.5小时，再提取过滤。
所述步骤2.2中，是将所述剩余物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶8混合，加热，在85℃温度条件下回流1.5小时，再提取过滤，重复该步骤2次。
所述步骤3.1中，是将所述提取液加热，在60℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤3.2中，是将所述初级浓缩物与水按照体积比1∶9混合，在室温条件下搅拌并随后静置9小时才分离上清液和固体。
所述步骤3.3中，是将所述固体与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶5混合，在30℃温度条件下搅拌溶解，静置2小时再过滤。
所述步骤3.4中，是将所述不溶物与乙酸乙酯(A.R.)按照体积比1∶5混合，在30℃温度条件下搅拌溶解，静置2小时再过滤，重复该步骤2次。
所述步骤3.6中，是将所述滤液加热，在40℃温度条件下减压浓缩。
所述步骤4.1中，是将所述固体浓缩物与95％乙醇(A.R.)按照体积比1∶5混合溶解。
所述步骤4.2中，采用的树脂柱为填充物为强碱性阴离子树脂、并用氢氧化钠饱和至pH值中性的树脂柱。
所述步骤4.2中，当所述树脂柱有2/3变色时，停止加样，并采用300ml的95％乙醇(A.R.)冲洗所述树脂柱。
所述步骤4.3中，是将所述流出液加热，并在60℃温度条件下减压回流。
所述步骤5.1和5.2中，所述极性溶剂混合为按照体积比1∶1.5混合的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液。
所述步骤5.1中，是将所述残留物与35℃的极性溶剂按照体积比1∶5混合。
所述步骤5.1中，是将所述初级溶液加热，在35℃温度条件下减压浓缩，在-6.5℃温度条件下静置析晶。
所述步骤5.2中，是将所述结晶与极性溶剂按照体积比1∶5混合，在-6.5℃温度条件下反复重结晶3次。
所述步骤6.5中，是在35℃温度条件下减压浓缩，减压浓缩过程中所述氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液的用量与所述馏分的体积比为10∶1。
所述步骤6.5中，所述的氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的混合溶液中，氯仿(A.R.)和丙酮(A.R.)的体积比为1∶2.5。
所述步骤7.1中，是按照每13g蓝萼甲素(GLA)、1.5g多肽(cNGQGEQc)和115ml无水极性溶剂的比例混合。
所述步骤7.1中，所述无水极性溶剂为二氯甲烷(A.R.)。
所述步骤7.2中，是将所述混合溶液加热，在70℃温度条件下搅拌冷凝回流8小时，趁热抽滤，室温下静置析晶。
经高效液相色谱、LC-MS、NMR分析确认所得晶体为含有多肽cNGQGEQc的蓝萼甲素(GLA)衍生物。
实施例七：
采用优选实施例六的制备方法制备的蓝萼甲素(GLA)衍生物，其分子结构通式如下：
其中，R1为-cNGQGEQc或-OH，R2为-cNGQGEQc或-OH。
其中，所述的-cNGQGEQc是通过原蓝萼甲素(GLA)上的羟基与多肽cNGQGEQc的乙酰化反应从而引入的。
其中，以下三种结构对治疗癌症、特别是治疗肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、黑色素瘤和骨髓性白血病具有良好的效果。其中通过乙酰化反应引入多肽cNGQGEQc，来对主体二萜进行结构修饰，从而使得修饰后的蓝萼甲素(GLA)，即蓝萼甲素(GLA)衍生物对肺癌具有靶向作用。
实施例八蓝萼甲素(GLA)衍生物制剂的制备：
采用药剂学上的常规药物载体，并采用药剂学上的常规制备方法，将采用优选实施例六的制备方法制备的、具有实施例七的分子结构的蓝萼甲素(GLA)衍生物中的一种或多种，制备成药剂学上的常规剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、软胶剂、喷雾剂、凝胶剂、凝胶吸入剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、脂质体注射剂、靶向给药注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。
其中优选制备剂型为冻干注射剂。
实施例九蓝萼甲素(GLA)衍生物的应用：
根据实施例一至六中任意制备方法制备所得的蓝萼甲素(GLA)衍生物，用于癌症的治疗，特别是用于治疗肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、黑色素瘤和骨髓性白血病。其中由于所得的蓝萼甲素(GLA)衍生物，是通过乙酰化反应引入多肽cNGQGEQc，来对主体二萜进行结构修饰的，从而使得修饰后的蓝萼甲素(GLA)，即蓝萼甲素(GLA)衍生物对肺癌具有靶向作用，尤其适用是肺癌的治疗。
实施例十蓝萼甲素(GLA)衍生物治疗肺癌的药效学实验：
采用根据优选实施例六的制备方法制备的、具有实施例七的分子结构的蓝萼甲素(GLA)衍生物的混合物(以下简称GH-02)进行药效学实验，考察GH-02对肺癌A549细胞的影响。
1.实验材料
1.1药品与试剂：四氮唑兰(MTT)
1.2仪器：二氧化碳孵化箱，显微镜，酶标仪
1.3动物：无
1.4瘤株：肺癌A549细胞由复旦大学肿瘤医院肿瘤研究所罗建民老师惠赠
2.实验方法
2.1A549细胞培养
A549细胞用含20％胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5％CO2孵化箱中进行培养。
2.2细胞传代
取出已长满细胞的25cm2培养瓶，倒去培养液，先注入胰蛋白酶消化液1ml，轻轻摇晃后弃去。再加入胰蛋白酶消化液2ml，将其浸润细胞后，放入CO2孵化箱中消化2-3min。注入5ml培养液，用滴管吸取培养瓶中的培养液反复吹打培养瓶基面。取2只无菌的培养瓶，将含有细胞的培养液均匀份入培养瓶中，分别加入10ml新鲜培养液后培养。
2.3细胞冻存
先制成含细胞50万/ml的细胞悬液，后加10％DMSO，装入冻存管中火封，放置于-20℃冰箱内3h后取出，置于-60℃冰箱内过夜，取出后装入固定架后投入液氮中保存。
2.4细胞复苏
取出冻存管后，迅速投入37℃的温水化冻，吸出细胞液，离心1000rpm，10min，弃上清液，除去DMSO，换入含20％胎牛血清的培养液，稀释细胞数为20-50万/ml分种于培养瓶中，置于CO2孵化箱中培养。
3.实验结果
表1GH-02对A549细胞的影响(X±S，n＝4)
注：＊表示与空白对照组比较，P＜0.05。＊＊表示与空白对照组比较，P＜0.01。△表示与阳性对照(阿霉素)比较，P＜0.01。▲表示与PV助溶剂比较，P＜0.05。▲▲表示与PVP助溶剂比较，P＜0.01。
4.结论：
GH-02小剂量有一定的抑瘤作用，而高剂量组则有明显的抗肿瘤作用，与模型组相比差异有显著性，而与阳性对照组相比则差异无显著性。GH-02抗肿瘤作用虽然稍逊于阳性对照阿霉素，但仍显示出较强的抗肿瘤作用。
实施例十一蓝萼甲素(GLA)衍生物对小鼠Lewis肺癌影响的动物模型试验：
采用根据优选实施例六的制备方法制备的、具有实施例七的分子结构的蓝萼甲素(GLA)衍生物的混合物(以下简称GH-02)进行动物模型试验，考察GH-02对小鼠Lewis肺癌的影响。
1.实验材料，
1.1药品与试剂：GH-02(质量分数99.8％)，试验时用生理盐水稀释。
1.2仪器：显微镜，酶标仪
1.3动物：C57纯系小鼠64只，体重为(20士2)9，雌雄兼用，由上海中医药大学实验动物中心提供。实验室温度为22一25℃，常规饲料喂养，饮水量不限。
1.4瘤株：Lewis肺癌实体型由复旦大学肿瘤医院肿瘤研究所罗建民老师惠赠
2.实验方法
模型组(生理盐水10mL/kg)，阳性对照组(环磷酰胺25mg/ml)，GH-02(25mg/ml)分为腹腔注射组、静脉注射组，每组8只动物。实验按常规方法接种，接种后次日按拟定剂量ip给药，每天1次，连续10d。腹水性肿瘤以生命延长率为疗效指标，停药后继续观察60d，死亡动物以实际存活时间计算。实体型肿瘤以瘤质量抑制率作为疗效指标，于停药次日将肿瘤剖出精确称质量。实验结果用抑瘤率x±s表示，组间比较用t检验。
3.实验结果：
实验结果详见表2GH-02对小鼠Lewis肺癌的影响。
4.结论：
GH-02有明显的抑瘤作用和抗肿瘤作用，与模型组相比差异有显著性，而与阳性对照组相比则差异无显著性。GH-02抗肿瘤作用强于阳性对照，显示出较强的抗肿瘤作用。腹腔注射和静脉注射都有明显的抑瘤作用和抗肿瘤作用。
上述内容为本发明的具体实施例的例举，对于其中未详尽描述的试剂、设备、操作方法等，应当理解为采取本领域已有的普通及常规试剂、设备、操作方法等来予以实施。
同时本发明上述实施例仅为说明本发明技术方案之用，仅为本发明技术方案的列举，并不用于限制本发明的技术方案及其保护范围。采用等同技术手段、等同试剂等对本发明权利要求书及说明书所公开的技术方案的改进应当认为是没有超出本发明权利要求书及说明书所公开的范围。
Claims (10)
1.一种蓝萼甲素(GLA)衍生物，其特征在于，是一种二萜类物质，具有贝壳杉烷型结构、羰基、多肽cNGQGEQc和/或羟基，其分子结构的通式如下：
其中，R1为-cNGQGEQc或-OH，R2为-cNGQGEQc或-OH。
2.如权利要求1所述的蓝萼甲素(GLA)衍生物，其特征在于，分子结构如下：
其中，R1为-OH且R2为-cNGQGEQc，或者R1为-cNGQGEQc且R2为-OH，或者R1为-cNGQGEQc且R2为-cNGQGEQc。
3.一种如权利要求1～2所述的蓝萼甲素(GLA)衍生物的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
步骤1：粉碎
取香茶菜药材(地上部分)粉碎至20目～50目；
步骤2：提取
步骤2.1：将步骤1所得的粉碎物与95％乙醇混合，加热回流，提取过滤，得到提取液和剩余物；
步骤2.2：将步骤2.1所得的剩余物与95％乙醇混合，加热回流，提取过滤，得到提取液和剩余物，重复该步骤1～3次；
步骤2.3：合并步骤2.1和2.2所得的提取液；
步骤3：溶剂处理
步骤3.1：将步骤2所得的提取液加热减压浓缩，回收乙醇并得到粘稠的初级浓缩物；
步骤3.2：将步骤3.1所得的初级浓缩物与水混合，搅拌随后静置，弃去上清液得到下层固体；
步骤3.3：将步骤3.2所得的固体与乙酸乙酯混合，搅拌溶解并静置，过滤得到滤液和不溶物；
步骤3.4：将步骤3.3所得的不溶物与乙酸乙酯混合，搅拌溶解并静置，过滤得到滤液和不溶物，重复该步骤1～3次；
步骤3.5：合并步骤3.3和3.4所得的滤液；
步骤3.6：将步骤3.5所得的滤液加热，减压浓缩，回收乙酸乙酯，得到固体浓缩物；
步骤4：过柱
步骤4.1：将步骤3所得的固体浓缩物与95％乙醇混合溶解，得到溶液；
步骤4.2：将步骤4.1所得的溶液缓慢加到树脂柱中，观察树脂的颜色，采用95％乙醇冲洗该树脂柱，收集所有流出液，
步骤4.3：将步骤4.2所得流出液减压加热回流，直至溶剂干，得到固体残留物；步骤5：重结晶
步骤5.1：将上述残留物与极性溶剂混合，得到初级溶液，加热并减压浓缩，静置析晶，过滤得到黄色针状结晶；
步骤5.2：将步骤5.1所得的结晶与极性溶剂混合，反复重结晶2～4次，得到浓缩物；
步骤6：分离提纯
步骤6.1：将步骤5所得的浓缩物加入乙酸乙酯溶解，加入200-300目硅胶，混合均匀，室温挥发干燥，除去溶剂乙酸乙酯；
步骤6.2：湿法填装一根层析硅胶柱，并采用氯仿反复冲洗硅胶柱；
步骤6.3：将步骤6.1所得的混有硅胶的浓缩物加入到步骤6.2所得的硅胶柱中，采用氯仿冲洗；
步骤6.4：采用氯仿和丙酮的混合溶液冲洗所述硅胶柱，并采用TLC薄层分析方法检验目标馏分蓝萼甲素(GLA)，在检验到相应馏分的时候，采用氯仿和丙酮的混合溶液冲洗，收集含有蓝萼甲素(GLA)主成分的馏分；
步骤6.5：将步骤6.4所得的馏分合并，减压浓缩，回收溶剂，将所得的浓缩物用氯仿和丙酮的混合溶液重结晶，得到白色针状晶体蓝萼甲素(GLA)；
步骤7：合成
步骤7.1：将步骤6所得的蓝萼甲素(GLA)和多肽(cNGQGEQc)和无水极性溶剂混合得到混合液；
步骤7.2：将步骤7.1所得的混合溶液加热，搅拌冷凝回流，趁热抽滤，静置，析出晶体，过滤，分离出晶体，得到蓝萼甲素(GLA)衍生物。
4.如权利要求3所述的蓝萼甲素(GLA)衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤2.1中，是将所述粉碎物与95％乙醇按照体积比1∶6至1∶10混合，加热，在80℃～90℃温度条件下回流1～2小时，再提取过滤；
所述步骤2.2中，是将所述剩余物与95％乙醇按照体积比1∶6至1∶10混合，加热，在80℃～90℃温度条件下回流1～2小时，再提取过滤。
5.如权利要求4所述的蓝萼甲素(GLA)衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤3.1中，是将所述提取液加热，在55℃～65℃温度条件下减压浓缩；
所述步骤3.2中，是将所述初级浓缩物与水按照体积比1∶8～1∶10混合，在室温条件下搅拌并随后静置6～12小时才分离上清液和固体；
所述步骤3.3中，是将所述固体与乙酸乙酯按照体积比1∶4～1∶6混合，在25℃～35℃温度条件下搅拌溶解，静置1～3小时再过滤；
所述步骤3.4中，是将所述不溶物与乙酸乙酯按照体积比1∶4～1∶6混合，在25℃～35℃温度条件下搅拌溶解，静置1～3小时再过滤；
所述步骤3.6中，是将所述滤液加热，在35℃～45℃温度条件下减压浓缩。
6.如权利要求5所述的蓝萼甲素(GLA)衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤4.1中，是将所述固体浓缩物与95％乙醇按照体积比1∶4～1∶6混合溶解；
所述步骤4.2中，采用的树脂柱为填充物为强碱性阴离子树脂、并用氢氧化钠饱和至pH值中性的树脂柱；
所述步骤4.2中，当所述树脂柱有2/3变色时，停止加样，并采用200ml～400ml的95％乙醇冲洗所述树脂柱；
所述步骤4.3中，是将所述流出液加热，并在55℃～65℃温度条件下减压回流。
7.如权利要求6所述的蓝萼甲素(GLA)衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤5.1和5.2中，所述极性溶剂混合为按照体积比1∶1～1∶2混合的氯仿和丙酮的混合溶液；所述步骤5.1中，是将所述残留物与30℃～40℃的极性溶剂按照体积比1∶4～1∶6混合；
所述步骤5.1中，是将所述初级溶液加热，在30℃～40℃温度条件下减压浓缩，在-5℃～-8℃温度条件下静置析晶；
所述步骤5.2中，是将所述结晶与极性溶剂按照体积比1∶4～1∶6混合，在-5℃～-8℃温度条件下反复重结晶2～4次。
8.如权利要求7所述的蓝萼甲素(GLA)衍生物的制备方法，其特征在于，所述的步骤6.1中，是将所述的浓缩物加入20ml乙酸乙酯溶解，而所述硅胶的加入量为所述浓缩物重量的3倍；
所述步骤6.2中，所述硅胶用量为步骤5所得的浓缩物重量的20倍，柱子径高比为1∶12，所述氯仿的用量为2BV(2倍柱体积)；
所述步骤6.3中，所述氯仿的用量为2BV且流速为1.5BV/小时；
所述步骤6.4中，是采用3BV的氯仿和丙酮的混合溶液冲洗所述硅胶柱，再进行TLC薄层分析，在检验到相应馏分的时候，是采用6BV的氯仿和丙酮的混合溶液冲洗，收集馏分；
所述的3BV的氯仿和丙酮的混合溶液中，氯仿和丙酮的体积比为20∶1；
所述的6BV的氯仿和丙酮的混合溶液中，氯仿和丙酮的体积比为10∶1；
所述步骤6.5中，所得馏分是在30℃～40℃温度条件下减压浓缩，浓缩过程中氯仿和丙酮的混合溶液的用量与所述馏分的体积比为8∶1～12∶1；
所述氯仿和丙酮的混合溶液中，氯仿和丙酮的体积比为1∶1～1∶4。
9.如权利要求8所述的蓝萼甲素(GLA)衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤7.1中，是按照每8～17g蓝萼甲素(GLA)、0.7～2.3g多肽(cNGQGEQc)和80～150ml无水极性溶剂的比例混合；
所述步骤7.1中，所述无水极性溶剂为甲醇、乙醇、二氯甲烷中的一种；
所述步骤7.2中，是将所述混合溶液加热，在60℃～80℃温度条件下搅拌冷凝回流6～10小时，趁热抽滤，室温下静置析晶。
10.如权利要求1～3所述的蓝萼甲素(GLA)衍生物在治疗癌症中的应用，特别是在治疗肺癌、肝癌、鼻咽癌、淋巴瘤、黑色素瘤和骨髓性白血病中的应用。
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