CN111187279A - 蓝萼甲素-生物素类小分子探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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CN111187279A CN202010044612.6A CN202010044612A CN111187279A CN 111187279 A CN111187279 A CN 111187279A CN 202010044612 A CN202010044612 A CN 202010044612A CN 111187279 A CN111187279 A CN 111187279A
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张涛
李念先
刘兆敏
马雯
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Abstract

本发明涉及蓝萼甲素（GLA）小分子探针及其制备方法和应用，属药物化学领域。所述蓝萼甲素小分子探针结构上包括蓝萼甲素（GLA）、连接基团（Linker）和报告基团（生物素，biotin）三部分组成，具有通式I结构。本发明设计的蓝萼甲素分子探针经过体外抗肿瘤活性测试，结果显示：其对肿瘤细胞有较好的抑制作用，可作为小分子探针用于蓝萼甲素的作用机制研究。

Description

蓝萼甲素-生物素类小分子探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及蓝萼甲素小分子探针及其制备方法与抗肿瘤作用，属药物化学领域。
背景技术
活性天然产物的发现和结构修饰在创新药物研发中起着重要的作用。据统计，1980年至今，全球批准上市的创新药物中，约50％左右是天然药物的直接应用或活性天然产物的结构修饰物。但这些药物中，大多是通过基于细胞效应的筛选而发现，其作用靶点和作用机制不够清晰，这对新药的研究与开发有着很大的影响。因此，活性小分子化合物在细胞内作用靶点的确定是药物化学、化学生物学、特别是药物研发过程中的关键。
蓝萼甲素(Glaucocalyxin A，GLA)是从唇形科香茶菜属药用植物蓝萼香茶菜中分离得到的对映-贝壳杉烷型四环二萜化合物。研究表明蓝萼甲素的活性中心基团为α,β-不饱和酮单元，体外抗肿瘤实验表明，蓝萼甲素有良好的抑制前列腺癌DU-145、直肠癌Lovo、人早幼粒白血病细胞HL-60等肿瘤细胞株增殖的作用。特别对直肠癌(Lovo)、非激素依赖性前列腺癌(DU-145)细胞最为敏感。形态学观察发现，浓度为50、25μmol/L的蓝萼甲素可诱导DU-145、Lovo肿瘤细胞发生细胞凋亡。中国专利201210015481.4“一种蓝萼甲素衍生物及其制备方法和应用”报道了蓝萼甲素缩醛衍生物对肝癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、食管癌、绒癌、前列腺癌、直肠癌、急性粒细胞白血病或慢性粒细胞白血病有显著的增值抑制作用。是一种很有前景的抗肿瘤活性先导化合物。论文报道了(Liu CX,Yin QQ,Zhou HC,et al.Naturechemical biology,2012,8:486-493.)类似于蓝萼甲素的四环二萜类化合物Adenanthin，通过分子探针技术鉴定了Adenanthin对白血病细胞(leukemic cells)的作用靶标是过氧化物还原酶peroxiredoxin I和II。
综上，尽管蓝萼甲素在体外具有良好的抗肿瘤作用，但其构效关系研究较少，活性化合物的设计与合成是研究中心的难点，作用靶点和作用机制也不明确。因此需要设计并制备出具有生物活性的小分子探针，对蓝萼甲素作用靶点和抗肿瘤机制研究具有重要意义。生物素作为一种常用的标记基团，目前未见有生物素与蓝萼甲素连接形成“生物素-蓝萼甲素”生物素标记的探针，从而调取其作用靶点的实验报道。
发明内容
为了克服现有蓝萼甲素作用靶点和抗肿瘤机制研究的不足，本发明的目的是设计合成蓝萼甲素小分子探针，通过引入两亲性的聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)和二羧酸组成的连接基团将蓝萼甲素和生物素报告基团连接起来组成新型的小分子探针。本发明保留蓝萼甲素的α，β-不饱和酮的活性中心和羟基等活性基团，引入毒性小易代谢的聚乙二醇和二酸基团，得到水溶性好，有良好的抗肿瘤活性分子探针，为进一步研究蓝萼甲素的作用机制提供模板分子。
另一目的是提供四环二萜类化合物分子探针的合成方法及其应用。
本发明的技术方案如下所示：
1.蓝萼甲素小分子探针，其具有通式I的结构：
Figure BDA0002368935940000021
R为氢或羟基。n为1、2或3。
2.所述蓝萼甲素小分子探针优选为1～12所示化合物。
Figure BDA0002368935940000022
Figure BDA0002368935940000031
3.本发明提供蓝萼甲素分子探针的合成方法，如下反应过程所示：
1)biotin-PEG-N3的制备：
Figure BDA0002368935940000032
(1)聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)与对甲苯磺酰氯或甲磺酰氯溶于有机溶剂，冰浴，碱性条件发生取代反应，反应结束后有机溶剂萃取，干燥、过滤、浓缩得到两端磺酰基取代中间体1。酰氯优选对甲苯磺酰氯，与聚乙二醇的摩尔比为1:2～1:4,优选1:2.2。所述碱选用氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钾、碳酸钠、吡啶、三乙胺、DMAP、二异丙基乙胺、N-甲基吗啉中的一种或几种；
(2)磺酸酯衍生物1与叠氮钠溶于有机溶剂，加热发生取代反应，反应结束后用有机溶剂萃取，干燥、过滤、浓缩得到化合物2；
步骤(1)、(2)所述有机溶剂选N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、二氯甲烷、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、石油醚、二氧六环、乙醇中的一种或几种。
(3)化合物2与还原剂溶于有机溶剂，酸性条件，惰性气体气氛下发生还原反应；反应结束后，用有机溶剂萃取，干燥、过滤、浓缩得到化合物3；所述惰性气体选自氮气或氩气；所述还原剂选自三苯基磷、氢气/钯碳、硼氢化钠、四丁基硼氢化铵、氢化铝锂、二甲氨基硼烷中的一种或者几种。
(4)化合物3与生物素biotin溶于有机溶剂，室温反应过夜，旋干溶剂，柱层析得到化合物4；所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、二氯甲烷、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、石油醚、二氧六环、乙醚、乙醇中的一种或两种；
2)通式I的合成方法为：
Figure BDA0002368935940000041
(1)将蓝萼甲素与炔丙基取代苯甲醛类化合物溶于有机溶剂中，搅拌使之溶解，然后再滴加浓硫酸，室温反应，反应结束后，萃取，有机相经洗涤后，干燥，过滤，减压浓缩。粗产品经硅胶柱层析纯化，经洗脱剂洗脱，得蓝萼甲素末端炔基的缩醛衍生物。所述炔丙基取代苯甲醛类化合物优选3-(丙-2-炔-1-基氧基)苯甲醛或4-(丙-2-炔-1-基氧基)苯甲醛或3-羟基-4-(丙-2-炔-1-基氧基)苯甲醛或4-羟基-3-(丙-2-炔-1-基氧基)苯甲醛中的一种。
(2)将上述得到的蓝萼甲素末端炔基的缩醛衍生物与生物素报告基团(biotin-PEG-N3)溶于有机溶剂，搅拌使全部溶解后，冰浴条件下反应，再加入催化剂反应，撤走冰水浴，继续室温条件下反应。反应结束后萃取，有机相经洗涤，干燥，过滤之后旋干减压浓缩，柱层析分离纯化，洗脱，得蓝萼甲素三氮唑基团的分子探针。
通式I的合成步骤(1)中，所述有机溶剂为THF、CH2Cl2、DMF、DMSO中的一种；反应时间为0.5～1h。蓝萼甲素与苯甲醛类化合物的摩尔比为1:1。
通式I的合成步骤(2)中，所述有机溶剂为THF、CH2Cl2、DMF、DMSO中的一种；反应时间为5h。蓝萼甲素末端炔基的缩醛衍生物与生物素报告基团(biotin-PEG-N3)的摩尔比为1:1。催化剂采用如下方法配制而成：无水硫酸铜粉末用水充分溶解，L-抗坏血酸钠用水充分溶解，BPDS(水合红菲绕啉二磺酸钠)用水/DMF(V/V 4:1)充分溶解，将前两者混合均匀，取一半量加入BPDS中，充分混匀。
4.所述原料优选以下所示化合物：
Figure BDA0002368935940000051
筛选出活性好的化合物作为小分子探针研究蓝萼甲素的抗肿瘤机制。
还可以将其应用在抑制肿瘤药物中。特别是制备抗肝癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌、食管癌药物。
本发明具有以下优点：
1、合成了系列以PEG链为连接基团、生物素为报告基团的新型系列蓝萼甲素小分子探针。
2、该蓝萼甲素小分子探针具良好的水溶性和抗肿瘤活性，为蓝萼甲素“钓取”其靶点、研究作用机制提供基础和模板分子，具有较好应用前景。
3、本发明合成方法更为简便，反应条件温和，为天然产物复杂长链分子探针设计提供了更好的方法。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例所述制备过程，所采用的所有化学试剂如无特别标注均为分析纯。
实施例1：
实施例1：biotin-PEG-N3的制备
取二乙二醇9.4mmol加入圆底烧瓶中，加入无水二氯甲烷20mL，冰浴搅拌溶解，加入对甲苯磺酰氯3.6g(18.8mmol)，再分批次加入经研磨的氢氧化钾，冰浴反应3h。停止反应后，加水和二氯甲烷萃取，保留有机层，有机层依次用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥3小时，过滤，浓缩得白色固体状两端对甲苯磺酰基(Ts)取代的聚乙二醇衍生物。
取上步Ts取代的聚乙二醇化合物1g(2.4mmol)加入到50ml圆底烧瓶中，加入DMF15mL，后加入叠氮钠0.5g(7.2mmol)，90℃反应10h。反应结束后加入乙酸乙酯萃取，再用蒸馏水、饱和氯化钠溶液洗涤，保留有机层用无水硫酸钠粉末进行干燥3h，过滤后用旋转蒸发仪减压浓缩，得淡黄色油状两端叠氮取代的聚乙二醇衍生物。
取上步叠氮化合物1.3g(8mmol)加入圆底烧瓶中，加入0.65M磷酸15mL，搅拌均匀，然后将三苯基膦1.8g(6.7mmol)溶于10mL乙醚，用调速滴液漏斗缓慢滴加到反应液中，室温反应24h。整个操作及反应一直在氮气保护下进行。反应结束后用少量乙醚萃取三次，保留水层并蒸至无乙醚味，加入氢氧化钾1.2g，4℃冷藏16h,过滤掉析出的三苯基氧膦。水层中再加入氢氧化钾4.8g，用二氯甲烷萃取10次以上，合并有机层并依次用等量的蒸馏水、饱和氯化钠溶液进行洗涤，保留有机层，用无水硫酸钠粉末干燥，过滤后用旋转蒸发仪减压浓缩，得淡黄色油状氨基叠氮衍生物。
将氨基叠氮衍生物150mg(1.2mmol)加入25mL圆底烧瓶中，加入3mL DMF，后加入生物素琥珀酰亚胺307mg(0.9mmol)，室温反应12h。反应结束后蒸干DMF，通过硅胶柱层析纯化，二氯甲烷/甲醇/乙酸200:10:0.1进行柱层析分离，得白色固体：biotin-PEG-N3。
实施例2：蓝萼甲素缩醛炔类衍生物合成
称取化合物对羟基苯甲醛或3-羟基苯甲醛(8mmol)和溴丙炔(1.0g，8mmol)，加入50mL的圆底烧瓶中，加入5mL的DMF，搅拌至样品全部溶解，再加入无水碳酸钾1.0g，碘化钾40mg，温度调至40摄氏度，反应8h。待体系冷却至室温后，将反应液过滤至转至分液漏斗内，加入20ml水，依次用乙酸乙酯萃取20ml*3，饱和食盐水洗涤，有几层用无水硫酸钠干燥0.5h，过滤，浓缩。粗产品经硅胶柱层析纯化，石油醚：乙酸乙酯＝5:1进行洗脱得白色固体为3-(丙-2-炔-1-基氧基)苯甲醛或4-(丙-2-炔-1-基氧基)苯甲醛。
取上述炔代苯甲醛化合物(0.6mmol)和蓝萼甲素(200mg，0.6mmol)，加入50mL的圆底烧瓶中，加入无水二氯甲烷6mL，搅拌至样品全部溶解，滴加2滴浓硫酸，室温反应0.5小时。反应完毕后，将反应液转入分液漏斗内，加入水20mL，用3×20mL二氯甲烷萃取，合并有机相后用饱和碳酸氢钠，饱和食盐水洗涤，分出有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩。粗产品经硅胶柱层析纯化，依次用二氯甲烷，二氯甲烷：丙酮＝100：1为洗脱剂进行洗脱，浓缩得白色固体蓝萼甲素缩醛炔类衍生物。
实施例3：系列通式I蓝萼甲素小分子探针的制备
取蓝萼甲素末端炔基的缩醛衍生物(65mg，0.14mmol)和生物素报告基团(biotin-PEG-N3)(60mg，0.14mmol)于50ml干燥的圆底烧瓶中，加入2ml DMF，搅拌使固体全部溶解后，冰浴条件下反应10min，再加入催化剂反应0.5h，撤走冰水浴，继续室温条件下反应5h，溶液呈亮绿色。反应结束后加入乙酸乙酯20ml，依次用3×20mL蒸馏水、20mL饱和食盐水进行萃取，然后分出有机层，经洗涤，无水NaSO4干燥，过滤之后减压浓缩，柱层析分离纯化，二氯甲烷/甲醇15:1进行洗脱，得油状物。
所述催化剂的配制：无水硫酸铜粉末6mg(用60μL水充分溶解)，L-抗坏血酸钠6mg(用60μL水充分溶解)，BPDS 8mg(用120μL水/DMF(V/V 4:1)充分溶解)，将前两者混合均匀使其成黄色混悬液时，取一半量加入BPDS中，充分混匀。
通过上述方法得到蓝萼甲素小分子探针化合物1～12。
化合物1：产率为35％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.72(s,1H),7.31(dd,J＝16.4,8.5Hz,2H),6.92(dd,J＝11.8,8.7Hz,2H),6.58(s,1H),6.47(s,1H),6.16(s,1H),5.82(s,1H),5.39(s,1H),5.16(s,2H),4.72(s,1H),4.50(t,J＝4.8Hz,2H),4.45–4.36(m,2H),4.19(dd,J＝7.4,4.3Hz,1H),3.81(t,J＝4.7Hz,2H),3.48(t,J＝4.9Hz,2H),3.38–3.32(m,2H),3.18(s,1H),3.11–3.02(m,1H),2.88–2.81(m,1H),2.70–2.64(m,1H),2.59–2.50(m,1H),2.46–2.39(m,1H),2.33–2.23(m,1H),2.21–2.14(m,2H),2.01–1.96(m,2H),1.90–1.85(m,2H),1.69–1.49(m,8H),1.44–1.33(m,4H),1.22(s,3H),1.12(d,J＝3.8Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ215.59,205.50,173.51,163.97,158.65,146.40,143.87,131.16,127.75,123.99,117.71,114.55,93.53,77.62,72.31,69.92,69.77,68.80,61.92,61.77,60.14,55.61,55.16,51.55,50.93,50.61,50.20,47.21,43.13,40.57,38.91,38.18,37.85,35.77,33.92,30.82,28.10,27.97,26.37,25.55,23.09,21.44,18.11,17.00.HR-ESI-MS(m/z)calcd for C44H58N6O8S,[M+Na]+853.3929,found 853.3926.
化合物2：产率为41％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(s,1H),7.31(dd,J＝16.3,8.7Hz,2H),6.93(dd,J＝11.2,8.9Hz,2H),6.60(s,1H),6.46(s,1H),6.18(s,1H),5.82(s,1H),5.40(s,1H),5.18(s,2H),4.72(s,1H),4.53(t,J＝4.8Hz,1H),4.46–4.38(m,2H),4.31–4.24(m,1H),3.87(t,J＝5.3Hz,2H),3.57–3.55(m,3H),3.52–3.50(m,2H),3.41–3.38(m,3H),3.19(s,1H),3.15–3.09(m,1H),2.86–2.84(m,1H),2.73–2.68(m,1H),2.60–2.51(m,1H),2.47–2.40(m,1H),2.33–2.23(m,1H),2.21–2.16(m,2H),2.02–1.96(m,2H),1.91–1.85(m,2H),1.74–1.58(m,7H),1.55–1.52(m,1H),1.46–1.38(m,4H),1.24–1.21(m,3H),1.12(d,J＝3.4Hz,6H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ215.80,205.68,173.64,164.03,158.85,146.56,144.03,131.30,127.84,124.25,117.92,114.78,93.76,77.80,72.48,70.60,70.28,70.15,69.48,62.18,61.99,60.42,55.70,55.34,51.11,50.82,50.51,47.40,43.33,40.72,39.32,38.37,38.03,36.10,34.11,31.01,28.34,28.26,26.55,25.78,23.27,21.63,18.30,17.20.HR-ESI-MS(m/z)calcd for C46H62N6O9S,[M+Na]+897.4191,found 897.4196.
化合物3：产率为47％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.80(s,1H),7.31(dd,J＝16.4,8.7Hz,2H),6.92(d,J＝8.8Hz,2H),6.70(s,1H),6.42(s,1H),6.18(s,1H),5.82(s,1H),5.40(s,1H),5.17(s,2H),4.72(s,1H),4.53(t,J＝4.9Hz,2H),4.46–4.38(m,2H),4.28–4.25(m,1H),3.86(t,J＝5.0Hz,2H),3.60–3.55(m,8H),3.40–3.38(m,2H),3.19(s,1H),3.12–3.09(m,1H),2.86–2.84(m,1H),2.71(t,J＝10.4Hz,1H),2.58–2.51(m,1H),2.45–2.40(m,1H),2.33–2.15(m,5H),2.01–1.99(m,2H),1.91–1.86(m,2H),1.71–1.52(m,8H),1.41–1.32(m,4H),1.23(t,J＝6.2Hz,3H),1.13(d,J＝3.3Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ215.75,205.61,173.55,164.21,158.85,146.51,143.88,131.21,127.87,124.26,117.85,114.68,93.72,77.74,72.43,70.78,70.63,70.49,70.16,70.04,69.50,62.10,61.90,60.32,55.76,55.28,51.69,51.06,50.43,47.34,43.27,40.64,39.25,38.31,37.98,36.07,34.06,30.95,28.38,28.22,26.48,25.76,23.22,21.58,18.24,17.13.HR-ESI-MS(m/z)calcd forC48H66N6O10S,[M+Na]+941.4453,found 941.4458.
化合物4：产率为30％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.74(s,1H),7.23(t,J＝7.5Hz,1H),7.00–6.97(m,2H),6.92(dd,J＝7.7,2.4Hz,1H),6.40(s,1H),6.17(s,1H),5.85(s,1H),5.41(s,1H),5.17(s,2H),4.75(s,1H),4.53(t,J＝4.8Hz,2H),δ4.41(dd,J＝12.4,4.8Hz,1H),4.20(dd,J＝7.5,4.5Hz,1H).3.84(t,J＝4.8Hz,2H),3.50(t,J＝4.9Hz,2H),3.37–3.34(m,2H),3.21(s,1H),3.08–3.03(m,1H),2.84(dd,J＝13.0,4.8Hz,1H),2.71–2.58(m,1H),2.57–2.51(m,1H),2.47–2.41(m,1H),2.30(q,J＝12.6Hz,2H),2.20–2.13(m,2H),2.04–1.96(m,2H),1.92–1.86(m,2H),1.67–1.53(m,8H),1.41–1.30(m,4H),1.23(s,3H),1.13(d,J＝5.0Hz,6H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ215.56,205.50,173.43,163.71,158.13,146.35,143.94,139.60,129.55,124.05,119.38,117.84,115.49,112.68,93.49,77.71,72.34,69.80,68.85,61.91,61.75,60.09,55.48,55.25,51.56,50.92,50.23,47.22,43.12,40.58,38.93,38.20,37.84,35.74,33.92,30.84,28.01,27.94,26.38,25.48,23.07,21.46,18.11,17.01.HR-ESI-MS(m/z)calcd for C44H58N6O8S,[M+H]+831.4110,found 831.4109.
化合物5：产率为51％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.79(s,1H),7.23(t,J＝7.8Hz,1H),6.70–6.97(m,2H),6.92(dd,J＝8.2,2.1Hz,1H),6.57–6.54(m,1H),6.35–6.32(m,1H),5.84(s,1H),5.41(s,1H),5.17(s,2H),4.74(s,1H),4.55(t,J＝4.9Hz,2H),4.48–4.39(m,2H),4.30–4.23(m,1H),3.88(t,J＝5.0Hz,2H),3.57–3.52(m,5H),3.41–3.36(m,3H),3.21(s,1H),3.13–3.06(m,1H),2.90–2.83(m,1H),2.69(t,J＝12.9Hz,1H),2.60–2.51(m,1H),2.47–2.41(m,1H),2.29(q,J＝12.6Hz,1H),2.22–2.15(m,2H),2.02–1.96(m,2H),1.92–1.86(m,2H),1.69–1.57(m,7H),1.57–1.53(m,1H),1.44–1.36(m,3H),1.33–1.29(m,1H),1.23(s,3H),1.17–1.11(m,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ215.59,205.45,173.44,163.82,158.16,146.33,143.92,139.57,129.54,124.09,119.32,117.83,115.45,112.76,93.52,77.72,72.32,70.39,70.04,69.31,62.00,61.77,60.12,55.53,55.23,51.58,50.93,50.64,50.30,47.22,43.12,40.54,39.12,38.19,37.85,35.87,33.93,30.84,28.16,28.06,26.36,25.58,23.07,21.46,18.11,17.00.HR-ESI-MS(m/z)calcd for C46H62N6O9S,[M+Na]+897.4191,found 897.4189.
化合物6：产率为35％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.99(s,1H),7.81(s,1H),7.21(t,J＝7.5Hz,1H),6.99–6.95(m,2H),6.92–6.86(m,1H),6.45(s,1H),6.16(s,1H),5.83(s,1H),5.58(s,1H),5.39(s,1H),5.15(s,2H),4.73(s,1H),4.54(t,J＝4.9Hz,2H),4.43–4.37(m,2H),4.24–4.21(m,1H),3.86(t,J＝4.8Hz,2H),3.61–3.54(m,8H),3.48(t,J＝4.7Hz,2H),3.39–3.36(m,2H),3.19(s,1H),3.09–3.06(m,1H),2.84–2.80(m,1H),2.67–2.50(m,2H),2.45–2.39(m,3H),3.39–3.36(m,2H),2.28(q,J＝12.6Hz,1H),2.15(t,J＝7.4Hz,2H),2.01–1.94(m,2H),1.90–1.86(m,2H),1.68–1.51(m,7H),1.41–1.32(m,2H),1.22(s,3H),1.12(d,J＝4.2Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ215.78,205.59,173.67,164.14,158.34,146.47,143.95,139.70,129.65,124.33,119.43,117.96,115.61,112.84,93.67,77.85,72.45,70.62,70.52,70.45,70.15,70.05,69.52,62.10,61.91,60.29,55.73,55.36,51.72,51.07,50.43,47.36,43.25,40.65,39.24,38.32,37.98,36.01,34.06,30.97,28.36,28.19,26.49,25.76,23.20,21.59,18.24,17.13.HR-ESI-MS(m/z)calcd for C48H66N6O10S,[M+Na]+941.4453,found 941.4452.
化合物7：产率25％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.88(s,1H),6.70–6.92(m,1H),6.88–6.79(m,3H),6.49–6.41(m,2H),6.31(s,1H),6.09(s,1H),5.78–5.80(m,1H),5.59(s,1H),5.37–5.41(m,1H),5.12(s,2H),4.71(s,1H),4.52–4.46(m,2H),4.40–4.35(m,2H),4.24–4.19(m,1H),3.83(s,2H),3.51(t,J＝4.5Hz,2H),3.38–3.36(m,2H),3.18(s,1H),2.86–2.80(m,1H),2.72–2.62(m,1H),2.59–2.51(m,1H),2.45–2.41(m,1H),2.28(d,J＝12.8Hz,1H),2.20(t,J＝7.4Hz,2H),2.00–1.96(m,2H),1.88–1.86(m,2H),1.65–1.50(m,8H),1.38–1.31(m,4H),1.20(s,3H),1.12(d,J＝6.1Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ215.81,205.84,174.18,164.13,146.71,146.62,143.77,132.29,124.63,118.10,117.86,114.15,113.31,93.71,77.85,72.51,70.21,70.15,70.06,68.91,62.14,62.00,60.40,55.69,55.38,51.77,51.13,50.48,47.41,43.30,40.72,39.26,38.36,36.11,34.10,31.01,28.34,28.25,26.53,25.70,23.26,21.62,18.28,17.17.HR-ESI-MS(m/z)calcd for C44H58N6O9S,[M+Na]+869.3878,found 869.3877.
化合物8，产率27％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87(s,1H),6.97–6.92(m,2H),6.83(dd,J＝8.4,1.6Hz,1H),6.69(s,1H),6.40(s,1H),6.15(s,1H),5.77(s,1H),5.39(s,1H),5.20(s,2H),4.71(s,1H),4.52–4.50(m,2H),4.41–4.35(m,2H),4.24–4.21(m,1H),3.85–3.83(m,2H),3.54–3.47(m,6H),3.40–3.37(m,2H),3.18(s,1H),3.09–3.04(m,1H),2.84(dd,J＝12.7,4.4Hz,1H),2.66(d,J＝12.8Hz,1H),2.60–2.51(m,1H),2.47–2.40(m,1H),2.28(q,J＝12.4Hz,1H),2.15(t,J＝7.3Hz,2H),2.04–1.96(m,2H),1.88–1.85(m,2H),1.68–1.48(m,8H),1.39–1.29(m,4H),1.22(s,3H),1.13(d,J＝4.5Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ215.64,205.53,173.75,163.98,146.50,146.44,146.39,132.37,124.39,118.03,117.67,114.04,113.56,93.48,77.60,72.29,70.39,69.96,69.85,69.25,63.30,61.85,60.22,55.51,55.18,51.56,50.94,50.34,47.22,43.13,40.49,39.13,38.18,37.86,35.76,33.93,30.83,29.71,28.08,27.96,26.37,25.51,23.10,21.45,18.12,17.00.HR-ESI-MS(m/z)calcd forC46H62N6O10S,[M+Na]+913.4140,found 913.4145.
化合物9，产率48％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.91(s,1H),6.92–6.95(m,2H),6.83(dd,J＝8.2,2.0Hz,2H),6.30(s,1H),6.15(s,1H),5.77(s,1H),5.52(s,1H),5.38(s,1H),5.19(s,2H),4.71(s,1H),4.52(t,J＝4.7Hz,2H),4.44–4.35(m,2H),4.24–4.21(m,1H),3.85–3.83(m,2H),3.55–3.47(m,8H),3.39–3.37(m,2H),3.18(s,1H),3.06(q,J＝7.3Hz,1H),2.83(dd,J＝13.6,4.5Hz,1H),2.68(d,J＝12.9Hz,1H),2.59–2.51(m,1H),2.45–2.40(m,2H),2.32–2.23(m,2H),2.13(t,J＝7.2Hz,2H),2.01–1.96(m,2H),1.88–1.85(m,2H),1.67–1.51(m,8H),1.38–1.31(m,4H),1.22(s,3H),1.13(d,J＝4.0Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ215.84,205.69,173.83,164.12,146.61,146.52,143.63,132.52,124.70,118.24,117.86,114.20,113.52,93.68,77.77,72.46,70.61,70.49,70.47,70.14,70.06,69.49,63.33,62.02,60.42,55.67,55.35,51.74,51.12,50.51,47.41,43.31,40.68,39.28,38.36,38.04,35.97,34.12,31.01,29.89,28.32,28.18,26.53,25.69,23.27,21.64,18.30,17.18.HR-ESI-MS(m/z)calcd for C48H66N6O11S,[M+Na]+957.4402,found 957.4406.
化合物10，产率35％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.83(s,1H),6.97(s,1H),6.87–6.76(m,3H),6.40(s,1H),6.14(s,1H),5.78(s,1H),5.38(s,1H),5.27(s,1H),5.16–5.08(m,2H),4.70(s,1H),4.46(s,2H),4.38–4.34(m,2H),4.14–4.10(m,1H),3.76(t,J＝4.6Hz,2H),3.42(t,J＝4.4Hz,2H),3.28(d,J＝4.0Hz,2H),3.17(s,1H),2.98–2.91(m,1H),2.76(dd,J＝12.5,4.2Hz,1H),2.63–2.49(m,2H),2.43–2.37(m,1H),2.27(q,J＝12.6Hz,1H),2.07(t,J＝6.8Hz,2H),2.01–1.92(m,2H),1.90–1.82(m,2H),1.48–1.56(m,7H),1.36–1.23(m,4H),1.19(s,3H),1.10(d,J＝3.5Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ215.87,205.96,174.22,164.35,147.55,146.67,145.98,143.66,130.05,124.63,120.65,117.94,115.82,111.80,93.76,77.77,72.53,69.94,68.91,63.13,61.99,60.32,55.74,55.39,51.71,51.12,50.42,47.39,43.28,40.65,39.12,38.36,38.02,35.79,34.09,30.98,28.17,28.01,26.51,25.61,23.29,21.62,18.28,17.15.HR-ESI-MS(m/z)calcd for C44H58N6O9S,[M+H]+847.4059,found 847.4057.
化合物11，产率49％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84(s,1H),6.99(d,J＝1.5Hz,1H),6.87(dd,J＝8.2,1.6Hz,1H),6.81(d,J＝8.2Hz,1H),6.75(s,1H),6.15(s,1H),5.77(s,1H),5.38(s,1H),5.27(s,1H),5.16(s,2H),4.70(s,1H),4.50(t,J＝4.8Hz,2H),4.38–4.34(m,2H),4.20–4.17(m,1H),3.83(t,J＝4.9Hz,2H),3.50(dd,J＝12.4,5.1Hz,4H),3.44(t,J＝5.0Hz,2H),3.33(d,J＝4.2Hz,2H),3.17(s,1H),3.05–3.00(m,1H),2.79(dd,J＝12.8,4.7Hz,1H),2.65–2.48(m,2H),2.44–2.37(m,1H),2.26(q,J＝12.6Hz,1H),2.13(t,J＝7.3Hz,2H),2.02–1.92(m,2H),1.90–1.80(m,2H),1.60–1.48(m,7H),1.38–1.27(m,4H),1.22–1.19(m,3H),1.10(d,J＝2.7Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ215.79,205.79,173.98,164.29,147.58,146.63,145.91,143.69,130.17,124.60,120.77,117.89,115.74,112.23,93.79,77.79,72.51,70.54,70.13,69.98,69.41,63.46,62.02,60.40,55.74,55.35,51.74,51.15,50.50,47.40,43.29,40.63,39.31,38.36,38.04,35.92,34.10,31.00,28.28,28.13,26.50,25.71,23.31,21.64,18.28,17.15.HR-ESI-MS(m/z)calcd for C46H62N6O10S,[M+H]+891.4321,found 891.4319.
化合物12，产率38％。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.06(s,1H),7.03(d,J＝1.8Hz,1H),6.86(dd,J＝8.2,1.8Hz,1H),6.75(d,J＝8.2Hz,1H),6.12(s,1H),5.93(s,1H),5.49(s,1H),5.45(s,1H),5.15(s,2H),4.60–4.57(m,2H),4.44(dd,J＝7.8,4.5Hz,1H),4.31(dd,J＝12.5,4.9Hz,1H),4.24(dd,J＝7.9,4.4Hz,1H),3.89–3.86(m,2H),3.58–3.56(m,2H),3.55–3.54(m,2H),3.53(s,5H),3.46(t,J＝5.5Hz,2H),3.31–3.29(m,2H),3.16(s,1H),3.15–3.11(m,1H),2.90–2.86(m,1H),2.69–2.64(m,1H),2.63–2.57(m,1H),2.44(q,J＝12.8Hz,1H),2.44–2.37(m,1H),2.16(t,J＝7.4Hz,2H),2.09–1.98(m,2H),1.89–1.82(m,2H),1.69–1.61(m,3H),1.60–1.53(m,5H),1.43–1.35(m,4H),1.27(s,3H),1.14(d,J＝1.0Hz,6H).13C NMR(101MHz,MeOD)δ218.68,207.79,176.21,166.20,149.11,148.96,147.14,144.85,131.83,126.35,121.67,117.75,116.57,113.88,94.87,78.88,74.11,71.65,71.58,71.57,71.36,70.68,70.46,63.65,63.47,61.73,57.11,56.90,54.97,53.24,52.42,51.67,44.82,41.20,40.46,39.60,39.03,36.88,35.15,32.06,29.90,29.62,26.97,26.92,24.44,22.11,19.31,17.41.HR-ESI-MS(m/z)calcd for C48H66N6O11S,[M+H]+935.4583,found935.4588.
实施例4：蓝萼甲素小分子探针的药效实验：癌细胞体外抑制活性测试
针对人肝癌HepG2细胞、人宫颈癌Hela细胞的生长抑制作用的药效学实验。
1.药物与试剂：受试样品，DMEM、1640培养基，10％灭活小牛血清(FBS)，PBS溶解液，二甲基亚砜(DMSO)，三联液(10％SDS+5％异丙醇+12mM HCl)，噻唑蓝(MTT)，5-FU(阳性对照药)。
2.仪器：超净工作台，CO2培养箱，多功能倒置显微镜，离心机，自动酶标仪96孔培养板。
3.细胞株：人肝癌HepG2肿瘤细胞、人宫颈癌Hela细胞。
4.样品配制：取本发明制备得到的蓝萼甲素小分子探针1～12，用DMSO溶解化合物，超声溶解，浓度为100mM，所得药物溶液-20℃条件下储存。
5.实验方法
步骤1：贴壁细胞的药物MTT实验，其进一步包括：
所述贴壁细胞包括人肝癌HepG2肿瘤细胞、人宫颈癌Hela细胞。
步骤1.1：收集对数生长期细胞，用完全DMEM培养基悬浮，并调整细胞悬液浓度为3×104/mL，接种96孔细胞培养板，100mL/孔。置37℃，5％CO2培养箱培养24小时，弃去上清，加入新鲜完全DMEM培养基，90mL/孔，并加入不同浓度待测药物溶液，10mL/孔，每个浓度设3个复孔；空白孔加入DMEM培养基10mL/孔；本底孔加入不含细胞的培养基100mL/孔。
步骤1.2：置37℃，5％CO2孵育48小时。
步骤1.3：每孔加入100uLMTT溶液(0.5mg/mL,不完全DMEM培养基配制)，继续置培养箱孵育4小时。
步骤1.4：4小时后终止培养，弃去上清，每孔加入150mL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡5min，使结晶物充分溶解。
步骤1.5：在酶联免疫检测仪570nm处测量各孔的吸光值。
6.实验结果：本发明蓝萼甲素小分子探针对人肝癌HepG2细胞、人宫颈癌Hela细胞生长抑制作用如下表所示：
表1：本发明蓝萼甲素小分子探针对癌瘤细胞株增殖抑制结果
Figure BDA0002368935940000131
Figure BDA0002368935940000141
7.实验结果表明：本发明所得蓝萼甲素小分子探针对人肝癌HepG2细胞株部分显示显著的细胞增殖抑制活性。
8.结论：本发明制备所得蓝萼甲素小分子探针具有抗癌药物的应用前景，可以应用于蓝萼甲素“钓取”靶点及其作用机制的研究。
上述内容为本发明的具体实施例的例举，对于其中未详尽表述的试剂、设备、操作方法等，应当理解为采取本领域已有的普通及常规试剂、设备、操作方法等来予以实施。

Claims (5)

1.一种蓝萼甲素衍生物的小分子探针，其特征在于，具有通式I所示结构：
Figure FDA0002368935930000011
n＝1,2,3；R＝H，OH。
2.如权利要求1所述的蓝萼甲素衍生物的小分子探针，其特征在于，选自如下化合物：
Figure FDA0002368935930000012
3.制备如权利要求1所述的蓝萼甲素小分子探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：
Figure FDA0002368935930000013
n＝1,2,3；R＝H，OH；
(1)将蓝萼甲素与具有式1结构的炔丙基取代苯甲醛类化合物溶于有机溶剂中，搅拌使之溶解，然后再滴加浓硫酸，室温反应，反应结束后，萃取，有机相经洗涤后，干燥，过滤，减压浓缩；粗产品经硅胶柱层析纯化，经洗脱剂洗脱，得蓝萼甲素末端炔基的缩醛衍生物3；
(2)将蓝萼甲素末端炔基的缩醛衍生物3与具有式4结构的生物素报告基团(biotin-PEG-N3)溶于有机溶剂，搅拌使全部溶解后，冰浴条件下反应，再加入催化剂反应，撤走冰水浴，继续室温条件下反应；反应结束后萃取，有机相经洗涤，干燥，过滤之后旋干减压浓缩，柱层析分离纯化，洗脱，得目标物；
步骤(1)、(2)中，所述有机溶剂为THF、CH2Cl2、DMF、DMSO中的一种；
步骤(2)中，所述催化剂采用如下方法配制而成：无水硫酸铜粉末用水溶解，L-抗坏血酸钠用水溶解，BPDS(水合红菲绕啉二磺酸钠)用水/DMF溶解，将前两者混合均匀，取一半量加入BPDS中混匀。
4.合成通式I蓝萼甲素小分子探针的中间体biotin-PEG-N3生物素报告基团的方法，其特征在于，通过如下方法实现：
Figure FDA0002368935930000021
(1)聚乙二醇与对甲苯磺酰氯或甲磺酰氯溶于有机溶剂，冰浴，碱性条件发生取代反应，反应结束后有机溶剂萃取，干燥、过滤、浓缩得到两端磺酰基取代中间体1；所述碱选用氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钾、碳酸钠、吡啶、三乙胺、DMAP、二异丙基乙胺、N-甲基吗啉中的一种或几种；所述有机溶剂选N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、二氯甲烷、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、石油醚、二氧六环、乙醇中的一种或几种；
(2)中间体1与叠氮钠溶于有机溶剂，加热发生取代反应，反应结束后用有机溶剂萃取，干燥、过滤、浓缩得到化合物2；
所述有机溶剂选N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、二氯甲烷、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、石油醚、二氧六环、乙醇中的一种或几种；
(3)化合物2与还原剂溶于有机溶剂，酸性条件，惰性气体气氛下发生还原反应；反应结束后，用有机溶剂萃取，干燥、过滤、浓缩得到化合物3；所述还原剂选自三苯基磷、氢气/钯碳、硼氢化钠、四丁基硼氢化铵、氢化铝锂、二甲氨基硼烷中的一种或者几种；
(4)化合物3与生物素biotin溶于有机溶剂，室温反应过夜，旋干溶剂，柱层析得到化合物4；所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜、二氯甲烷、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、石油醚、二氧六环、乙醚、乙醇中的一种或两种。
5.权利要求1或2所述的蓝萼甲素分子探针的应用，其特征在于，将其作为抗肿瘤药物蓝萼甲素的分子探针。
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